Informacije

9.12C: RNA onkogeni virusi - biologija

9.12C: RNA onkogeni virusi - biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Procjenjuje se da se 15% svih karcinoma ljudi u svijetu može pripisati virusima.

Ciljevi učenja

  • Klasificirajte viruse sa onkogenim svojstvima

Ključne točke

  • Pokazalo se da su i DNK i RNK virusi sposobni da izazovu rak kod ljudi.
  • Humani T limfotrofni virus tipa 1 i virus hepatitisa C su dva RNK virusa koji doprinose nastanku raka kod ljudi.
  • Virus hepatitisa C je RNA virus sa omotačem koji može izazvati akutni i kronični hepatitis kod ljudi inficiranjem ćelija jetre. Procjenjuje se da su 3% svjetske populacije nosioci. Hronična infekcija virusom hepatitisa C dovodi do ciroze, što zauzvrat može dovesti do raka jetre.

Ključni uslovi

  • onkogeni: Sklonost stvaranju tumora.
  • hepatocelularni: Od ili se odnosi na ćelije jetre

Postoje dvije klase virusa raka: DNK i RNK virusi. Nekoliko virusa je povezano s određenim vrstama raka kod ljudi. Ovi virusi imaju različite načine razmnožavanja i predstavljaju nekoliko različitih porodica virusa. Konkretno, RNA virusi imaju RNK kao svoj genetski materijal i mogu biti jednolančana RNK (ssRNA) ili dvolančana (dsRNA). RNK virusi su klasifikovani na osnovu sistema klasifikacije Baltimorea i ne uzimaju u obzir viruse sa DNK intermedijerima u svom životnom ciklusu. Virusi koji sadrže RNK za svoj genetski materijal, ali uključuju DNK intermedijere u svom životnom ciklusu nazivaju se „retrovirusi. Postoje brojni RNA onkogeni virusi koji su povezani s različitim tipovima raka. Ovi različiti onkogeni virusi uključuju:

1. Humani T limfotrofni virus tipa 1 (HTLV-I), retrovirus, povezan je s leukemijom T-ćelija. 2. Virus hepatitisa C je povezan sa rakom jetre kod ljudi sa hroničnim infekcijama.

2. Virusi hepatitisa uključuju hepatitis B i hepatitis C su povezani sa hepatocelularnim karcinomom.

3. Humani papiloma virusi (HPV) su povezani sa rakom grlića materice, anusa, penisa, vagine/vulve i nekim karcinomom glave i vrata.

4. Herpesvirus povezan s Kaposijevim sarkomom (HHV-8) povezan je s Kaposijevim sarkomom i primarnim efuzijskim limfomom.

5. Epstein-Barr virus (EBV) je povezan s Burkittovim limfomom, Hodgkinovim limfomom, limfoproliferativnom bolešću nakon transplantacije i karcinomom nazofarinksa.

RNA retrovirusi

Retrovirusi se razlikuju od DNK tumorskih virusa po tome što je njihov genom RNA, ali su slični mnogim DNK tumorskim virusima po tome što je genom integriran u genom domaćina. Budući da RNK čini genom zrele virusne čestice, ona se mora kopirati u DNK prije integracije u hromozom ćelije domaćina. Ovaj način života je protiv centralne dogme molekularne biologije u kojoj se ta DNK kopira u RNK. Spoljni omotač dolazi od plazma membrane ćelije domaćina. Proteini omotača (površinski antigeni) kodirani su genom env (omotača) i glikozilirani su. Nastaje jedan primarni genski proizvod, ali se on cijepa tako da postoji više od jednog površinskog glikoproteina u zrelom virusu (cijepanje je putem enzima domaćina u Golgijevom aparatu). Primarni protein (prije cijepanja) je napravljen na ribosomima vezanim za endoplazmatski retikulum i predstavlja transmembranski (tip 1) protein. Unutar membrane je ikosaedarski kapsid koji sadrži proteine ​​kodirane genom gag (antiGen specifičan za grupu). Gag-kodirani proteini također oblažu genomsku RNK. Opet, postoji jedan primarni genski proizvod. Ovo se cijepa virusno kodiranom proteazom (iz gena pol). Postoje dva molekula genomske RNK po virusnoj čestici sa 5′ kapom i 3′ poli A sekvencom. Dakle, virus je diploidan. RNK je plus čulo (isti smisao kao mRNA). Unutar zrelog virusa prisutno je oko 10 kopija reverzne transkriptaze, koje su kodirane pol genom. Pol gen kodira za nekoliko funkcija (opet, kao kod gag i env, pravi se poliprotein koji se zatim seče).


Onkogeni virus potiče opstanak ćelije i ćelijsku transformaciju suzbijanjem glikolize

Aerobna glikoliza je neophodna za podržavanje brzog rasta raznih vrsta raka. Međutim, njegova uloga u preživljavanju ćelija raka u uslovima stresa je nejasna. Ranije smo izvijestili o efikasnom modelu ćelijske transformacije primarnih mezenhimalnih matičnih stanica štakora izazvane gamaherpesvirusom Kaposijevim sarkomom povezanim s herpesvirusom (KSHV). KSHV-transformirane ćelije efikasno induciraju tumore kod golih miševa s patološkim karakteristikama koje podsjećaju na tumore Kaposijevog sarkoma. Ovdje izvještavamo da KSHV potiče preživljavanje stanica i ćelijsku transformaciju suzbijanjem aerobne glikolize i oksidativne fosforilacije pod stresom nutrijenata. Konkretno, mikroRNA KSHV i vFLIP suzbijaju glikolizu aktiviranjem NF-κB puta za smanjenje prijenosa glukoze GLUT1 i GLUT3. Dok prekomjerna ekspresija transportera spašava glikolitičku aktivnost, ona inducira apoptozu i smanjuje efikasnost formiranja kolonija u softagaru pod deprivacijom glukoze. Mehanički, GLUT1 i GLUT3 inhibiraju konstitutivnu aktivaciju AKT i NF-κB puteva za preživljavanje. Zapanjujuće je da su GLUT1 i GLUT3 značajno smanjeni u ćelijama inficiranim KSHV u humanim KS tumorima. Nadalje, otkrili smo smanjene razine aerobne glikolize u nekoliko KSHV-inficiranih ćelijskih linija primarnog efuzionog limfoma u usporedbi s ćelijskom linijom Burkittovog limfoma BJAB, a KSHV infekcija BJAB stanica smanjila je aerobnu glikolizu. Ovi rezultati otkrivaju novi mehanizam kojim onkogeni virus reguliše ključni metabolički put da se prilagodi stresu u mikrookruženju tumora i ilustruju važnost finog podešavanja metaboličkih puteva za održavanje proliferacije i preživljavanja ćelija raka, posebno u uslovima stresa.


Luc Montagnier

Rođen sam 18. avgusta 1932. u Chabrisu, “bourg”, većem od sela, ali manjim od grada, smještenom u Berryju južno od doline Loire. Ovo je bila – i još uvijek je – regija poljoprivrede s nekim poznatim proizvodima kao što su velški zec, kozji sirevi i bijele šparoge. To je bilo mjesto gdje je moja majka odrasla, ali ja, u stvari, nikada tamo nisam živio.

Sa strane mog oca, njegovi roditelji su došli iz Auvergnea, provincije u centru Francuske, sačinjene od bogatih ravnica i starih vulkana, od kojih je vjerovatno porijeklo mog porodičnog prezimena: Montagnier, čovjek koji živi u planinama.

U mladosti, moj otac je dobio užasnu bolest: streptokokni artritis, koji se završavao nepovratnim lezijama na aortnim zaliscima. Zbog toga je proglašen nesposobnim za vojnu službu i morao je da nađe sedeći posao: postao je računovođa i istakao se u ovoj profesiji, koja je u to vreme podrazumevala uglavnom pisani rad. Počeo je raditi u oblasti Poitiersa, a zatim se preselio malo sjevernije u Châtellerault, mali grad između Toursa i Poitiersa.

Kao jedinac, njegovala me je majka domaćica, ali su u ovom predratnom periodu dominirala dva događaja, kojih se živo sjećam:

Teško me je povrijedio brzi automobil dok sam prelazio glavnu cestu: višestruke rane od kojih su mi ostali vidljivi ožiljci. Nakon dva dana u komi, sa 5 godina sam izašao kao da sam ponovo rođen (Slika 1).

Slika 1. Luc Montagnier sa 5 godina.

… a dvije godine kasnije uslijedila je objava rata 1939. godine, dok je cijela porodica brala grožđe u vinogradima brata moje majke. Još se sećam slika u novinama varšavskih ruševina nakon bombardovanja nemačkih aviona.

A onda, 1940., došao je “stvarni” rat: njemačka invazija, moji roditelji i ja napuštamo njihovu kuću (blizu rizične željezničke stanice), bježimo po cestama u malom autu i konačno više izloženi njemačkom bombardovanje tokom ovog “egzodusa” nego da smo ostali kod kuće.

Prva godina njemačke okupacije bila je užasna, jer nismo imali zalihe hrane i većinu vremena smo gladovali. Bio sam prilično slab dječak i za četiri godine rata nisam dobio ni grama! “ersatz” mi nije podstakao apetit, kada sam sanjao čokoladu i pomorandže! Moj otac je imao hronični enterokolitis i, što je još gore, mom djedu (njegovom ocu) dijagnosticiran je rak rektuma. Umro je 1947. nakon strašne patnje i svaki put kada sam ga posjetio, mogao sam vidjeti neumoljivo napredovanje bolesti. To me je toliko pogodilo da je to vjerovatno jedan od razloga zašto sam kasnije odlučio da studiram medicinu i da počnem istraživati ​​rak.

U junu 1944. naša kuća (tako blizu željezničke pruge) je djelimično uništena – ovoga puta savezničkim bombardiranjem. Imam pomiješan osjećaj ove godine oslobođenja Francuske. Bilo je to veliko olakšanje, ali nisam mogao zaboraviti ni viziju tolikih mrtvih ljudi, civila i vojnika, te slike mršavih deportiranih puštenih iz koncentracionih logora. Mrzeću ratove i njihova zverstva do kraja života.

U srednjoj školi sam išla dobro, obično sam bila ispred svojih drugova iz razreda. Tada sam postao znatiželjan za naučna saznanja, ostavivši iza sebe svoje vjersko katoličko uvjerenje.

Po uzoru na mog oca, koji je u slobodno vrijeme petljao po električnim baterijama, u podrumu nove kuće postavio sam hemijsku laboratoriju koja je rekvirirana za naš smještaj. Tamo sam s entuzijazmom proizvodio vodonik, mirisne aldehide i nitro spojeve (ne nitro-glicerin!) koji su imali nesretnu naviku da mi eksplodiraju u lice.

Sa zadovoljstvom sam pročitao – u popularnim knjigama – impresivan napredak fizike, posebno atomske fizike. Budući da sam dobar u fizici i hemiji – ali ne tako dobar u matematici – odlučio sam da se ne pripremam za takmičenje za “Grandes Ecoles”, već da se registrujem i na Medicinskom fakultetu i Fakultetu nauka u Poitiersu. Moj cilj je zapravo bio da započnem istraživački rad u ljudskoj biologiji, ali u Poitiersu nije postojao takav specijalitet, ni u medicini ni u nauci. Pošto su i fakultet i škola bili na pješačkoj udaljenosti, jutro sam mogao provesti u bolnici, a poslijepodne pohađajući kurseve iz botanike, zoologije i geologije, koji su bili glavne discipline studijskog kursa prirodnih nauka.

Na sreću, novi profesor botanike, Pierre Gavaudan, bio je vrlo netipičan profesor po tome što su njegova naučna interesovanja išla daleko dalje od klasifikacije biljaka. Zapravo, dugujem mu što mi je otvorio veliki prozor na ono što je bio početak nove biologije, dvostruku spiralu DNK, in vitro sinteza proteina ribosomima i struktura virusa.

Istovremeno sam kod kuće instalirao uređaj koji kombinuje time-lapse filmsku kameru i mikroskop, zahvaljujući poklonu mog oca. To mi je omogućilo da obavim svoj prvi istraživački rad. Proučavao sam fenomen poznat od 1908. kao fototaksija hloroplasta: svojstvo nekih algi koje žive na površini bara da orijentiraju svoj veliki jedinstveni hloroplast prema intenzitetu svjetlosti ako je svjetlost bila previše intenzivna, kloroplast se okreće unutar cjevaste cijevi. ćelija da predstavi svoju ivicu. Na tamnom ili slabijem svjetlu, hloroplast, ravna ploča, otkriva svoju veću površinu. Fenomen je trajao nekoliko minuta, što se moglo analizirati time-lapse kinematografijom. Koristeći različite staklene filtere, mogao sam pokazati da nije talasna dužina koju apsorbuje hlorofil (crveno svjetlo) ono što regulira orijentaciju hloroplasta, već indirektno neki žućkasti pigmenti koji apsorbiraju plavo svjetlo. Bio sam veoma ponosan, sa 21 godinom, što sam odbranio ovaj rad kao malu tezu na Fakultetu nauka u Poatjeu. Moj mentor, Pierre Gavaudan, zamolio me je da istražim i temu zasnovanu na literaturi: L-oblici bakterija. To mi je omogućilo da napravim svoj prvi upad – ne i posljednji – u svijet filtriranja bakterija. Reference o ovoj kontroverznoj temi mogao sam pronaći samo u biblioteci Instituta Pasteur u Parizu. To je zaista bilo vrijeme kada sam otišao iz Poitiersa u Pariz, gdje sam mogao završiti studije medicine, kao i istražiti neke aspekte biologije bliže ljudskim bićima, posebno neurofiziologiju, virologiju i onkologiju.

Pošto sam bio angažovan kao asistent na Sorboni sa 23 godine, počeo sam da učim staromodne tehnologije proistekle iz rada Alexis Carrel na srčanim kulturama pilećih embriona, kao i ljudskih ćelijskih linija u monoslojevima. Iako moje istraživanje nije bilo nimalo produktivno, iz tog perioda čuvam solidnu ekspertizu Pasterovih tehnologija za rad u savršeno sterilnim uslovima bez upotrebe antibiotika.

Godine 1957. prvi opis infektivne virusne RNK iz virusa mozaika duhana od strane Fraenkel-Conrata i Gierera i Schramma odredio je moj poziv: da postanem virolog koristeći moderni pristup molekularne biologije.

Počeo sam s virusom slinavke i šapa, a zatim, u Kingsley Sanders’ laboratoriji u Carshaltonu blizu Londona, bio sam ponosan što sam po prvi put identificirao infektivnu dvolančanu RNK iz ćelija zaraženih virusom mišjeg encefalomiokarditisa, malog jednostrukog nasukani RNA virus. Ovo je po prvi put pokazalo da se RNK može replicirati poput DNK stvaranjem komplementarnog lanca uparenog bazama.

Kako bih usavršio svoje znanje o onkogenim virusima, preselio sam se iz Carshaltona u Glasgow gdje je nedavno otvoren novi Institut za virusologiju, na čijem je čelu bio izuzetan virolog, Michael Stocker, i gdje su bili mnogi visoki posjetioci, među kojima je i Renato Dulbecco. provodeći subotnje godine.

Radeći na malom onkogenom DNK virusu, poliomu, mogao sam da pokažem, sa I. Macphersonom, novo svojstvo transformisanih ćelija, da rastu u mekom agaru. Koristeći ovu tehniku, bilo je lako otkriti transformacijski kapacitet virusa polioma i njegove DNK. Pokazali smo da gola DNK sama nosi sav onkogeni potencijal virusa. Ovo sada izgleda prilično očigledno, ali u to vrijeme nije bilo tako.

Vrativši se u Francusku na Institut Curie, proširio sam ovo otkriće na brojne ćelije raka, transformisane ili ne transformisanim onkogenim RNK ili DNK virusima. Međutim, ovo svojstvo mi je omogućilo da razlikujem neke in vitro korake u procesu transformacije, koji su bili u korelaciji s nekim modifikacijama plazma membrane i sloja ugljikohidrata koji je okružuje.

U to vrijeme ostala je velika misterija: replikacija onkogenih RNK ​​virusa, danas poznatih kao retrovirusi. Howard Temin (Slika 2) je predložio hipotezu o DNK intermedijeru, ali bi se mogle razmotriti i druge mogućnosti. I sam sam pokušao pronaći dvolančanu RNK specifičnu za Rousov sarkom virus, virus koji može inficirati i transformirati stanice pilećih embriona. Ja sam zaista izolovao dvolančane RNK sekvence, ali one su bile ćelijskog porekla i postojale su na istom nivou u neinficiranim ćelijama! Sa Louise Harel, kasnije sam pokazao da ova RNK dijelom dolazi iz ponavljajućih sekvenci DNK. Retrospektivno, mogao bi barem djelomično predstavljati nedavno identificirane interferirajuće RNK uključene u negativnu kontrolu translacije RNK glasnika.

Slika 2. Prijem nagradne ploče Američkog društva za patologiju iz ruku Howarda Temina 1985. godine.

Godine 1969-70, izolacija RNA-polimeraze povezane s virusnim česticama virusa vezikularnog stomatitisa dovela je do ideje da je možda ključni enzim također povezan s onkogenim RNA virusima. Zaista, Howard Temin i Mizutani, i nezavisno David Baltimore, otkrili su 1970. godine specifičan enzim povezan s virusom Rous sarkoma (RSV), reverznu transkriptazu (RT), sposoban za reverznu transkripciju virusne RNK u DNK.

Otprilike u isto vrijeme, Hill i Hillova u Villejuifu, Francuska, pokazali su da je DNK ekstrahirana iz RSV transformiranih stanica infektivna i da nosi genetske informacije virusne RNK, potvrđujući da enzim vjerno radi u inficiranim stanicama.

Ja sam, sa P. Vigierom, potvrdio i proširio ovo otkriće pokazujući da je infektivna DNK povezana sa hromozomskom DNK ćelija, pokazujući integraciju provirusne DNK, kao što je ranije pretpostavio Temin.

Rad na kokošjem RSV-u proširen je na slične viruse kod sisara, tako da su mnogi istraživači u to vrijeme vjerovali da je RT aktivnost novo, vrlo osjetljivo sredstvo za otkrivanje sličnih virusa kod leukemije i raka kod ljudi. Ovo je potaknuto velikodušno finansiranim programom borbe protiv virusa raka koji su pokrenuli američki nacionalni instituti za zdravlje. Nažalost, lov na ljudske retroviruse u osnovi je bio neuspješan, ali je doveo do važnog osnovnog rada na molekularnoj biologiji životinjskih retrovirusa.

Godine 1972. Jacques Monod, tada šef Instituta Pasteur, zamolio me je da stvorim istraživačku jedinicu u novostvorenom Odsjeku za virusologiju Instituta. Prihvatio sam i ova nova laboratorija mi je omogućila da razvijem nove puteve istraživanja u okviru opće teme virusne onkologije, a krajnji cilj ostaje otkrivanje virusa koji su uključeni u karcinom kod ljudi.

Tako sam se zainteresovao za mehanizam djelovanja interferona i njegovu ulogu u ekspresiji retrovirusa. Došao sam u ovu oblast nakon što sam demonstrirao biološku aktivnost interferonske glasničke RNK u saradnji sa dva svetski poznata stručnjaka u ovoj oblasti, Edwardom i Jacqueline De Maeyer.

Od 1973. godine, Ara Hovanessian i njegovi saradnici pridružili su se mojoj jedinici i doneli novu dimenziju: složeni biohemijski mehanizam koji održava antivirusnu aktivnost ove izuzetne grupe ćelijskih proteina.

Godine 1975., još dva istraživača su se pridružila mojoj jedinici i donijela svoju ekspertizu o mišjim retrovirusima: J. C. Chermann i njegova suradnica, Françoise Barré-Sinoussi (slika 3). Potonji su posebno savladali detekciju retrovirusa po njihovoj RT aktivnosti. Uvjerio sam ih da učestvuju u zajedničkoj studiji unutar jedinice kako bi ponovo potražili retroviruse u ljudskim karcinomima. Počeli smo 1977. godine sa uzorcima krvi iz različitih pariških bolnica i uzorcima biopsije.

Slika 3. Otkrivači HIV-a u parku Instituta Pasteur Annex u Garchesu, blizu Pariza, tokom pauze � sastanka straže” 1987. S lijeva na desno: Jonas Salk, Jean-Claude Gluckman, Jean-Claude Chermann, Luc Montagnier, Robert Gallo, Françoise Barré-Sinoussi, Willy Rozenbaum, Charles Mérieux.

Dva napretka ostvarena u drugim laboratorijama su pojačala ovu pretragu:

U Villejuifu, Francuska, Ion Gresser je pripremio moćan antiserum koji neutrališe bilo koji molekul alfa endogenog interferona koji proizvode pojedinačne ćelije.Shvatili smo da je ovaj interferon proizveden od strane mišjih stanica koje su inducirane da eksprimiraju neke od svojih endogenih retrovirusa. Njegova blokada antiserumom povećala je do 50 puta proizvodnju endogenih retrovirusa u mediju kulture. Mogli bismo zaključiti da, uprkos činjenici da su endogeni retrovirusi integrisani u genom kralježnjaka milionima godina, njihova ekspresija je i dalje kontrolisana interferonskim sistemom, poput egzogenih virusa.

Otprilike u istom periodu, otkriće Denisa Morgana i Franka Ruscettija u laboratoriji dr. Galloa faktora rasta koji omogućava in vitro umnožavanje humanih T limfocita (TCGF, ​​tada nazvanih interleukin 2, Il2) omogućilo je razmnožavanje T limfocita u trajnim kulturama.

Tada smo znali da se neki retrovirusi uključeni u formiranje tumora dojke kod miša (MMTV) ne mogu eksprimirati samo u tumorskim stanicama već iu cirkulirajućim limfocitima.

Koristeći ova dva napretka, započeli smo potragu za retrovirusima u ljudskim karcinomima. Koristeći anti-interferon serum i Il2, posebno smo se fokusirali na kulture T limfocita pacijenata oboljelih od raka dojke.

Zaista, 1980. godine uspjeli smo otkriti sekvencu DNK blisku tom MMTV-u, ne samo u ćelijama upalnog karcinoma dojke (od žene iz Sjeverne Afrike), već iu njenim kultiviranim T limfocitima. Drugi pacijent je pokazao slične rezultate.

Nažalost, molekularni alati koje smo imali u to vrijeme nisu nam mogli reći da li imamo posla s endogenim retrovirusnim sekvencama ili s egzogenim virusom. Danas, s pristupom moćnijim tehnologijama, planiram ponovo pokrenuti ove studije.

Ali 1983. isti pristup, upotreba anti-interferonskog seruma i upotreba dugotrajnih kultura T limfocita uvelike su olakšali izolaciju HIV-a.

Moje učešće u AIDS-u počelo je 1982. godine, kada je kružila informacija da bi prijenosni agens – vjerovatno virus – mogao biti izvor ove nove misteriozne bolesti. U to vrijeme bilo je samo nekoliko slučajeva u Francuskoj, ali su privukli interesovanje grupe mladih kliničara i imunologa. Tražili su virologe, posebno retrovirusologe, jer je vjerovatna hipoteza bila da bi HTLV – jedini do sada poznati ljudski retrovirus, koji je nedavno opisao R. C. Gallo – mogao biti uključen. Retrovirus koji uzrokuje leukemiju kod glodara često uzrokuje i sindrom iscrpljivanja, koji može biti rezultat sekundarne imunološke depresije. To je bio i slučaj pacijenata koji boluju od leukemije izazvane HTLV.

Članica radne grupe, Françoise Brun-Vézinet, bila je bivša studentica kursa virologije koji sam tada vodio. Pozvala me je da organiziram potragu za navodnim retrovirusom kod pacijenta koji ima rani znak bolesti, limfodenopatiju. Pacijent je bio mladi gej muškarac koji je putovao u SAD i koji je konsultovao dr. Willyja Rozenbauma – jednog od vođa radne grupe – zbog otečenog limfnog čvora na vratu.

Obrazloženje je bilo da ako pronađemo virus u ovoj ranoj fazi bolesti, on bi mogao biti više uzrok nego posljedica imunološke depresije.

Još jedan poticaj za pokretanje ovog istraživanja bio je zahtjev proizvođača vakcine protiv hepatitisa B u industrijskoj podružnici Instituta Pasteur. Koristili su plazmu američkih davalaca krvi i bili su zabrinuti zbog rizika od prenošenja agensa AIDS-a kroz postupak pročišćavanja virusnog antigena.

Biopsija limfnih čvorova stigla je 3. januara 1983. godine, datuma kojeg se dobro sjećam jer je to bio i prvi dan kursa virologije na Institutu Pasteur, koji sam morao uvesti. Mogao sam samo secirati mali tvrdi komad na kraju dana. Odvojio sam limfocite pomoću Dounce staklenog homogenizatora i započeo njihovu stimulaciju u kulturi bakterijskim mitogenom, proteinom A, poznatim kao aktivator B i T limfocita, pošto nisam znao koja frakcija limfocita može proizvesti navodni virus. Tri dana kasnije, dodao sam faktor rasta T ćelija koji sam dobio od kolege koji radi u laboratoriji Jean Dausseta.

T ćelije su dobro rasle. Kao što je ranije utvrđeno u protokolu za pretragu retrovirusa kod karcinoma ljudi, odlučeno je sa mojim saradnicima, Françoise Barré-Sinoussi i Jean-Claude Chermann, da mjerimo RT aktivnost u mediju kulture svaka 3 dana. Petnaestog dana, Françoise mi je pokazala nagovještaj pozitivnosti (ugradnja radioaktivnog timidina u polimernu DNK), što je potvrđeno sljedeće sedmice.

Imali smo dokaz o retrovirusu, ali ovo je bio samo početak niza pitanja:
• Je li bio blizu HTLV-a ili ne?
• Da li je to bio putnički virus ili, naprotiv, pravi uzrok bolesti?

Da bismo odgovorili na ova osnovna pitanja, morali smo biohemijski i imunološki okarakterizirati virus, a da bismo to učinili, morali smo ga razmnožavati u dovoljnim količinama. Na sreću, virus bi se lako mogao razmnožavati na aktiviranim T limfocitima odraslih davalaca krvi. Kod ovog prvog izolata nije uočen nikakav citopatski efekat, ali za razliku od kultura inficiranih HTLV-om, iz kultura nisu mogle izaći transformirane imortalizirane ćelijske linije, koje su uvijek umrle nakon 3-4 sedmice kao i normalni limfociti.

Nasuprot tome, naknadni izolati koje sam napravio iz kulture limfocita bolesnih pacijenata sa AIDS-om bili su citopatski za kulturu T limfocita i – što smo kasnije otkrili – mogli su se uzgajati u većim količinama u tumorskim ćelijskim linijama koje potiču od leukemije.

Ubrzo nakon izolacije virusa, moji saradnici i ja smo uspjeli pokazati da on nije imunološki povezan s HTLV-om, a u elektronskoj mikroskopiji se jako razlikovao od HTLV virusnih čestica. Zapravo, već u junu 1983. primijetio sam kvazi-identitet našeg virusa s objavljenim elektronskim mikroskopskim slikama virusa Visna kod ovaca, virusa zarazne anemije kod konja i virusa goveđeg limfocita: bio je to retrolentivirus, sub. -porodica virusa koji izazivaju dugotrajnu bolest kod životinja bez imunodeficijencije.

Ovo je jasno ukazivalo na to da imamo posla s virusom koji se veoma razlikuje od HTLV-a, a moj zadatak je sada bio da organiziram tim istraživača koji će prikupiti dokaze da je ovaj novi virus zaista uzrok AIDS-a.

Bio je to uzbudljiv period, jer su svake subote ujutro, kada smo imali sastanak u mojoj kancelariji, moji saradnici donosili nove podatke koji su govorili o uzročnoj ulozi virusa. Izolati virusa nazvani su LAV, za virus povezan sa limfadenopatijom, kada je izolovan od pacijenata sa otečenim limfnim čvorovima, što je čest znak rane faze infekcije. Izolati napravljeni od pacijenata sa potpuno razvijenom AIDS-om nazvani su virusi povezani s imunodeficijencijom (IDAV). Potonje je općenito bolje raslo u kulturi T limfocita i izazvalo stvaranje velikih sincicija, koje su rezultat fuzije između nekoliko inficiranih stanica. Neki od njih – saznali smo kasnije – mogu se razmnožavati i u kontinuiranim ćelijskim linijama B ili T ćelijskog porijekla. Ovo posljednje svojstvo uvelike je olakšalo masovnu proizvodnju virusa za komercijalnu upotrebu.

Do septembra 1983. uspio sam napraviti sintetiziranu prezentaciju svih naših podataka koji favoriziraju uzročnu vezu između virusa i bolesti na sastanku o HTLV-u koji su organizirali L. Gross i R. Gallo u Cold Spring Harboru.

Ovu prezentaciju je malobrojna publika primila sa skepticizmom (bila je to kasnovečernja sesija), a HTLV teorija je i dalje prevladavala. Mentalno, većina polaznika nije bila spremna prihvatiti ideju o drugoj porodici retrovirusa (lentiretrovirusa) koja postoji kod ljudi i uzrokuje imunološki nedostatak, a nema pandan kod životinja!

Ova situacija nije rijetka u nauci, jer nova otkrića često izazivaju kontroverze. Jedini problem je što je to bilo pitanje života i smrti za transfuzirane osobe i hemofiličare, budući da je serološki test krvi koji koristi naš antigen virusa već radio u laboratorijskim razmjerima, ali je čekao industrijski i komercijalni razvoj.

To se dogodilo 1985. godine, nakon što su dva druga tima istraživača, prvi onaj dr. Galloa iz NIH-a početkom 1984. i onaj Jay Levyja u San Franciscu, potvrdili i proširili naše nalaze. Konkretno, dr. Gallo i njegovi saradnici dali su više snage korelaciji između virusa i bolesti, poboljšali detekciju odgovora antitijela i uspjeli su uzgajati nekoliko virusnih sojeva, uključujući i naš, u T ćelijskim linijama porijekla raka. U međuvremenu, moji saradnici su pokazali tropizam virusa za CD4T ćelije i identifikovali CD4 površinski molekul kao glavni receptor za virus.

Ostatak priče opisan je u sljedećem poglavlju. Želeo bih samo da ilustrujem kako sam otkrio ono što verujem da su dva važna fenomena za objašnjenje razaranja imunog sistema izazvanog HIV-om.

Tokom latentne faze infekcije, virus se ne nalazi u krvi. Uglavnom je lokaliziran u limfocitima limfnog tkiva, a ipak smo otkrili da je većina limfocita prisutnih u krvi bolesna! Godine 1987. mladi posjetilac iz Švedske, Jan Alberts, došao je u moju laboratoriju. Želio je uzgajati ljudske limfocite u sintetičkom mediju bez seruma i naučiti neke tehnologije o HIV kulturi. Iznenađenje je došlo kada smo uporedili održivost limfocita u njegovom medijumu od zdravih donatora i onih pacijenata zaraženih HIV-om, čak iu ranoj asimptomatskoj fazi infekcije. Dok su prvi mogli preživjeti nekoliko dana bez smrti, većina (više od 50%) potonjih umrla je vrlo brzo. Dodatak interleukina 2 djelimično je spriječio njihovu smrt.

Kada smo koristili normalnu podlogu za kulturu dopunjenu fetalnim telećim serumom, uočena je ista razlika, iako je vrijeme preživljavanja limfocita inficiranih pacijenata bilo duže.

Nije prošlo mnogo vremena prije nego što su trojica mojih saradnika pronašli razlog za takve smrti: apoptozu. Ovo je aktivan proces kojim ćelija “odlučuje” umreti na čist način, bez ispuštanja previše toksičnih jedinjenja u medijum.

To je fiziološki način prevencije abnormalne proliferacije aktiviranih limfocitnih klonova, ali ovdje je fenomen bio ogroman i nije se odnosio samo na glavnu ćelijsku metu HIV infekcije, CD4+ T-limfocite, već i na ćelije koje virusom nije bilo inficirano, kao što su CD8+ T-limfociti, B-limfociti, monociti, prirodne stanice ubice … Jasno, to je bio opći fenomen, kultura je jednostavno otkrila predispoziciju za apoptozu većine cirkulirajućih krvnih stanica, iako većina njih nije bila inficirana . Zaista, moja saradnica Marie-Lise Gougeon našla je veoma dobar odnos između njih in vitro apoptoza i in vivo uočen pad CD4 T ćelija kod pacijenata.

Proveli smo dosta vremena pokušavajući da pronađemo porijeklo ove masivne apoptoze, a da nismo našli potpuno zadovoljavajuće objašnjenje: najvjerovatnije je intenzivan oksidativni stres koji postoji kod pacijenata od početka njihove infekcije. Ovo je također otkriće na koje sam veoma ponosan: iako su istraživači AIDS-a potpuno previdjeli oksidativni stres – i još uvijek jeste – on će pogoršati pogrešnu aktivaciju imunološkog sistema na početku njegovog pada, a također će izazvati upalu. kroz proizvodnju citokina.

Naravno, postavlja se sljedeće pitanje: koji su faktori koji uzrokuju oksidativni stres: virusni proteini, fragmenti virusne DNK, koinfekcija sa mikoplazmama? Čak ni nakon 25 godina još uvijek ne znamo potpuni odgovor. Ali fenomen postoji i treba ga liječiti, dok većina kliničara za AIDS uopće ne brine o tome!

Tretman kombinovanom antiretrovirusnom terapijom je, bez sumnje, promijenio prognozu ove smrtonosne bolesti, sa smrtne kazne na gotovo “normalan” život. Međutim, virus je još uvijek tu, spreman da se umnoži kada se liječenje prekine, a nemaju svi pacijenti zaraženi HIV-om u zemljama u razvoju. A epidemije i dalje ubijaju 2-3 miliona ljudi svake godine. Stoga je apsolutno neophodno riješiti ove probleme. Osnovna istraživanja, kao i klinička istraživanja, moraju se nastaviti.

Osim toga, 1990-ih sam shvatio da istraživanja ne treba lokalizirati samo u bogatim laboratorijama razvijenih zemalja, već iu južnim zemljama gdje je mnogo pacijenata bolovalo od AIDS-a i mnogih drugih bolesti poput tuberkuloze i malarije.

Previše primjera je pokazalo da je saradnja između sjevernih i južnih istraživačkih laboratorija nejednaka, jer jug ​​daje uzorke seruma za analizu na sjeveru. Ovaj koncept “safari” je pogrešan. Sada ima mnogo mladih istraživača obučenih u sjevernim laboratorijama koji bi se željeli vratiti u svoje zemlje, ali su u tome spriječeni jer nedostaju laboratorije i adekvatne strukture. Štaviše, morate biti u regijama u kojima se bolest širi da biste shvatili koliko je stvarnost složena.

Zbog toga sam se pridružio bivšem generalnom direktoru UNESCO-a, Federiku Mayoru, u pokretanju fondacije za stvaranje centara za istraživanje i prevenciju u afričkim zemljama. Iako je zadatak bio težak, ovaj koncept je naišao na entuzijazam od strane kolega i doktora medicine, a naišao je i na podršku vlada, posebno u Obali Slonovače i Kamerunu.

Volio bih da bi na osnovu ovih pilot eksperimenata cijela mreža sličnih centara mogla pokriti sve zemlje svijeta u razvoju u kojima je stanovništvo teško pogođeno epidemijama.

Još jedna lekcija koju sam izvukao iz svog iskustva sa AIDS-om je slabljenje efekta oksidativnog stresa na imuni sistem i njegova pro-upalna uloga u mnogim kroničnim bolestima, kao što su Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest i reumatoidni artritis: vjerovatna posljedica kroničnih infekcija? Ili i posljedica i uzrok? Mnogo je pitanja koja se mogu riješiti samo napornim radom i inovativnim razmišljanjem. Nadam se da ću moći da nastavim i jedno i drugo.

Od Les Prix Nobel. Nobelove nagrade 2008, Urednik Karl Grandin, [Nobelova fondacija], Stokholm, 2009

Ova autobiografija/biografija je napisana u vrijeme dodjele i kasnije objavljena u seriji knjiga Les Prix Nobel/Nobelova predavanja/Nobelove nagrade. Informacije se ponekad ažuriraju dodatkom koji podnosi laureat.

Copyright © Nobelova fondacija 2008

Da citiram ovaj odjeljak
MLA stil: Luc Montagnier – Biografski. NobelPrize.org. Nobelova nagrada Outreach AB 2021. sri. 30. jun 2021. <https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2008/montagnier/biographical/>

Nauči više

Nobelove nagrade 2020

Dvanaest laureata nagrađeno je Nobelovom nagradom 2020. godine za dostignuća koja su donela najveću korist čovečanstvu.

Njihov rad i otkrića kreću se od formiranja crnih rupa i genetskih makaza do napora u borbi protiv gladi i razvoja novih formata aukcija.


Biolozi otkrivaju istoriju drevnih retrovirusa pre 33 miliona godina

Grupa naučnika na Bostonskom koledžu, Chestnut Hill, rekonstruirala je prirodnu povijest specifične loze retrovirusa — ERV-Fc — koja se široko rasprostirala prije između 33 i 15 miliona godina (oligocen i rani miocen).

Čestice retrovirusa koje pupaju iz ćelija placente rezus makakija. Kredit za sliku: Dorothy Feldman, preko aacrjournals.org.

Retrovirusi su bogati u prirodi i uključuju viruse ljudske imunodeficijencije (HIV-1 i HIV-2), humane viruse leukemije T-ćelija (HTLV-1 i -2) i dobro proučene onkogene retroviruse miševa i drugih modelnih organizama, među mnogi drugi.

Nalazi tima, objavljeni na internetu 8. marta 2016. u časopisu eLife, pokazuju da je drevna grupa retrovirusa poznata kao ERV-Fc zarazila pretke najmanje 28 vrsta sisara — uključujući mesoždere, glodare i primate — između 15 miliona i 33 miliona godina.

Raspodjela ERV-Fc retrovirusa među ovim drevnim sisavcima sugerira da su se virusi proširili na sve kontinente osim Antarktika i Australije, te da su skočili s jedne vrste na drugu više od 20 puta.

Studija također postavlja porijeklo ERV-Fc barem još od početka oligocena.

"Nažalost, virusi ne ostavljaju fosile za sobom, što znači da znamo vrlo malo o tome kako nastaju i evoluiraju", rekao je član tima, prof. Welkin Johnson, s Odsjeka za biologiju Bostonskog koledža.

“Tokom milijuna godina, međutim, virusne genetske sekvence akumuliraju se u DNK genomima živih organizama, uključujući ljude, i mogu poslužiti kao molekularni ‘fosili’ za istraživanje prirodne povijesti virusa i njihovih domaćina.”

Koristeći takve 'fosilne' ostatke, prof. Johnson i koautori pokušali su otkriti prirodnu povijest ERV-Fc.

Posebno su bili znatiželjni da znaju gdje i kada su ovi patogeni pronađeni u drevnom svijetu, koje vrste su zarazili i kako su se prilagodili svojim sisarskim domaćinima.

Da bi to učinili, prvo su izvršili iscrpnu pretragu baza podataka sekvenci genoma sisara za ERV-Fc lokuse, a zatim uporedili pronađene sekvence.

Za svaki genom sa dovoljnom ERV-Fc sekvencom, rekonstruisali su sekvence proteina koji predstavljaju virus koji je kolonizirao pretke te određene vrste.

Ove sekvence su zatim korištene da se zaključi prirodna istorija i evolucijski odnosi virusa povezanih s ERV-Fc.

"Genomi sisara sadrže stotine hiljada drevnih virusnih fosila sličnih ERV-Fc", rekli su naučnici.

“Budući rad mogao bi ih proučavati kako bismo poboljšali naše razumijevanje kada i zašto se novi virusi pojavljuju i kako dugotrajni kontakt s virusima utječe na evoluciju njihovih organizama domaćina.”

William E. Diehl et al. 2016. Praćenje prijenosa među vrstama i dugoročne evolucije drevnog retrovirusa korištenjem genoma modernih sisara. eLife 5: e12704 doi: 10.7554/eLife.12704


RNA-vezujući protein IGF2BP3 ciljanje onkogenih transkripata potiče proliferaciju hematopoetskih progenitora

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Palanichamy, J. u: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard podjednako su doprinijeli ovom radu.

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard podjednako su doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Contrerasa, J. u: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Fernanda, T. u: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Sterne-Weilera, T. u: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard podjednako su doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Katzman, S. u: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard podjednako su doprinijeli ovom radu.

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard podjednako su doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Basso, G. u: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Pigazzija, M. u: JCI | PubMed | Google Scholar | />

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

Pronađi članke Sanforda, J. u: JCI | PubMed | Google Scholar

1 Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

2 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i integrativnu fiziologiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

3 Odsjek za molekularnu, ćelijsku i razvojnu biologiju, UCSC, Santa Cruz, Kalifornija, SAD.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Teksas, SAD.

5 Odsjek za hemiju i biohemiju, UCLA, Los Angeles, Kalifornija, SAD.

6 Odsjek za zdravlje žena i djece SDB, Univerzitet u Padovi, Padova, Italija.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) i

8 Široki centar za istraživanje matičnih ćelija, UCLA, Los Anđeles, Kalifornija, SAD.

Adresa za korespondenciju: Dinesh S. Rao, Odsjek za patologiju i laboratorijsku medicinu, David Geffen School of Medicine na UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Angeles, California 90095, SAD. Telefon: 310.825.1675 E-mail: [email protected]

Napomena o autoru: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran i J.M. Howard su podjednako doprinijeli ovom radu.

Posttranskripcijska kontrola ekspresije gena je važna za definiranje normalnih i patoloških ćelijskih fenotipova. In vitro, nedavno se pokazalo da proteini koji vežu RNK (RBP) igraju važnu ulogu u posttranskripcijskoj regulaciji, međutim, doprinos RBP-a specifikaciji ćelije nije dobro shvaćen. Ovdje smo utvrdili da je RBP faktor rasta sličan insulinu 2 mRNA-vezujući protein 3 (IGF2BP3) specifično prekomjerno eksprimiran kod leukemije mješovite loze – preuređene (MLL-preuređene) B-akutne limfoblastne leukemije (B-ALL), koja predstavlja podtip ovog maligniteta povezanog s lošom prognozom i visokim rizikom od relapsa. IGF2BP3 je bio neophodan za preživljavanje B-ALL ćelijskih linija, jer je nokdaun dovelo do smanjene proliferacije i povećane apoptoze. Pojačana ekspresija IGF2BP3 dala je mišjim BM ćelijama snažnu prednost u preživljavanju, dovela do proliferacije hematopoetskih matičnih i progenitornih ćelija i iskrivila hematopoetski razvoj B ćelija/mijeloidne loze. Unakrsna imunoprecipitacija i visoko propusno sekvenciranje otkrili su transkriptom reguliran IGF2BP3, koji uključuje onkogene MYC i CDK6 kao direktne mete. IGF2BP3 regulirani transkripti putem ciljanih elemenata unutar 3′ neprevedenih regija (3′UTR), a pojačana ekspresija IGF2BP3 kod miševa rezultirala je pojačanom ekspresijom Myc i Cdk6 u BM. Naši podaci zajedno sugeriraju da ciljanje onkogenih transkripta posredovano IGF2BP3 može predstavljati kritični patogenetski mehanizam u MLL-rearanžiranom B-ALL-u i podržavati IGF2BP3 i njegove srodne partnere koji se vezuju za RNK kao potencijalne terapijske mete u ovoj bolesti.

Onkogeneza u ranim B ćelijskim progenitorima dovodi do B ćelijske akutne limfoblastne leukemije (B-ALL), najraširenije hematološke neoplazme kod djece i mladih odraslih (1). Većina slučajeva B-ALL pokazuje genetske promjene, uključujući ponavljajuće hromozomske preuređenje, koje doprinose heterogenosti uočenog kliničkog ponašanja (2). Konkretno, B-ALL sa hromozomskim preuređenjima leukemije mješovite loze (MLL) gen čini 5%-6% svih slučajeva B-ALL i povezan je sa lošom prognozom i rizikom od ranog relapsa nakon liječenja (3). MLL, koji kodira H3K4 metiltransferazu, igra ključnu ulogu u transkripcijskoj disregulaciji koja se javlja tokom leukemogeneze (3, 4). Prethodno demonstrirani ciljevi MLL-a uključuju gene kritične za preživljavanje i proliferaciju ćelija, kao npr BCL2, MYC, i CDK6 ( 5 – 7 ). Osim toga, poznato je da MLL reguliše hematopoezu, a njegova ekspresija korelira sa održavanjem samoobnavljanja i diferencijacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) (8, 9). U skladu s takvom ulogom u normalnoj funkciji HSC, MLL fuzioni proteini induciraju HOXA9 i MEIS1, stvarajući leukemiju koja pokazuje svojstva slična matičnim ćelijama (10-12). Ovi nalazi pokazuju intimnu vezu između disregulacije ekspresije gena i maligne transformacije, te ističu važnost istraživanja ključnih igrača u regulaciji ekspresije gena.

Pojednostavljeno, ekspresija gena se može regulisati na transkripcionom i posttranskripcionom nivou. Nedavni rad je otkrio složenost potonjeg mehanizma, koji ne uključuje samo sekvence svojstvene reguliranoj mRNA, već i druge faktore kao što su miR, proteini koji se vezuju za RNK (RBP) i nekodirajuća RNK (13). Prijavljena je složena interakcija između mRNA koja kodira protein i 3′ neprevedenog regiona (3′UTR) koji cilja na miR i RBP (14). Međutim, uloga regulacije genske ekspresije pomoću RBP-a u malignoj transformaciji B ćelija nije shvaćena. U nastojanju da identifikujemo kritičnu regulaciju posredovanu RBP-om u B-ALL-u, počeli smo ispitivanjem skupa podataka velike propusnosti koji je generiran u našoj laboratoriji, identificirajući inzulinski faktor rasta 2 mRNA-vezujući protein 3 (IGF2BP3) kao jedan od top disreguliranih gena u MLL-translociranom B-ALL. IGF2BP3 pripada porodici proteina koji se vezuju za mRNA koja se sastoji od 3 strukturno i funkcionalno povezana paraloga (IGF2BP1, IGF2BP2 i IGF2BP3) koji utiču na citoplazmatsku sudbinu mRNA kroz lokalizaciju, stabilnost i translaciju (15, 16). IGF2BP3 je onkofetalni protein sa visokom ekspresijom tokom embriogeneze, niskom ekspresijom u tkivima odraslih i reekspresijom u malignim tkivima. Kod epitelnog karcinoma, ekspresija IGF2BP3 je povezana sa nizom neoplastičnih fenotipova (17-20). Međutim, mnoga od ovih studija su u velikoj mjeri korelativna, a bona fide funkcionalna uloga IGF2BP3, ili bilo kojeg RBP-a, u onkogenezi B stanica nije utvrđena.

U ovoj studiji, nastojali smo da ocrtamo funkciju IGF2BP3 u leukemogenezi B ćelija. Prekomjerno smo eksprimirali IGF2BP3 u BM smrtonosno ozračenih miševa i otkrili da on igra ključnu ulogu u proliferaciji hematopoetskih matičnih i progenitornih ćelija, rekapitulirajući neke karakteristike MLL-preuređenog B-ALL-a. IGF2BP3 je omogućio BM progenitorima konkurentsku prednost u preživljavanju i povećao njihovu proliferaciju.Takođe smo otkrili da je IGF2BP3 bitan za preživljavanje B-ALL ćelijskih linija. Koristili smo individualnu nukleotidnu rezoluciju unakrsnog povezivanja imunoprecipitacije (iCLIP) da uhvatimo in situ specifičnost protein-RNA interakcija i da otkrijemo pozicioni kontekst mjesta vezanja proteina u transkriptomu. Ukupno smo identifikovali IGF2BP3 vezna mesta u nekoliko stotina transkripata u 2 B-ALL ćelijske linije. IGF2BP3 lokacije unakrsnog povezivanja su snažno obogaćene 3′UTR-ovima ciljnih transkripata. Od mnogih IGF2BP3 ciljnih transkripata, pokazali smo poboljšanje ekspresije onkogenih meta posredovano IGF2BP3 CDK6 i MYC u B-ALL stanicama i hematopoetskim progenitornim stanicama in vivo. Brisanje RNA-vezujućih domena IGF2BP3 poništilo je vezivanje ciljne mRNA, kao i hematopoetsko stablo i ekspanziju progenitora. Zajedno, naše studije sugeriraju da regulacija onkogenih ciljeva posredovana IGF2BP3 predstavlja ključni patogenetski mehanizam koji djeluje u MLL-rearanžiranom B-ALL.

IGF2BP3 je različito izražen u MLL-preuređenom B-ALL. Prethodno smo opisali eksperiment sa mikromrežom izveden na uzorcima B-ALL pacijenata (21). Nakon korekcije za testiranje višestrukih hipoteza, izvršili smo nenadzirano hijerarhijsko grupisanje sa značajno različito eksprimiranim genima koji kodiraju proteine ​​(prilagođenim P ≤ 0,01). Ovo je generisalo listu RBP-a različito izraženih između 3 citogenetička podtipa B-ALL korišćenih u našim eksperimentima sa mikromrežama (ETV-RUNX1, E2A-PBX i MLL-preuređeni). Na listi RBP-a čija je ekspresija bila najveća kod MLL-rearanžirane leukemije, IGF2BP3 bio među najboljim kandidatima (slika 1A). MLL-preuređene leukemije pokazuju potpis matičnih ćelija sa visokom ekspresijom gena povezanih sa matičnjakom kao što su HOXA9, MEIS1, i CD44 (11, 22). U skladu sa ovim, primetili smo to HOXA9, MEIS1A, CDK6, i MYC — pretpostavljeni ciljevi onkogenog MLL fuzijskog proteina — bili su značajno prekomerno izraženi u grupi koja je preuređena sa MLL u poređenju sa druge 2 podgrupe (dodatna slika 1, A-D). Izvođenjem kvantitativne PCR (qPCR) na velikoj kohorti B-ALL BM-ova izvedenih od pacijenata, potvrdili smo da IGF2BP3 i CD44 bili su visoko izraženi u MLL grupi (ukupno n = 134) (Slika 1, B i C). Osim toga, IGF2BP3 ekspresija je bila značajno veća u svim B-ALL uzorcima u poređenju sa CD19 + B ćelijama izolovanim od zdravih donora (Slika 1B). Da bismo ispitali zavisnost IGF2BP3 o MLL-posredovanim efektima na ekspresiju gena, koristili smo I-BET151, inhibitor bromodomena i ekstra terminalnog (BET) domena za koji je nedavno pokazano da inhibira ekspresiju gena zavisnu od MLL (23). Tretman RS411 — MLL-AF4–ekspresirajuće humane ćelijske linije B-ALL — sa I-BET151 uzrokovao je dozno-ovisno smanjenje ekspresije MYC, CDK6, i IGF2BP3 (Slika 1D). Takođe je izazvao zaustavljanje ćelijskog ciklusa u G1-S fazi (Slika 1, E i F). Ovi eksperimenti potvrđuju prekomjernu ekspresiju IGF2BP3 u B-ALL, s najvećom ekspresijom uočenom u MLL-preuređenom B-ALL. U skladu sa IGF2BP3 koji se nalazi nizvodno od MLL fuzionih proteina, pada u IGF2BP3 Nivoi mRNA, zajedno sa padom drugih ciljnih nivoa MLL-AF4, vide se nakon BET inhibicije.

IGF2BP3 je prekomjerno eksprimiran u MLL-translociranom B-ALL. (A) Toplotna karta iz podataka mikromreža koja prikazuje različito izražene RBP između B-ALL. IGF2BP3 je visoko izražen u MLL-preuređenom B-ALL. (B i C) qPCR-bazirana potvrda prekomjerne ekspresije IGF2BP3 (B) i njegov prethodno definirani cilj, CD44 (C), u MLL-preuređenom B-ALL (ukupno n = 134 jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom višestrukih poređenja **P < 0,01, ***P < 0.001, ****P < 0,0001). (DF) Tretman RS411 ćelijske linije povećanjem doze I-BET151. (D) qPCR od MYC, CDK6, i IGF2BP3 nivoi u RS411 ćelijama pokazuju značajno smanjenje svih 3 nivoa mRNA (t test MYC, P = 0.04, P = 0.06 IGF2BP3, P & lt 0.0001, P = 0.1 CDK6, P = 0.005, P = 0,004 1 μM i 2 μM, respektivno). (E i F) Analiza ćelijskog ciklusa bojenjem propidijum jodidom nakon tretmana RS411 ćelija I-BET151 pokazuje zaustavljanje G1 sekundarno zbog inhibicije CDK6. Eksperimenti su izvedeni 3 puta radi validacije. qPCR testovi su normalizovani na aktin (B i C) i RNA Pol II (D). Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD. Vidi također Dodatnu sliku 1.

Gubitak funkcije IGF2BP3 uzrokuje apoptozu u B-ALL stanicama. S obzirom na onkogeni obrazac ekspresije IG2BP3 u ljudskom B-ALL, nastavili smo da ispitujemo njegovu ekspresiju u 4 različite ćelijske linije B-ALL, uključujući 697 (E2A-PBX translociran), RS411, REH (ETV-RUNX1 translociran) i NALM6 ( Slika 2A). Da bismo ispitali efekte nokdauna IGF2BP3, koristili smo lentivirusni vektor koji eksprimira 2 različite miR formatirane siRNA sekvence za transdukciju RS411 ćelija (Slika 2B). Obje siRNA su izazvale smanjenje IGF2BP3 ekspresija pomoću qPCR (slika 2C). Bojenje propidijum jodidom pokazalo je povećanje apoptotičke sub-G1 frakcije, a 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum (MTS ) test je pokazao značajno smanjenje proliferacije ćelija sa IGF2BP3 knockdownom, potvrđujući zavisnost B-ALL ćelijskih linija od IGF2BP3 za preživljavanje (Slika 2, D i E). Brisanje IGF2BP3 lokus korišćenjem CRISPR-Cas9 sistema je takođe uzet u RS411 ćelijskoj liniji. Koristili smo LentiCRISPR sistem (24) sa 2 različita vodiča, Cr1 i Cr2, kako bismo ciljali IGF2BP3 lokus za brisanje. Delecija posredovana CRISPR-om potvrđena je testom endonukleaze T7 (dopunska slika 2, D i E) uz potpunu abrogaciju proteina IGF2BP3 sa vodećom RNK Cr2, dok je rezidualni protein detektovan sa Cr1 (slika 2F). Cr2 posredovana delecija rezultirala je smanjenom proliferacijom ćelija MTS testom, povećanim sub-G1 bojenjem i povećanom pozitivnošću na aneksin V (Slika 2, G–I). Da bismo potvrdili ove nalaze, također smo ciljali IGF2BP3 za nokdaun u NALM6 ćelijama koristeći sistem ekspresije lentivirusne siRNA (dodatna slika 2A). Smanjeno IGF2BP3 Nivoi mRNA su uočeni sa obe siRNA, pri čemu si2 daje jače smanjenje ćelijske proliferacije, kao što se vidi u MTS testu (dodatna slika 2, B i C). Zajedno, ovi nalazi naglašavaju važnost IGF2BP3 u održavanju preživljavanja i proliferacije ćelija kod B-ALL.

Nokdaun IGF2BP3 dovodi do poremećaja rasta ćelija i povećane apoptoze. (A) IGF2BP3 ekspresija u ljudskim B-ALL ćelijskim linijama. (B) Šema lentivirusnog vektora koji se koristi za nokdaun IGF2BP3. (C) IGF2BP3 knockdown, izmjeren qPCR prikazanim u RS411 ćelijskoj liniji (t test ***P = 0.0005). (D) Analiza ćelijskog ciklusa sa bojenjem propidijum jodidom. (E) MTS test koji pokazuje značajno smanjenu ćelijsku proliferaciju sa srušenom IGF2BP3. (F) Western blot koji pokazuje ekspresiju IGF2BP3 nakon ciljanja posredovanog CRISPR-Cas9 koristeći Cr1 ili Cr2 konstrukte. Ciljanje posredovano Cr1 rezultira nekim rezidualnim proteinom. β-Actin se koristi kao kontrola opterećenja. (G) MTS test pokazuje značajno smanjenu proliferaciju ćelija nakon ciljanja Cr2 (t test **P ≤ 0,01 za sva označena poređenja). (H) Analiza ćelijskog ciklusa bojenjem propidijum jodidom pokazuje povećanu smrt ćelije (sub-G1 pik) u ćelijama koje eksprimiraju Cr2. (I) Povećano bojenje aneksinom V u ćelijama ciljanim na Cr2 sa IGF2BP3 KO. I3, IGF2BP3. Eksperimenti su izvedeni 3 puta radi validacije. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD. Vidi takođe Dodatnu sliku 2. UbC, ubikvitin C promotor Puro, puromicin LC, kontrola lentiCRISPR.

Pojačana ekspresija IGF2BP3 dovodi do visokog nivoa presađivanja i povećanja leukocita. Da bismo direktno procenili ulogu IGF2BP3 u hematopoetskom sistemu, preduzeli smo eksperiment in vivo da ispitamo efekte prinudne ekspresije. Prvobitno smo klonirali ljudsku ili mišju kodirajuću sekvencu IGF2BP3 u MIG, retrovirusni vektor baziran na virusu matičnih stanica miša (Slika 3A) i potvrdili funkcionalnost vektora u ekspresiji i IGF2BP3 i GFP markera (Slika 3, B–D i podaci nisu prikazani). Periferno krvarenje ovih miševa nakon 4 sedmice pokazalo je značajno povećanje GFP + ćelija koje se održavalo tokom vremena kod miševa sa pojačanom ekspresijom kod ljudi i miša IGF2BP3, mjereno kongenim CD45.2 naspram CD45.1 FACS markera (Slika 3, E i F). Štaviše, pronađeni su značajno povećani GFP + ćelije leukocita, potvrđujući povećani hematopoetski izlaz koji se može pripisati ekspresiji IGF2BP3 (slika 3G). Ove promjene su ograničene na broj B ćelija i mijeloidnih ćelija u perifernoj krvi nakon potpunog presađivanja (Slika 3, H i I). Nije bilo razlike u broju T ćelija na periferiji (slika 3J). Zanimljivo je da je broj trombocita i crvenih krvnih zrnaca bio značajno manji sa ekspresijom izazvanom IGF2BP3 (Slika 3, K i L). Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da IGF2BP3 promoviše ukupni hematopoetski izlaz iz BM i skreće razvoj BM prema B ćelijskoj/mijeloidnoj liniji i dalje od T-ćelija, eritroidnih ćelija i megakariocita. Ovi nalazi, posebno preferencijalni porast B ćelija i mijeloidnih ćelija, interesantni su u svetlu činjenice da se MLL preuređenja nalaze ne samo kod B-ALL, već i kod akutne mijeloične leukemije i akutne leukemije mešovite loze, najčešće eksprimirajući oba B. ćelijskih i mijeloidnih markera.

Pojačana ekspresija IGF2BP3 dovodi do poboljšanog presađivanja i naginjanja prema razvoju B ćelija/mijeloida. (A) Šema bicistronskog vektora koji se koristi za pojačanu ekspresiju IGF2BP3. (B) Western blot koji pokazuje prekomjernu ekspresiju IGF2BP3 u pre-B ćelijskoj liniji miša, 7OZ/3, i ćelijskoj liniji ljudskog embriona bubrega, 293T. (C) qPCR pokazuje prekomjernu ekspresiju u 7OZ/3 na nivou mRNA (t test **P = 0.0013). (D) FACS analiza PB od miševa 6 sedmica nakon BMT pokazuje uspješno presađivanje i transdukciju (GFP+). (E) FACS PB urađen 4 sedmice nakon BMT, pokazujući CD45.2 i GFP pozitivnost (jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom ****P < 0,0001). (F) Kvantifikacija ekspresije GFP-a u PB između 4 i 16 nedelja nakon transplantacije pokazuje da je efekat izražen i trajan. (G) Broj leukocita PB u 16. sedmici pokazuje povećane leukocite (jednosmjerna ANOVA sa Bonferronijevim testom ***P < 0,001). (H i I) Značajno veći broj B220 + ćelija (H) i CD11b + ćelije (I) u PB (jednosmjerna ANOVA sa Bonferronijevim testom ***P < 0,001). (J) Popisivanje T ćelija zasnovano na FACS-u ne pokazuje značajnu promjenu u cirkulirajućim T ćelijama. (K i L) Brojanje eritrocita i trombocita pomoću CBC pokazuje značajno smanjenje (jednosmjerna ANOVA sa Bonferronijevim testom ***P < 0.001, ****P < 0,0001). n = 8 za sve 3 grupe. PB, BMT periferne krvi, transplantacija BM hI3, humani IGF2BP3 mI3, mišji IGF2BP3 CBC, kompletna krvna slika LTR, dugo terminalno ponavljanje IRES, interno ulazno mjesto ribosoma. Za validaciju su završena tri odvojena BMT eksperimenta. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD.

Pojačana ekspresija IGF2BP3 dovodi do povećanja progenitora u BM sa većim stopama proliferacije. Da bi se dalje karakterizirale ove hematopoetske promjene, žrtvovani su miševi sa prekomjernom ekspresijom IGF2BP3, a hematopoetski organi su sakupljeni za analizu 6 mjeseci nakon transplantacije. Procenat GFP + ćelija bio je značajno veći u BM sa prekomernom ekspresijom IGF2BP3, slično kao u perifernoj krvi (dopunska slika 3, A i B). Ukupni udio mijeloidnih i B ćelija u BM bio je sličan između kontrolnih i miševa koji eksprimiraju IGF2BP3 (dodatna slika 3, C i D). qPCR iz RNK prikupljene od mišjeg BM potvrdio je prekomjernu ekspresiju IGF2BP3 kod ljudi i miša (dodatna slika 3, E i F). Ove promjene su nas navele da se zapitamo da li je bilo promjena u hematopoetskim progenitorima u BM. Zaista, pojačana ekspresija IGF2BP3 dovela je do povećanja udjela HSC-a, multipotentnih progenitora sa limfoidima (LMPP) i uobičajenih limfoidnih progenitora (CLP) (Slika 4, A–C). Pratili smo razvojni put B ćelija slijedeći shemu koju su napravili Hardy et al. ( 25 ). Među frakcijama Hardy, uočili smo značajno povećanje broja ćelija u frakcijama A i B bez značajnih razlika uočenih u razvojno kasnijim fazama (dodatna slika 3, H, I i K). Stoga je prekomjerna ekspresija IGF2BP3 dovela do povećanja nezrelih hematopoetskih frakcija počevši od nivoa HSC pa do pro-B ćelijske faze. Da bismo analizirali brzinu proliferacije različitih progenitornih ćelija u BM, izvršili smo intracelularno bojenje sa Ki67 u kombinaciji sa bojama matičnih ćelija. Ki67 je bio značajno veći u populaciji Lin – Sca1 + c-Kit + (LSK) i LMPP u BM sa prekomjernom ekspresijom IGF2BP3 (Slika 4, D i E). CLP-ovi nisu pokazali značajnu razliku u ekspresiji Ki67 (dopunska slika 3, G i J). Ovi nalazi impliciraju povećanje stope proliferacije ranih progenitora (HSCs i LMPP), sekundarno zbog povećane ekspresije IGF2BP3. Vjerovatno, to dovodi do povećanja njihovog broja i diferencijacije u više predanih nizvodnih progenitora (CLP i Hardy frakcije A i B). Stoga, pojačana ekspresija IGF2BP3 uzrokuje preferencijalno povećanje broja i proliferaciju ranih progenitorskih populacija, što dovodi do uočene leukocitoze B-ćelije i mijeloida koja se vidi na periferiji.

Analiza BM progenitorskih populacija od miševa sa prekomjernom ekspresijom IGF2BP3. (A) Numeracija (lijevi panel) i reprezentativni histogrami protočne citometrije za definiranje HSC-a iz kontrolnog vektora– (drugi panel slijeva), humanog IGF2BP3– (drugi s desna) i mišjeg IGF2BP3– prekomjerne ekspresije miševa (desni panel). (B i C) Analiza za LMPPs i CLPs od miševa zabilježena kao u A. Statistički značajne razlike pronađene su u LMPP i CLP. (D) Intracelularno Ki67 bojenje i analize zasnovane na FACS, prikazane na isti način, sa nabrajanjem na lijevoj strani, unutar LSK populacije obogaćene za HSC. Utvrđene su značajne razlike u populaciji sa visokom ekspresijom Ki67. (E) Intracelularno Ki67 bojenje i FACS analiza proliferacije u LMPP populaciji pokazuju značajne razlike u proliferativnoj frakciji. Za sva poređenja korištena je jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom. *P < 0,05 **P & lt 0,01 ***P & lt 0,001 ****P < 0,0001. LSK, Lin – Sca1 hi c-Kit hi . Za validaciju su završena tri odvojena BMT eksperimenta. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD. Vidi takođe Dodatnu sliku 3. hI3, ljudski IGF2BP3 mI3, mišji IGF2BP3.

IGF2BP3 povećava broj B ćelija u timusu i mijeloidnih ćelija u slezeni. Normalni mišji timus se sastoji uglavnom od T-ćelija progenitora, ali u mnogim mišjim modelima leukemije i limfoma postaje uvećan i preplavljen malignim leukocitima (26). Na mikroskopskom pregledu, IGF2BP3 je izazvao širenje medularne moždine timusa sa infiltracijom velikih ćelija. Jedan od timusa koji eksprimira humani IGF2BP3 imao je potpunu ablaciju kortiko-medularnog spoja (Slika 5A). Stoga, ekspresija IGF2BP3 može poslužiti kao prekursor maligne transformacije. Primetili smo značajno veći procenat GFP + B220 + B ćelija u timusu kada je ljudski ili mišji IGF2BP3 bio prekomerno eksprimiran, pri čemu je efekat bio izraženiji kod mišjeg IGF2BP3 (Slika 5, B i C). Miševi sa pojačanom ekspresijom mišjeg IGF2BP3 takođe su pokazali značajno smanjenje broja CD3ε + T ćelija. Nije bilo značajne razlike u nivou GFP + ćelija u tim timusima, što ukazuje na ekspanziju B ćelija specifičnu za lozu (Dopunska slika 4, G–I). Četiri od 8 timusa koji prekomjerno eksprimira ljudski IGF2BP3 i 1/8 timusa koji prekomjerno eksprimira mišji IGF2BP3 teži preko 50 mg, bez takvog povećanja kod kontrolnih miševa (podaci nisu prikazani). Zanimljivo je da su slezine takođe povećane nakon pojačane ekspresije IGF2BP3. Razlike u težini slezene bile su statistički značajne za miševe sa prekomernom ekspresijom humanog IGF2BP3 sa trendom zabeleženim za grupu miša IGF2BP3 (dodatna slika 4A). IGF2BP3 je doveo do povećanja broja mijeloidnih ćelija u slezeni uz značajno smanjenje broja CD3ε + T ćelija (dodatna slika 4, B–F). Sve u svemu, čini se da IGF2BP3 naginje hematopoetski razvojni program prema B ćelijama i mijeloidnim linijama. Stoga, promjene uočene u BM - povećan broj i proliferacija B-limfoidnih i mijeloidnih progenitora - mogu dovesti do promjena u hematopoetskoj homeostazi na periferiji.

Analiza staničnog sastava timusa i kompetitivne prednosti repopulacije miševa sa prekomjernom ekspresijom IGF2BP3. (A) Histološke slike timusa od miševa sa pojačanom ekspresijom IGF2BP3. H&E bojenje. Skala bar: 40 μm. (B i C) Reprezentativne FACS dijagrame i nabrajanje koje pokazuju povećanje B220 + ćelija u timusu miševa sa pojačanom ekspresijom (jednosmjerna ANOVA s Bonferronijevim testom **P < 0,01). Vidi također Dodatnu sliku 4. n = 8 za sve 3 grupe. Za validaciju su završena tri odvojena BMT eksperimenta. (DH) Studija konkurentske repopulacije. (D) Kvantifikacija ekspresije GFP-a u PB između 4 i 20 sedmica nakon transplantacije u studiji kompetitivne repopulacije IGF2BP3. (EG) FAKS PB (E), BM (F), i timus (G) urađeno 20 sedmica nakon BMT, pokazujući CD45.2 i GFP pozitivnost (jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom **P < 0,01, ***P < 0,001). (H) qPCR potvrda prekomjerne ekspresije IGF2BP3 kod miša BM (t test ***P = 0.0006). n = 8 (MIG), n = 8 (Hoxa9), n = 5 (hI3), i n = 4 (100% CD45.1). Studija kompetitivne repopulacije je završena 3 puta radi validacije. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD. hI3, ljudski IGF2BP3 mI3, mišji IGF2BP3 PB, periferna krv.

IGF2BP3 daje hematopoetskim progenitorima prednost u preživljavanju. Da bismo potvrdili da je prekomjerna ekspresija IGF2BP3 opremila BM progenitore s prednosti dok smo ponovno naselili ozračenog miša domaćina BM, izveli smo formalni kompetitivni test transplantacije repopulacije. Pedeset posto CD45.1 BM ćelija je pomešano sa 50% MIG ili IGF2BP3- ili HOXA9- prekomerno ekspresirajućih CD45.2 BM ćelija i ubrizgano u smrtonosno ozračene miševe. CD45.2 ćelije sa prekomernom ekspresijom IGF2BP3 imale su jasnu prednost u odnosu na ćelije koje eksprimiraju MIG ili MIG-HOXA9 u presađivanju u perifernim krvarenjima tokom vremena (Slika 5, D i E). Sakupljanje BM otkrilo je da IGF2BP3 daje konkurentsku prednost ćelijama u BM (Slika 5F). Ovo se takođe odrazilo na timus (Slika 5G).Ovo potvrđuje naše ranije podatke koji pokazuju prekomjernu ekspresiju IGF2BP3 (Slika 5H) što dovodi do povećanja broja BM progenitora, kao i stope proliferacije.

iCLIP identifikuje IGF2BP3-RNA interaktom u B-ALL ćelijama. Molekularna osnova djelovanja RBP-a nedavno je istražena korištenjem iCLIP-a i sekvenciranja visoke propusnosti. Da bismo stekli uvid u ulogu IGF2BP3 u rastu ćelija i leukemogenezi vođenoj MLL, izvršili smo iCLIP test sa ovim proteinom. iCLIP koristi fotoreaktivnost ostataka nukleinske kiseline i proteina i fragmentaciju nukleaze transkripata vezanih za protein da bi uhvatio interakcije protein-RNA koje se dešavaju in situ. Antitela protiv IGF2BP3 korišćena su za imunoprecipitaciju kompleksa protein-RNA iz kontrolnih ili UV-ozračenih RS411 i REH ćelija (ulaz prikazan na Dodatnoj slici 5, A i C). Kao što se i očekivalo, imunoprecipitirani materijal bio je zavisan od antitela i UV zavisan, a elektroforetska pokretljivost kompleksa je bila osetljiva na nukleazu, kao što je predviđeno za kompleks protein-RNA (dodatna slika 5, B i D). Koprecipitirana RNA je pretvorena u cDNK biblioteke (dopunska slika 5E) i podvrgnuta sekvenciranju visoke propusnosti. Nakon što smo uračunali PCR duplikacije, dobili smo oko 1 milion čitanja po replikatu, od kojih je >70% jedinstveno mapirano u ljudski genom (dopunska tabela 1). Replicirane iCLIP sekvence iz RS411 i REH ćelija bile su visoko reproducibilne (dopunska slika 6, D i E). U poređenju sa iCLIP mestima unakrsnog povezivanja za heterogeni ribonukleoprotein A1 (hnRNPA1 HEK ćelije) i sa simuliranim podacima koji su nasumično izvučeni iz genoma, IGF2BP3 mesta unakrsnog povezivanja, smeštena na 5′ kraju iCLIP sekvenci, obogaćena su egzonima (slika 6A) .

iCLIP analiza IGF2BP3 u ljudskim ćelijskim linijama leukemije. (A) Udio IGF2BP3 (REH i RS411 ćelije), hnRNPA1 (HEK ćelije) i simuliranih (genom) mjesta unakrsnog povezivanja uočenih u egzonima, intronima ili neoznačenim regijama ljudskog genoma. (B) Udio IGF2BP3 (REH i RS411 ćelije), hnRNPA1 (HEK ćelije) i simuliranih (mRNA pozadina) vezivnih mjesta u kodirajućim i nekodirajućim egzonima. (C) Obogaćivanje tetramerske sekvence na IGF2BP3-mjestama unakrsnog povezivanja u RS411 i REH ćelijama (gornji i donji panel, respektivno). (D) Gustoća mjesta unakrsnog povezivanja IGF2BP3 (REH, RS411) i hnRNPA1 (HEK ćelije) u odnosu na terminacijske kodone. (E) Gustoća umrežavanja IGF2BP3 iz REH (tamnoplava linija) i RS411 (svetloplava linija) ćelijskih linija mapiranih u odnosu na označena miR ciljna mjesta. hnRNPA1 (crna linija) mjesta unakrsnog povezivanja iz ćelija HEK293 uključena su kao kontrola. (F i G) UCSC Genome Browser snimak CDK6 i MYC 3′UTR lokusi, respektivno. Svaki panel prikazuje ekson-intron strukturu gena, očuvanje sekvence među vrstama kralježnjaka i jedinstveno očitavanje od 2 iCLIP replike iz svake ćelijske linije. Maksimalan broj čitanja na svakoj poziciji označen je lijevo od svakog histograma. Vidi također dodatne slike 5 i 6. (H) Western blot uzoraka proteina iz IGF2BP3 RIP. Ulaz se odnosi na RS411 ćelijski lizat koji se koristi za imunoprecipitaciju. FT je protok imunoprecipitacije bilo iz kontrole (mišji IgG) ili IGF2BP3 RIP. RIP je RNK imunoprecipitacija iz kontrole (mišji IgG) ili α-IGF2BP3 antitijela (D-7). (I) Dijagrami raspršene trake upoređujući obogaćivanje nabora za MYC (n = 4, t test **P < 0,01) i CDK6 (n = 3, t test *P < 0,05) u kontroli (mišji IgG) i imunoprecipitacije RNA antitijela α-IGF2BP3. Nivoi MYC i CDK6 su normalizovani na ulazne nivoe iz ukupne RNK sa 18s rRNA kao referentnom.

Identifikovali smo vrhove koristeći negativan binomni model (vidi Metode) u svakoj biološkoj replici iz RS411 i REH ćelija. Ukupno, 849 pikova u 669 gena i 1,937 pikova u 1,149 gena identifikovano je u REH i RS411 iCLIP eksperimentima, respektivno. Od vrhova koji se nazivaju unutar sekvenci mRNA, većina se nalazila unutar 3′UTR (Slika 6B i Dodatna slika 6, A–C). Potraga za specifičnošću sekvence u umreženim regijama otkrila je 8 do 16 puta obogaćivanje motiva koji sadrže GCAC tetramer u odnosu na pozadinu u REH i RS411 skupovima podataka (slika 6C). S obzirom na očiglednu pristranost vezivnih mjesta IGF2BP3 u 3′UTR ciljnih transkripata, istražili smo pozicionu pristranost mjesta unakrsnog povezivanja pri rezoluciji jednog nukleotida u odnosu na stop kodone mRNA. Gustoća umreženosti IGF2BP3 razlikovala se od hnRNPA1 u 3′UTR, dostižući svoj vrh odmah nizvodno od stop kodona. Ovi podaci sugeriraju da mjesta vezivanja IGF2BP3 unutar 3′UTR specifično ciljaju sekvence blizu stop kodona u obje B-ALL ćelijske linije (Slika 6D).

Na osnovu distribucije IGF2BP3 umreženih mjesta unutar 3′UTRs (Slika 6D), pretpostavili smo da se mjesta vezivanja IGF2BP3 mogu preklapati sa cis-regulatorne karakteristike povezane sa regulacijom gena posredovanom 3′UTR. Da bismo istražili ovu mogućnost, ispitali smo distribuciju IGF2BP3 umreženih mjesta u odnosu na miR ciljna mjesta u 2 različite ćelijske linije. Nakon korekcije za ujednačenu pozadinu distribucije simuliranih mjesta unakrsnog povezivanja, otkrili smo da je gustoća umreženosti IGF2BP3 u REH i RS411 ćelijskim linijama visoko obogaćena unutar prozora od 25 bp usredsređenog na predviđene miR ciljne sekvence (Slika 6E). Suprotno tome, gustoća hnRNPA1 mjesta unakrsnog povezivanja bila je ravnomjerno raspoređena u odnosu na miR ciljna mjesta. Među genima sa jakim signalom iCLIP-sekvenciranjem (CLIP-Seq) bili su CDK6 i MYC. Da bismo potvrdili naše nalaze koji pokazuju interakciju IGF2BP3 sa ove 2 mete pomoću iCLIP-a (slika 6, F i G), koristili smo RNA imunoprecipitaciju (RIP slika 6H), koja je pokazala obogaćivanje MYC i CDK6 (Slika 6I) u IGF2BP3 RIP-ovima preko mišje kontrole IgG. Ovi podaci pokazuju, po prvi put koliko nam je poznato, sveobuhvatan atlas interakcije IGF2BP3 RNK iz ćelija ljudske leukemije. Ova opsežna mapa interakcija otkriva snažnu preferenciju neujednačenog vezivanja IGF2BP3 za 3′UTR sa sklonošću prema GCAC-bogatom konsenzusnom motivu u blizini miR ciljnih mjesta.

IGF2BP3 modulira ekspresiju svojih ciljeva. Alat ENRICHHR (27) korišten je za funkcionalnu klasifikaciju IGF2BP3 mRNA mete u REH i RS411 ćelijama. U obe ćelijske linije otkrili smo da su ciljni transkripti obogaćeni za KEGG puteve koji se odnose na biogenezu i translaciju ribosoma (Dopunska tabela 2). Nasuprot tome, transkripti koje je ENRICHR klasifikovao kao uključeni u patogene E. coli infekcija, i možda najvažnije, hronična mijeloična leukemija (CML) obogaćeni su RS411, ali ne i REH skupom podataka (dodatna tabela 2). Stoga smo željeli dalje istražiti funkcionalne posljedice vezivanja IGF2BP3 na ekspresiju gena na globalnom nivou. Da bismo utvrdili da li su IGF2BP3 iCLIP mete (Dopunska tabela 3) regulisane nivoima ekspresije IGF2BP3, izvršili smo RNA-Seq na kontrolnim i IGF2BP3 osiromašenim RS411 ćelijama (Dopunska tabela 4). Unakrsna validacija gena različito eksprimiranih najmanje 1,5 puta sa RS411-specifičnim IGF2BP3 iCLIP ciljevima pronašla je 216 zajedničkih gena. Od ovih ciljeva, većina je pokazala smanjenu ekspresiju IGF2BP3 iCLIP ciljeva sa osiromašenjem IGF2BP3 (157 smanjeno u odnosu na 59 povećano Slika 7A). Koristeći alat ENRICHR za klasifikaciju grupe zajedničkih gena, OMIM analiza ontologije gena bolesti (GO analiza) otkrila je gene povezane s leukemogenezom (slika 7A crni krugovi), uključujući CDK6 i MYC. GO analiza za niže regulirane IGF2BP3 iCLIP ciljeve otkrila je gene povezane s posttranskripcijskom kontrolom, diferencijacijom hematopoetskih stanica i modifikacijom hromatina (slika 7C). Analiza KEGG Pathwaya također je sugerirala da su ovi ciljevi uključeni u ćelijski ciklus i razne puteve raka (Slika 7C). Nasuprot tome, povećane IGF2BP3 iCLIP mete su otkrile gene koji su prvenstveno povezani s translacijom i lokalizacijom proteina (Slika 7B).

Unakrsna validacija IGF2BP3 iCLIP ciljeva sa IGF2BP3-osjetljivim diferencijalno eksprimiranim genima. (A) Vulkanski dijagram različito eksprimiranih gena (plave tačke) određen upotrebom DESeq analize na RNA-Seq uzorcima iz kontrolnih i IGF2BP3 srušenih RS411 ćelija (kao što je opisano na slici 2). Diferencijalno eksprimirani geni identificirani kao IGF2BP3 mete pomoću iCLIP-a su istaknuti (narandžaste tačke). Tačke označene crnim obrisima su leukemogeni geni GO analizom puteva bolesti povezanih sa OMIM-om. Isprekidane linije predstavljaju 1,5-struku promjenu izraza (vertikalne linije) i P < 0,05 granica (horizontalna linija). (B i C) GO analiza genskih podgrupa koja pokazuje povećanu ekspresiju (B) i smanjena ekspresija (C) sa obaranjem IGF2BP3 pomoću web alata za analizu obogaćivanja liste gena ENRICHR. Liste termina korištene u ovoj analizi bile su GO_Biological_Processes i KEGG za određivanje obogaćenih procesa i puteva iz naše unakrsno validirane liste od 269 IGF2BP3 ciljanih i osjetljivih gena. Vertikalne isprekidane linije predstavljaju P granična vrijednost (P < 0,05). KD, nokdaun.

CDK6 i MYC mRNA su mete IGF2BP3 in vitro i in vivo. Među mnogim ciljevima IGF2BP3 mRNA, CDK6 i MYC su veoma važni u patogenezi MLL-translociranog B-ALL (6, 7). U našem skupu podataka o pacijentima, MLL-translocirani slučajevi B-ALL pokazali su visoke nivoe ovih gena, u skladu sa njihovom predloženom ulogom kao mete vezane i regulisane IGF2BP3 (dodatna slika 1, A i B). Testirati hipotezu da IGF2BP3 posttranskripcijski regulira ekspresiju CDK6 i MYC preko vezivnih mesta u njihovom 3′UTR, generisali smo seriju vektora koristeći dual-luciferazni reporterski sistem koji sadrži odgovarajuće UTR (Slika 8A). The CDK6 3′UTR (10 kb) je kloniran u 5 odvojenih komada (CDK6-1 do CDK6-5). Kotransfekcija vektora luciferaze sa IGF2BP3 rezultirala je povećanom aktivnošću luciferaze u CDK6-3 do CDK6-5, kao i MYC 3′UTR reporteri (slika 8B). Ovo, zajedno sa iCLIP i RNA-Seq podacima, potvrđuje da vezivanje IGF2BP3 za 3′UTR ovih gena može stabilizirati mRNA i/ili poboljšati translaciju. Mutacija jednog od mjesta vezivanja unutar MYC 3′UTR, označen kao MYC Δ3, rezultirao je malim, ali ponovljivim slabljenjem IGF2BP3 ovisnog poboljšanja MYC 3′UTR reporter (slika 8C). Međutim, mutacija pojedinačnih IGF2BP3 veznih mjesta u CDK6 3′UTR, praćeni prekomjernom ekspresijom IGF2BP3 i testom luciferaze, nisu pokazali nikakvu značajnu razliku (podaci nisu prikazani). Ovi nalazi mogu biti rezultat jedne od sljedećih mogućnosti: (i) vezivanje možda neće biti dovoljno za promjene u ekspresiji gena, ili (ii) kooperativno vezivanje na više mjesta može biti potrebno za učinak na ekspresiju gena. Zaista, neke paralele su uočene u slučaju miR-ova, gdje je povećana represija uočena kod meta sa višestrukim mjestima vezivanja (28). Bez obzira na to, predviđa se da će vezivanje IGF2BP3 dovesti do povećanih nivoa CDK6 i MYC u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju IGF2BP3 i do smanjenih nivoa u ćelijama za uništavanje.

CDK6 i MYC su na meti IGF2BP3. (A) Šema korištenog testa luciferaze. (B) Luciferazni test koji pokazuje ciljanje CDK6 i MYC 3′UTR od IGF2BP3 (t test *P = 0.05 P = 0,0250 CDK6-4, P = 0,0475 CDK6-5, P = 0,0165 MYC). (C) Brisanje MYC 3′UTR vezujuća mjesta IGF2BP3 dovela su do skromne, ali značajno smanjene aktivnosti luciferaze (t test *P = 0.05 P = 0,0120 MYC, P = 0,0294 MYC Δ3). (D i E) CDK6 analiza BM progenitora pokazuje značajno povećanu količinu CDK6 proteina u GFP + BM ćelijama (t test *P = 0.0213) (D) ali ne u GFP – (E) ćelije. (F i G) Intracelularno bojenje za MYC otkriva značajno povećane nivoe u GFP + BM ćelijama nakon ekspresije pojačane IGF2BP3 (t test ****P < 0,0001) (F) ali ne u GFP – (G) ćelije. n = 8 za sve 3 grupe. (H i I) Nakon Igf2bp3 obaranje u 7OZ/3 ćelije (t test IGF2BP3 si1 i si2, redom ***P = 0.0007, ***P = 0,0005), postoji smanjena ekspresija CDK6 i MYC proteina (H). U ćelijskoj liniji RS411, Western blot je potvrdio uništenje IGF2BP3 proteina i smanjenu ekspresiju CDK6 proteina (I). Eksperimenti su izvedeni 3 puta radi validacije. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD. Vidi takođe Dodatnu sliku 7. hI3, humani IGF2BP3 PE, fikoeritrin.

Da bismo razjasnili da li IGF2BP3 cilja na CDK6 i MYC in vivo, izvršili smo intracelularno bojenje u BM ćelijama miševa sa pojačanom ekspresijom IGF2BP3 i izmjerenim srednjim intenzitetom fluorescencije (MFI) protočnom citometrijom. BM GFP + ćelije izvedene iz humanih miševa koji eksprimiraju IGF2BP3 su povećali MFI za CDK6 i MYC (Slika 8, D i F). Kao kontrola, GFP – ćelije obe grupe nisu pokazale nikakvu razliku (Slika 8, E i G). Da bismo dopunili ove in vivo podatke, analizirali smo nivoe CDK6 i MYC proteina u ćelijskim linijama gde je IGF2BP3 prethodno oboren koristeći siRNA. Došlo je do značajnog smanjenja nivoa CDK6 proteina u RS411 ćelijama nakon pada IGF2BP3 (slika 8I). Slično, Igf2bp3 nokdaun u pre-B 7OZ/3 ćelijskoj liniji miša doveo je do smanjenja CDK6 i MYC proteina (Slika 8, H i I). Ovi nalazi su u skladu sa podacima RNA-Seq i pokazuju očuvanu funkciju za IGF2BP3 (slika 7A).

Na nivou mRNA, prekomjerna ekspresija IGF2BP3 dovela je do blagog, ali značajnog povećanja Myc nivoa mRNA, ali ne u Cdk6, u rasutom stanju BM (dodatna slika 7, A i B). Moguće je povećanje u Cdk6 mRNA možda neće biti otkrivena zbog heterogenosti BM ćelija ili zbog toga što efekti na stabilnost mRNA od strane IGF2BP3 mogu biti specifični za mRNA. Slično, mišje 7OZ/3 ćelije su pokazale skromno povećanje Cdk6 Nivoi mRNA kada je mišji IGF2BP3 bio prekomjerno eksprimiran (dopunska slika 7, C-E). Ovi nalazi potvrđuju vezivanje IGF2BP3 i naknadnu translacijsku augmentaciju ovih ciljnih gena. Sve u svemu, ovi eksperimenti pokazuju ciljanje CDK6 i MYC od strane IGF2BP3 u različitim sistemima, i to može biti osnova uočenih fenotipskih efekata prinudne ekspresije.

Mutirani IGF2BP3 ne povećava broj hematopoetskih progenitora in vivo. IGF2BP3 ima 6 RNA-vezujućih domena: 2 domena motiva za prepoznavanje RNK (RRM) i 4 K domena homologije (KH) za koje se predviđa da će posredovati u funkciji vezanja RNA IGF2BP3. Napravili smo 2 delecijska mutanta: KH mutant, koji sadrži samo 4 KH domena i bez oba RRM domena, i RRM mutant, koji sadrži 2 RRM domena i nema 4 KH domena (Slika 9, A i F). Mišja BM transplantacija je izvedena sa MIG, WT IGF2BP3, KH i RRM mutantima u smrtonosno ozračene primaoce. Za razliku od WT proteina, pojačana ekspresija ovih mutantnih proteina nije uspjela uzrokovati pojačanu hematopoezu ili iskrivljenje prema B ćelijskim i mijeloidnim linijama koje smo prethodno primijetili. Mutantni miševi primaoci pokazali su smanjeno presađivanje (Slika 9, B i C). Broj B ćelija i mijeloidnih ćelija na periferiji pokazao je trend normalizacije kod IGF2BP3 mutantnih miševa (Slika 9, D i E). Test luciferaze koristeći MYC 3′UTR i poređenje WT i mutantnog IGF2BP3 pokazalo je smanjenu aktivnost luciferaze, potvrđujući ideju da se ovi mutanti više ne vezuju za i/ili ne stabiliziraju ciljne mRNA (Slika 9G). Zanimljivo je da je jedna studija objavila da uloga KH domena nije dobro shvaćena u IGF2BP3, među različitim članovima porodice IGF2BP (29). Iako precizne determinante vezivanja RNK nisu poznate, naši nalazi daju poticaj za izvođenje detaljnih analiza strukture i funkcije kako bi se razjasnili domeni i ostaci važni za funkciju IGF2BP3. Zajedno sa našim podacima o visokoj propusnosti, ovi eksperimenti pružaju neke od prvih sveobuhvatnih studija koje povezuju funkciju vezivanja RNK ovog proteina sa fenotipovima na nivou organizma.

Ekspresija mutanata IGF2BP3 RNA-vezujućeg domena in vivo i in vitro. (A) Šema IGF2BP3 sa njegovim vezujućim domenima i odgovarajućim mutantima (KH i RRM). (B) Vremenski tok normalizovanog presađivanja na MIG u PB između 4 i 20 nedelja nakon transplantacije. (C) FACS PB urađen 4 sedmice nakon BMT, pokazujući CD45.2 i GFP pozitivnost (jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom ***P < 0,001). (D) B ćelije u PB 16 sedmica nakon transplantacije. (E) Mijeloidne ćelije u PB 12 nedelja nakon transplantacije. n = 8 za sve grupe. Eksperiment s mutantnim BMT-om je završen dva puta radi validacije. (F) Western blot je potvrdio ekspresiju IGF2BP3 (64 kDa), KH (47 kDa) i RRM (22 kDa) proteina u 7OZ/3 koristeći anti-T7 (gornja ploča) i anti-IGF2BP3 (donja) antitela. Aktin se koristi kao kontrola opterećenja. (G) Test luciferaze pokazuje povećanu aktivnost luciferaze za MYC 3′UTR kada je kotransficiran sa hI3 i smanjena aktivnost luciferaze za MYC 3′UTR kada je kotransficiran sa KH i RRM mutantima (t test hI3, K,H i RRM ***P & lt 0,001 ****P < 0,0001). Eksperiment je završen 3×. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD. hI3, humani IGF2BP3 PB, periferna krv.

Molekularni mehanizam leukemogeneze posredovan MLL-fuzionim proteinima nije u potpunosti shvaćen, uprkos poznavanju translokacije i rezultirajućih fuzionih proteina tokom 2 decenije. Sve se više priznaje da su sekundarne, negenetske promjene neophodne za elaboraciju leukemije. Na primjer, deregulacija epigenetskih oznaka od strane DOT1L, koju regrutuje MLL-AF4 fuzioni protein, je ključni onkogeni mehanizam (30). U ovoj studiji otkrili smo da je RBP, IGF2BP3, prekomjerno izražen u slučajevima B-ALL koji nose translokaciju MLL gen. Predlažemo da disregulacija posttranskripcijske ekspresije gena također može igrati važnu ulogu u leukemogenezi. Ovo potvrđuju prethodne studije drugog RBP-a, musashi-2, koje su pokazale da je bio visoko izražen kod akutne mijeloične leukemije i da bi njegova prekomjerna ekspresija mogla sarađivati ​​s BCR-ABL u promicanju mijeloične leukemogeneze (31). Još jedan nedavni primjer je HuR protein, koji je pojačano reguliran kod višestrukih epitelnih maligniteta i poznato je da stabilizira svoje mete vezivanjem za elemente bogate AU unutar 3′UTR ciljne mRNA (32). Naši nalazi ovdje proširuju repertoar neregulirane ekspresije RBP na B-ALL, pružajući novi uvid u ovu bolest.

Mehanizam povećanja IGF2BP3 kod leukemije koja eksprimira MLL-AF4 je važno pitanje. Naše studije su pokazale da inhibitor BET domena može smanjiti IGF2BP3 u RS411, a smatra se da to specifično cilja transkripciju posredovanu MLL-om u malim dozama (23). Prethodni izvještaji su također pokazali da se IGF2BP3 povećava nakon prekomjerne ekspresije MLL-AF4 u mišjim BM ćelijama (4).Zanimljivo je da je indirektni ChIP-Seq test urađen u SEM ćelijama (koje nose MLL-AF4 translokaciju) pokazao vezivanje fuzionog proteina za genomski lokus koji sadrži IGF2BP3 (33). Stoga je primamljivo o tome spekulisati IGF2BP3 je direktna meta transkripcije MLL fuzionih proteina. Međutim, IGF2BP3 je također prekomjerno eksprimiran u većini testiranih B-ALL ćelijskih linija, raznim zrelim neoplazmama B stanica (34-37) i brojnim epitelnim malignitetima. Nadalje, uočena je diferencijalna regulacija ovog proteina kod B-ALL (38). Dakle, mehanizam njegove regulacije može uključivati ​​i druge onkogene puteve.

Ranije se pokazalo da srušenje IGF2BP3 u epitelnim ćelijskim linijama smanjuje ćelijsku proliferaciju i uzrokuje apoptozu (18, 37, 39). Otkrili smo da je obaranje ili brisanje IGF2BP3 od strane siRNA ili sistema CRISPR-Cas9 dovelo do smanjene proliferacije ćelija i povećane apoptoze u RS411, ćelijskoj liniji koja ekspresira MLL-AF4, i NALM6, drugoj ćelijskoj liniji B-ALL koja pokazuje visoke nivoe od IGF2BP3. Ovi nalazi naglašavaju važnu ulogu koju posttranskripcijska genska regulacija može igrati u održavanju malignog ponašanja B-ALL stanica. Biće od velikog interesa proučiti da li B-ALL sa niskim nivoom ekspresije IGF2BP3 pokazuje izmenjen repertoar vezanja RNK, sa ciljem da se osvetle ključne mRNA koje posreduju nizvodno efekte IGF2BP3.

Da bismo proučavali patogenetsku funkciju ovog proteina, kreirali smo i prvi in ​​vivo model ekspresije izazvane IGF2BP3 u mišjem hematopoetskom sistemu. Otkrili smo da IGF2BP3 povećava broj HSC-a, LMPP-ova i CLP-ova u BM-u uz istodobno povećanje stope proliferacije HSC-a i LMPP-a. IGF2BP3 je dao kompetitivnu prednost rekonstitucije i iskrivio hematopoezu miša prema B ćeliji i mijeloidnoj liniji na periferiji, sa leukocitozom u perifernoj krvi, atipičnom infiltracijom B ćelija u medulu timusa i povećanjem mijeloidnih ćelija u slezeni. Iako miševi nisu razvili očiglednu leukemiju 6 mjeseci nakon transplantacije, ove abnormalne razvojne karakteristike su slične onima uočenim u ranoj leukemogenezi uzrokovanoj MLL-om, što uključuje ekspanziju B ćelija i mijeloidne linije. Takvi efekti vođeni IGF2BP3 na matične i progenitorne ćelije i sudbine diferencijacije mogu se proširiti izvan hematopoetskog sistema. IGF2BP3 može uzrokovati remodeliranje egzokrinog pankreasa kada je specifično prekomjerno eksprimiran u tom tkivu i visoko je eksprimiran u matičnim stanicama raka/ćelijama koje iniciraju tumor u hepatocelularnom karcinomu (40, 41).

Poznato je da IGF2BP3 cilja mRNA za IGF2, CD44, i faktor transkripcije HMGA2 (16, 42). Daljnji izvještaji o HMGA2 i IGF2BP sugeriraju da oni mogu igrati ulogu u potencijalu samoobnavljanja fetalnih HSC (43, 44). Poznato je da Let-7 miR inhibira migraciju i invaziju tumorskih ćelija ciljajući IGF2BP3 (45). Dakle, IGF2BP3 može funkcionirati u regulaciji i razvojnih i onkogenih procesa. Da bismo ispitali molekularni mehanizam iza uočenih poremećaja u ćelijskoj i hematopoetskoj homeostazi, izvršili smo iCLIP-Seq analize. Zanimljivo je da smo identifikovali brojne RNA mete IGF2BP3 u B-ALL ćelijskim linijama koje su bile poznate mete MLL, uključujući CDK6 i MYC. CDK6 je nedavno impliciran kao vrlo važna meta u B-ALL, a inhibicija CDK6 može biti osnova nove terapijske intervencije u B-ALL (7). MYC je suštinski onkogen, a njegova prekomjerna ekspresija igra direktnu, uzročnu ulogu u mnogim leukemijama B ćelija i limfomima. Reporter testovi su potvrdili da interakcija IGF2BP3 sa 3′UTRs MYC i CDK6 funkcionalno su važni. IGF2BP3 sa delecijama RNA-vezujućih domena nije uspio da se veže i stabilizuje MYC mRNA u testu reportera luciferaze. Međutim, kada su pojedinačna mjesta vezivanja IGF2BP3 izbrisana u MYC i CDK6 3′UTR, većina ovih delecija nije uspjela da preokrene fenotip u testu reportera. Složenost ciljanja 3′UTR ilustruje niz RBP-ova i nekodirajućih RNA za koje se navodi da se vezuju za MYC i CDK6 3′UTRs ( 46 – 49 ). Stoga je djelovanje RBP-a na njegove srodne mete vjerovatno ovisno o dozi i kooperativni višestruki RBP-ovi moraju se vezati za isti 3′UTR na različitim lokacijama da bi izvršili učinak. In vivo i in vitro ciljanje CDK6 i MYC proteina potvrđeno je u ćelijskim linijama miša BM i leukemije, iu postavkama gubitka i povećanja funkcije. Stoga smo potvrdili iCLIP kao moćnu tehniku ​​za otkrivanje ciljeva relevantnih za bolest. Važno je istaći da vjerovatno postoje mRNK osim MYC i CDK6 koji stupaju u interakciju s IGF2BP3, uključujući one koje ovdje identificiramo, koji igraju važnu ulogu u ćelijskoj proliferaciji i/ili diferencijaciji. Ovo je ilustrovano našim pokušajem da spasimo ćelijsku smrt posredovanu srušenjem IGF2BP3 kotransdukcijom RS411 ćelija sa MYC konstrukcije koje sadrže ili nemaju 3′UTR. Sam MYC nije bio dovoljan da spasi promjene u ćelijskom ciklusu uzrokovane gubitkom funkcije IGF2BP3 (podaci nisu prikazani).

iCLIP-Seq analize pružaju globalni pogled na transkriptom regulisan IGF2BP3. Prethodne studije su pokazale jednu ili nekoliko meta za ovaj protein, ali naš rad ovdje pokazuje nekoliko stotina mRNA vezanih za ovaj protein. Da bismo precizirali našu listu mogućih transkripata, kombinovali smo ovu biohemijsku identifikaciju cilja sa studijama ekspresije gena u ćelijama sa gubitkom funkcije IGF2BP3. Različiti skupovi gena koji su bili vezani IGF2BP3 pokazali su regulaciju naviše ili naniže, sa smanjenom regulacijom gena koji pokazuju obogaćivanje puteva povezanih sa ćelijskim ciklusom i leukemijom. Ovi nalazi sugeriraju da povećanje regulacije IGF2BP3 u B-ALL služi za stabilizaciju ekspresije leukemogenih gena. Kao i drugi načini posttranskripcione regulacije ekspresije gena, djelovanje IGF2BP3 ovisi o programu ćelijskog transkripcije. IGF2BP3 je sam po sebi induciran od strane MLL-AF4, i on se veže za nekoliko mRNA i reguliše ih nagore (npr. CDK6 i MYC) koje takođe izaziva MLL-AF4. Na ovaj način, IGF2BP3 može pojačati određene aspekte programa ekspresije gena, čime se održava onkogeneza. Zanimljivo je, međutim, da je pojačana ekspresija samog ovog proteina također dovela do proliferacije hematopoetskih progenitorskih stanica, što sugerira da specifičnost stabilizacije RNK i/ili translacijskog poboljšanja može usmjeriti razvoj i utjecati na izbor loze i proliferaciju.

Kako se onkogene mutacije i translokacije katalogiziraju putem različitih pristupa sekvencioniranja visoke propusnosti, također postaje očigledno da pojedinačne genetske abnormalnosti nisu dovoljne da izazovu onkogenezu. Prethodni rad je uključio negenetske mehanizme, uključujući epigenetsku regulaciju, kao ključne faktore na putu do pune onkogeneze. Ovdje su naše studije otkrile posttranskripcijski mehanizam stabilizacije onkogenih genskih proizvoda kao što su CDK6 i MYC. Ovaj mehanizam zahtijeva dalje proučavanje i pojašnjenje i vjerovatno će dati važan uvid u prirodu regulacije ekspresije gena u leukemogenezi. S obzirom da se pojavljuju ciljane terapije protiv CDK6 i MYC, bit će kritično razmotriti ulogu posttranskripcijskih mehanizama u regulaciji programa ekspresije gena posredovanih onkogenom. Štaviše, terapijski putevi su također sugerirani od strane trenutne studije, uključujući stvaranje ponornih RNA za blokiranje vezivanja IGF2BP3 za njegove mete ili inhibitore malih molekula ovog proteina dizajnirane da blokiraju njegovu funkciju vezanja RNA. S obzirom na ekspresiju IGF2BP3 u mnogim različitim tipovima karcinoma, bit će od velikog interesa definirati da li je repertoar vezanih mRNA sličan kod tumora različite histogeneze i da li konzervirani onkogeni putevi mogu biti ciljani u hematološkim i nehematološkim malignitetima.

Uzorci pacijenata, izolacija CD19 + ćelija i analiza podataka mikromrežom. Sve procedure i protokoli koji se odnose na njih su prethodno opisani, a skup podataka mikromreža je javno dostupan (NCBI-jev omnibus genske ekspresije [GEO GSE65647]) (21).

Analiza apoptoze, proliferacije i ćelijskog ciklusa. Da bi se izmerila proliferacija ćelija, 2.000-4.000 ćelija po jažici je kultivisano u pločama sa 96 jažica. MTS reagensi su dodavani prema uputama proizvođača (Promega CellTiter 96 AQueous Komplet za neradioaktivnu proliferaciju ćelija) i ćelije su inkubirane na 37°C, 5% CO2 4 sata prije mjerenja apsorbancije na 490 nm. Da bi se izmjerila apoptoza, ćelije su obojene APC-označenim aneksinom V i analizirane protočnom citometrijom. Za analizu ćelijskog ciklusa, ćelije su fiksirane sa 70% etanolom i obojene 1× rastvorom propidijum jodida u PBS i analizirane protočnom citometrijom.

qPCR. RNK prikupljena iz ljudskih uzoraka je reverzno transkribovana korištenjem iScript reagensa (Quanta BioSciences). RNK iz ćelijskih linija je reverzno transkribovana pomoću qScript-a (Quanta BioSciences). qPCR je izveden sa StepOne Plus PCR sistemom u realnom vremenu (Applied Biosystems) koristeći PerfeCTa SYBR Green FastMix reagens (Quanta BioSciences). Korištene sekvence qPCR prajmera navedene su u Dodatnoj tabeli 5.

Western blot. Ćelije su lizirane u RIPA puferu (Boston BioProducts) sa dodatkom koktela inhibitora halt proteaze i fosfataze (Thermo Scientific). Jednake količine proteinskog lizata (kako je kvantificirano korištenjem testa proteina bicinhoninske kiseline, BCA [Thermo Scientific]) podvrgnute su elektroforezi na 5%-12% SDS-PAGE i elektroblotiranim na nitroceluloznu membranu. Korištena su antitijela c-MYC zečja poliklonska (katalog 9402, Cell Signaling Technology), CDK6 zečja monoklonska (katalog DCS83, Cell Signaling Technology), IGF2BP3 kozja poliklonska (katalog sc-47893, Santa Cruz Biotechnology Inc.), T7 zečja AB3790, Millipore) i β-aktin (katalog AC15, Sigma-Aldrich) monoklonski miš. Sekundarna HRP-konjugirana antitijela (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i SuperSignal West Pico kit (Pierce Biotechnology) korišteni su za poboljšanu detekciju zasnovanu na hemiluminiscenciji.

Ćelijska kultura, plazmidi i spin infekcija. mmu-miR-155 ili hsa-miR-21 formatirane siRNA su klonirane između NotI i BamHI mjesta pHAGE6 lentivirusnog vektora (pHAGE6-CMV-siRNA-UBC-ZsGreen) ili između NotI i BamHI mjesta modificiranog pHAGE6 vektora nizvodno od GFP-a (CMV-GFP-siRNA-UBC-Puromycin). U mišjim ćelijskim linijama, siRNA i umetci koji kodiraju protein su klonirani u MGP i MIG vektore (50). WT IGF2BP3 i delecijski mutanti (KH i RRM) sa oznakom epitopa T7 klonirani su između BglII i XhoI mjesta u vektoru baziranom na MIG (MSCV-T7 tag-Mutant CDS-IRES-GFP Vidi Dodatnu tabelu 5). Za ciljanje posredovano CRISPR-Cas9, vođene RNK su dizajnirane korištenjem web stranice Zhang laboratorije (http://crispr.mit.edu/) i klonirane u LentiCRISPR vektor (24). RS411 ćelije su spin-inficirane na 30°C tokom 90 minuta u prisustvu polibrena. Ćelije su odabrane sa 5 μg/ml puromicina tokom 7 dana i korištene za testove ćelijske proliferacije i apoptoze. Ljudske B-ALL ćelijske linije RS411 (MLL-AF4 translociran ATCC CRL-1873), NALM6 (poklon K. Sakamota, Stanford univerzitet, Stanford, Kalifornija, SAD), 697 (E2A-PBX1-translociran poklon od K. Sakamota) , Reh (TEL-AML1-translocirani ATCC CRL-8286), mišja pre-B leukemijska ćelijska linija 7OZ/3 (ATCC TIB-158) i ćelijska linija HEK 293T (ATCC CRL-11268) uzgajane su u odgovarajućim medijima na 37 °C u 5% CO2 inkubator. Lentivirusi i retrovirusi su generirani kako je prethodno opisano (50, 51).

BM transplantacija i kompetitivni test repopulacije. BM je sakupljen i spin-inficiran od 8 sedmica starih ženki miševa CD45.2 + donor C57BL/6J kao što je prethodno opisano (50). Također smo transplantirali miševe donore s T7 epitopom označenim IGF2BP3 i mutantnim konstruktima, uključujući delecione mutante kojima nedostaju domene za vezivanje RNA. Osmonedeljni CD45.1 + primalac B6.SJL-Ptprc-Pep3/BoyJ ženke miševa su smrtonosno ozračene i ubrizgane su donor BM 6 sati nakon ozračivanja. Korišteno je osam miševa po grupi. U nekim eksperimentima, normalizovano presađivanje je izračunato kao procenat efikasnosti presađivanja/transdukcije. Za eksperimente kompetitivne repopulacije, 8 sedmica stare CD45.1 + donor B6.SJL-Ptprc-Pep3/BoyJ ženke miševa i 8 sedmica stare CD45.2 + donor C57BL/6J ženke su sakupljene za BM. CD45.2 + BM je inficiran virusima koji prekomjerno eksprimiraju MIG, HOXA9 ili IGF2BP3. CD45.1 + i CD45.2 + BM ćelije su pomešane u omjeru 1:1 i ubrizgane u smrtonosno ozračene 8-nedeljne CD45.2 + primaoce C57BL/6J ženke miševa. Negativna kontrolna grupa imala je 100% CD45.1 + BM ćelije ubrizgane u smrtonosno ozračene 8-nedeljne CD45.2 + primaoce C57BL/6J ženke miševa. Miševima je uzeta krv 4, 8, 12, 16 i 20 sedmica nakon injekcije BM za analizu periferne krvi. Svi miševi su kupljeni od Jackson Laboratory i smješteni u uvjetima bez patogena na UCLA.

Protočna citometrija. Krv, BM, timus i slezena su sakupljeni od miševa u sterilnim uslovima 27 nedelja nakon transplantacije. Suspenzije pojedinačnih ćelija su lizirane u puferu za lizu crvenih krvnih zrnaca. Za bojenje su korištena antitijela konjugirana sa fluorohromom. Spisak korišćenih antitela dat je u Dodatnoj tabeli 6. Za intracelularno bojenje, nakon početnog bojenja površinskim markerskim antitelima i fiksacije sa 1% paraformaldehida (PFA), ćelije su inkubirane sa antitelima protiv intracelularnih antigena (Ki67, Cdk6 i Myc) u 1% Triton koji sadrži MACS pufer. Nakon 30 minuta bojenja na 4°C, ćelije su dva puta isprane sa PBS i fiksirane sa 1% PFA. Protočna citometrija je izvedena na UCLA JCCC i na Broad Stem Cell Research Flow Core. Analiza je izvršena pomoću softvera FlowJo.

Histopatologija. Fiksiranje i sečenje je opisano ranije (51). Analizu je obavio certificirani hematopatolog (D.S. Rao).

iCLIP. iCLIP je izveden kao što je prethodno opisano (52). Ukratko, RS411 ili REH ćelije su ozračene UV-C svjetlošću da bi se in vivo formirali ireverzibilni kovalentni unakrsni proteini sa nukleinskim kiselinama. Nakon ćelijske lize, RNK je djelomično fragmentirana korištenjem mikrokokne nukleaze, a kompleksi IGF2BP3-RNA su imunopročišćeni anti-IGF2BP3 antitijelom (MBL International Corporation) imobiliziranim na magnetnim kuglicama obloženim proteinom A (Invitrogen). Nakon strogog ispiranja i defosforilacije (FastAP, Fermentas), RNA su vezane na svojim 3′ krajevima na 3′ preadenilirani RNA adapter, radioaktivno obilježene, izvedene pomoću elektroforeze na proteinskom gelu bazirane na MOPS, i prebačene na nitroceluloznu membranu. Protein-RNA kompleksi 15-80 kDa iznad slobodnog proteina odsječeni su iz membrane, a RNK je obnovljena digestijom proteinazom K u uslovima denaturacije (3,5 M uree). Oligonukleotidi za obrnutu transkripciju sadržavali su 2 inverzno orijentirana adaptorna regiona prilagođena iz Bioo NEXTflex kompleta za pripremu male RNA biblioteke (Bioo Scientific), odvojene BamHI restrikcijskim mjestom i regijom barkoda na njihovom 5′ kraju koja sadrži 4-nt bar kod specifičan za eksperiment unutar 5-nt slučajnog barkoda za označavanje pojedinačnih molekula cDNK. cDNA molekule su pročišćene po veličini pomoću denaturirajuće PAGE, cirkularizirane pomoću CircLigase II (Epicenter, Illumina), žarene na oligonukleotid komplementaran restrikcijskom mjestu i isječene korištenjem BamHI (New England Biolabs Inc.). Linearizovane cDNK su zatim PCR-amplifikovane korišćenjem Immomix PCR Master Mix-a (Bioline) sa prajmerima (Bioo Scientific) komplementarnim regionima adaptera i podvrgnuti sekvenciranju visoke propusnosti korišćenjem Illumina HiSeq. Objavljen je detaljniji opis iCLIP protokola (53). Podaci o kojima se govori u ovoj publikaciji deponovani su u NCBI-jev GEO ( 54 ) (GSE76931).

iCLIP analiza podataka. Nakon transkriptomskog i genomskog usklađivanja sa “TopHat2” (55), pojedinačna čitanja su skraćena na svoje 5′ krajeve da predstavljaju mjesto unakrsnog povezivanja. Za označavanje specifičnih mjesta interakcije protein-RNA, 30-bp regije obogaćivanja preko pozadine su određene korištenjem "Piranha" (56) u nultom skraćenom negativnom binomskom modu sa prilagođenom lokalnom kovarijacijom. Kovarijanta je izračunata ujednačenom distribucijom broja unakrsnih veza svakog bin od 30 bp preko susjednih 6 binova (3 na svakoj strani) kako bi se kontrolisala područja ukupne veće dubine kao indikacija interakcije protein-RNA. Susjedna kante sa značajnim P vrijednosti iz Piranha (α < 0,05) su kombinovane u pojedinačne regije. Samo preklapajući vrhovi za koje je utvrđeno da su statistički značajni u sve 3 replika smatrani su biološki reproduktivnim kandidatima za dalju analizu. Da bismo izvukli intragene distribucije iCLIP-Seq lokacija, postavili smo upit u MySQL bazu podataka UCSC Genome Browser za hg19 (57) i odredili najbliži preklapajući gen na osnovu prvo napomena CCDS gena (58) da bismo odredili kanonski ORF, a drugo na Gencode V19 comprehen za ostale karakteristike ( 59 ). Nakon toga, zabilježeno je najbliže intragensko sidro (početno mjesto transkripcije, startni kodon, 5′ mjesto spajanja, 3′ mjesto spajanja, stop kodon i mjesto poliadenilacije) i izračunata je udaljenost spoja do najbliže ORF granice. Kao pozadinska kontrola, ujednačeno raspoređena mjesta unakrsnog povezivanja simulirana su pseudo-slučajnim intervalima iz hg19 korištenjem "bez alata" (60). Intragenska distribucija ovih lokacija određena je po istoj metodologiji kao i iCLIP unakrsne veze.

Da bi se odredila specifičnost vezivanja IGF2BP3, ekstrahiran je 10-nt prozor koji okružuje svako mjesto unakrsne veze koje se javlja unutar biološki reproducibilnog i statistički značajnog pika iz posljednjeg egzona i izračunat je broj svakog n-mera (4 do 6). . Nasumični intervali od 20-bp iz prozora od 100-300 nukleotida u blizini svakog mjesta unakrsnog povezivanja uključeni su kao normalizirana frekvencija n-mera kako bi se predstavila pozadinska vjerovatnoća (p) posmatranja svakog n-mera. Za svaku veličinu n-mera, vjerovatnoća zapažanja k pojavljivanja nekih n-mera od N ukupnih opservacija je binomno raspoređena (k

Bin[p, N]) i Poissonove aproksimacije, date dovoljno velike vrijednosti za N (>1,000) i male vrijednosti P (<0.01). Pojedinačni n-meri sa Poissonovom aproksimacijom P vrijednosti značajne pri stopi lažnog otkrivanja od 5% (61) su zatim poređane jedna s drugom i grupirane u motive koristeći k-medoidno grupiranje za optimalne vrijednosti k (koristeći prosječnu širinu siluete). Učestalost pojavljivanja svakog nukleotida je zatim ucrtana na način specifičan za poziciju za svaki klaster motiva.

RNA imunoprecipitacija. Protein A Dynabeads (Invitrogen) u 100 mM natrijum fosfatnog pufera (pH 8,1) tretirani su ili IgG mišjim antitelom (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) ili α-IGF2BP3 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) tokom 4°C 1 sat.Perle su zatim isprane 3x puferom RSB-100 (10 mM Tris-Cl [pH 7,4], 100 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5% NP-40). Citoplazmatski lizati su pripremljeni iz suspenzije RS411 ćelija u RSB-100 koja sadrži inhibitore RNaze. Supernatanti lizata su kombinovani sa kuglicama/antitijelom, rotirani na 4°C preko noći i isprani, a dio je uklonjen za Western blot analizu. Peletirane kuglice su resuspendovane u puferu Proteinase K (100 mM Tris-HCl [pH 7,4], 50 mM NaCl, 10 mM EDTA [pH 8,0]). Uzorci su tretirani RQ DNase I (Promega), a zatim tretirani Proteinazom K (Ambion) i oba su inkubirana na 37°C. RNK je ekstrahovana kiselim fenol-hloroformom i precipitirana sa natrijum acetatom, apsolutnim etanolom i koprecipitatom GlycoBlue (Ambion). RNA je izdvojena centrifugiranjem, isprana i resuspendirana u vodi bez RNAze. Količina i kvalitet su provjereni Nanodrop i kompletom Total RNA NanoBioanalyzer (Agilent Technologies). Uzorci RNK (200 μg svakog uzorka trostruki i za IgG kontrole i imunoprecipitacije α-IGF2BP3) podvrgnuti su reverznoj transkripciji pomoću kompleta za reverznu transkripciju cDNA visokog kapaciteta (Thermo Scientific) i naknadnom qPCR pomoću Lightcycler 480 (Lightcycler Diagnostics).

Eksperimenti sekvenciranja RNK. RNA je pročišćena iz obje citosolne frakcije osiromašenih IGF2BP3 ili kontrolnih RS411 stanica korištenjem TRI-reagensa LS (Sigma-Aldrich), pretvorena u dvolančane biblioteke korištenjem NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq Library Prep Kit (Bioo Scientific) koristeći Illumina HiSeq 2500 platformu. Podaci o sekvenciranju RNA visoke propusnosti koje je generirao Illumina HighSeq 2500 i koji su odgovarali otprilike 30–115 miliona čitanja po uzorku (Dopunska tabela 4) mapirani su na hg19 građenje ljudskog genoma (febr. 2009. GRCH37, NCBI Build 37.1 i TopH softvera) (62, 63). Svo prikupljanje i raščlanjivanje podataka obavljeno je sa Perl-om, a statističke analize sa R-om, verzija 2.14.1. Svi korišteni paketi vanjskih biblioteka dostupni su na CPAN-u ili CRAN-u. Diferencijalno eksprimirani geni su identificirani korištenjem DESeq-a. Podaci su dostupni putem NCBI GEO (GSE76931).

Luciferazni testovi. The CDK6 3′UTR je dugačak približno 10 kb, dok je MYC 3′UTR je otprilike 300 bp. MYC Δ3 i MYC Δ4 su mutantni MYC 3′UTRs kojima nedostaju IGF2BP3 vezna mjesta određena iz iCLIP podataka. Prajmeri su dizajnirani da isključe ova mesta vezivanja, fuzioni PCR je završen, a MYC i MYC Δ 3′UTR su klonirani nizvodno od luciferaze krijesnice u vektoru pmirGlo između mesta SacI i XhoI (64). The CDK6 3′UTR je podijeljen na 5 komada (CDK6 1–5

2 kb svaki) i klonirani pojedinačno nizvodno od luciferaze krijesnice. 293T ćelije su transficirane sa pmirGlo, 3′UTR ili Δ 3′UTR koji sadrže reporterske vektore zajedno sa MIG praznim vektorom, MIG-hIGF2BP3 vektorom prekomjerne ekspresije, MIG-T7-hIGF2BP3 vektorom prekomjerne ekspresije ili MIG-T7-KH/RMM mutantom vektori u omjeru 1:10 (50:500 ng). Kotransfekcije su izvedene s Lipofectamine 2000 (Invitrogen) prema uputama proizvođača. Ćelije su lizirane nakon 24 sata, dodat je supstrat, a luminiscencija je izmjerena na GloMax-Multi Jr (Promega). Za sve uzorke izračunat je omjer svijeće i aktivnosti luciferaze Renilla. Luminiscencija hIGF2BP3/MIG ili mutant/MIG za prazan vektor pmirGlo korištena je kao kontrola normalizacije.

Statistika. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ±SD za kontinuirane numeričke podatke. Jednosmjerna ANOVA praćena Bonferronijevim testom višestrukih poređenja ili 2-tailed Student's t testovi su izvedeni pomoću softvera GraphPad Prism i primijenjeni na svaki eksperiment kako je opisano u legendama slika. A P vrijednost manja od 0,05 smatra se značajnom. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, i ****P < 0,0001.

Odobrenje studije. Pismeni informirani pristanak je dobiven od svih roditelja pacijenata od strane Italijanskog udruženja za pedijatrijsku hematologiju i onkologiju (AIEOP) i Berlin-Frankfurt-Muenster (BFM) ALL-2000 ispitivanje. Univerzitet u Padovi IRB je odobrio sve procedure, a studija se smatrala izuzetom od pregleda na UCLA. Mononuklearne ćelije periferne krvi dobijene od anonimiziranih davalaca dobijene su od Centra za istraživanje AIDS-a Virology Core Lab na UCLA ili nakon dijagnostičkog rada od UCLA Odsjeka za patologiju i laboratorijsku medicinu uz pismeni pristanak i odobrenje IRB-a. Svi eksperimentalni postupci s miševima provedeni su uz odobrenje UCLA Chancellor's Animal Research Committee (ARC).

JKP je dizajnirao studiju, izveo eksperimente, analizirao podatke i napisao rad. JRS i DSR su dizajnirali studiju, analizirali podatke i napisali rad. TMT i JMH izveli su eksperimente, analizirali podatke i napisali rad. Eksperimente su izveli JRC i TRF. TSW, SK, MT, WY, MP i GB analizirali su podatke.

Zahvaljujemo članovima Rao laboratorija na korisnim raspravama. Zahvaljujemo Parth Patel, May Paing, Norma Iris Rodriguez-Malave, Jennifer King, Jaspal Bassi, Kim Pioli, Nolan Ung i Jaime Anguiano na njihovoj tehničkoj podršci. Ovaj rad je podržan NIH grantom R01 CA166450, početnim grantom UCLA JCCC i nagradom za razvoj karijere K08CA133521 (D.S. Raou), kao i grantovima NIH R01GM109146 i R21AG042003 (J.R. Sanfordu). J.R. Contreras je podržan od strane Tumor Immunology Training Grant, NIH T32CA009120. T.R. Fernanda je podržao Grant za obuku iz biologije tumora NIH T32CA009056. J.M. Howarda je podržao R41HG007336. Protočna citometrija je izvedena u UCLA JCCC/CFAR Flow Cytometrija Core Facility koju podržavaju NIH AI-28697, P30CA016042, JCCC, UCLA AIDS Institute i David Geffen School of Medicine na UCLA.

Sadašnja adresa Jayantha Kumara Palanichamyja je: Odsjek za biohemiju, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi, Indija.

Sukob interesa: Autori su izjavili da ne postoji sukob interesa.

Referentne informacije: J Clin Invest. 2016126(4):1495–1511. doi:10.1172/JCI80046.


9.12C: RNA onkogeni virusi - biologija

Možda nijedna bolest nije jače identifikovana s krajem dvadesetog veka od sindroma stečene imunodeficijencije, opšte poznatog kao SIDA. Ipak, prema izvještaju Ujedinjenih naroda iz 2004. o stanju globalne epidemije AIDS-a, bolest još nije počela da smanjuje svoj utjecaj na svjetsku populaciju uprkos činjenici da AIDS generalno ne dobija istu pažnju javnosti kao nekada učinio. Naprotiv, infekcije su u porastu u mnogim zemljama, uključujući zemlje s visokim prihodima kao što su Sjedinjene Države. 2003. godine gotovo pet miliona ljudi zarazilo se virusom ljudske imunodeficijencije (HIV) koji uzrokuje AIDS, što je najveći broj novih infekcija u jednoj godini otkako je AIDS prvi put službeno priznat kao bolest 1981. godine.

Virus odgovoran za HIV prvi su izolovali 1983. godine Robert Gallo iz Sjedinjenih Država i francuski naučnik Luc Montagnier. Od tog vremena provedena je ogromna količina istraživanja koja se fokusiraju na uzročnika AIDS-a i mnogo se naučilo o strukturi virusa i njegovom tipičnom načinu djelovanja. HIV je jedan od grupe atipičnih virusa zvanih retrovirusi koji održavaju svoje genetske informacije u obliku ribonukleinske kiseline (RNA). Korištenjem enzima poznatog kao reverzna transkriptaza, HIV i drugi retrovirusi su sposobni proizvesti deoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) iz RNK, dok većina stanica provodi suprotan proces, transkribirajući genetski materijal DNK u RNK. Aktivnost enzima omogućava da se genetska informacija HIV-a trajno integriše u genom (hromozome) ćelije domaćina.

Primarni domaćini za HIV su bela krvna zrnca koja se različito nazivaju pomoćni T limfociti, pomoćne T ćelije ili CD4+ T ćelije. Ove ćelije su važne komponente imunog sistema koje su normalno odgovorne za aktiviranje odgovora mnogih drugih imunoloških ćelija. Pomoćne T ćelije koje se inficiraju HIV-om brzo umiru. Ubrzo nakon primarne infekcije, tijelo je obično u stanju da nadoknadi gubitak inficiranih T ćelija tako što ih proizvodi u većim količinama, a u tom trenutku osobe zaražene HIV-om su asimptomatske. Vremenom, međutim, virus postaje sve akutniji i dolazi do sporog opadanja pomoćnih T ćelija. Shodno tome, broj pomoćnih T ćelija u tijelu (koji se naziva broj CD4) se općenito koristi za mjerenje napredovanja virusa. Broj CD4 manji od približno 200 ćelija po mikrolitru krvi može biti praćen raznim oportunističkim infekcijama i smatra se završnom fazom infekcije. Uporni talas takvih infekcija je ono što obično dovodi do smrti pacijenata sa AIDS-om.

HIV je relativno složen virus koji je u stanju da inficira pomoćne T ćelije uglavnom zahvaljujući glikoproteinu ugrađenom u njegovu ovojnicu zvanom gp120 (vidi sliku 1) koji se veže za CD4, protein koji se nalazi na površinama T ćelija. Takođe se smatra da ulazak HIV-a u ćeliju domaćina uključuje ko-receptor na površini ćelije, bilo CCR5 ili CXCR4, koji obično funkcionišu kao receptori hemokina. Omotač virusa HIV-a je derivat plazma membrane ćelije domaćina, dobijen pupanjem. Kada HIV pokuša da uđe u ćeliju, interakcije između molekula ćelijske površine i proteina omotača virusa omogućavaju da se ovojnica spoji sa ćelijskom membranom. Poznato je da protein omotača nazvan gp41 igra važnu ulogu u ovom procesu.

U inficiranoj ćeliji, HIV se podvrgava reverznoj transkripciji, proizvodeći dvolančanu DNK iz svoje RNK uz pomoć reverzne transkriptaze, specijalizovanog enzima specifičnog za virus koji transkribuje DNK iz RNK šablona. Jednom u obliku DNK, genetska informacija HIV-a se ugrađuje kao provirus sa DNK ćelije domaćina. Provirusni genom se može naknadno prepisati u virusnu RNK koja funkcionira kao mRNA za translaciju u proteine ​​HIV-a i kao genomi za kasniju generaciju virusa. Kapsidi se formiraju oko virusnih genoma i proteina prije nego što se pupolje iz ćelijske membrane, dalje inkapsulirajući materijal u ovojnice.

Proces replikacije HIV-a povezan je sa vrlo visokom stopom mutacija jer reverzna transkripcija ne dozvoljava ispravljanje grešaka u inkorporaciji nukleotida. HIV se razvija milion puta brže od evolucije ljudskog genoma, što otežava imunološkom sistemu da prepozna i efikasno se bori. Iz sličnih razloga, razvoj lijekova ili cjepiva za HIV je komplikovan poduhvat, virus ne samo da se uvelike razlikuje od pacijenta do pacijenta, već čak pokazuje i značajna genomska odstupanja kod pojedinaca. Lijek za HIV i dalje ostaje nedostižan, ali značajan napredak uvelike je poboljšao kvalitet njege koju pacijenti mogu dobiti. Visoko aktivna antiretrovirusna terapija (HAART), koja uključuje upotrebu višestrukih inhibitora reverzne transkriptaze i proteaze, pokazala se vrlo korisnim oblikom liječenja za mnoge pacijente, ali je cijena terapije spriječila njegovu široku upotrebu u mnogim dijelovima svijeta najteže. pogođen HIV-om i AIDS-om.


9.12C: RNA onkogeni virusi - biologija

Retrovirusi se sastoje od raznolike porodice virusa sa omotačem RNK, izvanrednih po upotrebi reverzne transkripcije virusne RNK u linearnu dvolančanu DNK tokom replikacije i naknadne integracije ove DNK u genom ćelije domaćina. Članovi ove porodice uključuju važne patogene kao što su HIV-1, mačja leukemija i nekoliko virusa koji izazivaju rak. Međutim, interesovanje za ove viruse prevazilazi njihove mogućnosti izazivanja bolesti. Na primjer, istraživanja u ovoj oblasti dovela su do otkrića onkogena, što je veliki napredak u polju genetike raka. Studije retrovirusa uvelike su doprinijele našem razumijevanju mehanizama koji reguliraju ekspresiju eukariotskih gena. Osim toga, retrovirusi su se pokazali kao vrijedni istraživački alati u molekularnoj biologiji i uspješno su korišteni u genskoj terapiji (npr. za liječenje teške kombinirane imunodeficijencije povezane s X).

Napisana od strane vrhunskih stručnjaka za retrovirusne bolesti, ova knjiga daje pregled genomike, molekularne biologije i patogeneze ovih važnih virusa, sveobuhvatno pokrivajući sva nedavna dostignuća. Teme uključuju: interakcije domaćina i retroelementa, endogene retroviruse, retrovirusne proteine ​​i genome, ulazak virusa i uklanjanje omotača, reverznu transkripciju i integraciju, transkripciju, spajanje i transport RNK, patogenezu onkovirusnih infekcija, patogenezu infekcija virusom imunodeficijencije, faktore retrovirusne restrikcije retrovirusne vakcine korelati zaštite, gamaretrovirusni i lentivirusni vektori, retrovirusi sisara i riba koji nisu primati, egzogeni retrovirusi majmuna i HTLV i HIV. Osnovno štivo za svakog retrovirologa i preporučeni tekst za sve virološke i molekularne biološke laboratorije.

"odlična poglavlja o retrovirusima sisavaca koji nisu primati, retrovirusima majmuna, retrovirusima riba, upotrebi retovirusnih vektora i ćelijskih faktora koji ograničavaju retrovirusnu infekciju. Sva poglavlja su prekrasno ilustrovana i napisana od strane nekih od najcjenjenijih autoriteta u ovoj oblasti. preporučiti knjigu K i B "Retrovirusi" studentima i stručnim kolegama." sa bloga Retrovirology

"impresivan rad . značajan resurs za ovu oblast . temeljna pokrivenost istraživanja od strane vodećih stručnjaka . bitno štivo za veterinarske naučnike, kliničare, virologe i diplomirane studente u ovoj oblasti." iz SciTech Book News (mart 2010.)

"sažeti, najsavremeniji sažetak biologije ne samo retrovirusa već i drugih retroelemenata. sveobuhvatan, zgodan i zadovoljavajući referentni rad" iz Microbiology Today (2010.)

"preporučljivo za istraživače prirodnih nauka i sve studente biologije" iz Arzneimittelforschung (2010) 60:466-469

(EAN: 9781904455554 9781912530977 Predmeti: [virologija] [mikrobiologija] [medicinska mikrobiologija] [molekularna mikrobiologija] [genomika] )


Biti ili ne biti zaražen: EV u pro- i antivirusnim strategijama

In vivo, EV mogu komunicirati sa virusima i međusobno direktno ili putem modulacije odgovora domaćina, učestvujući na taj način u „ratu i miru“ između virusa i domaćina (49, 50). Neki virusi induciraju inficirane stanice da oslobađaju modificirane EV-e koji olakšavaju infekciju povećanjem skupa osjetljivih ciljnih stanica (npr. povećanjem broja aktiviranih stanica) ili njihove osjetljivosti na virusnu infekciju ili služe kao mamci koji apsorbiraju antivirusna antitijela, čime ugrožavaju antivirusni imunitet. Nasuprot tome, EV-ovi koji nose virusne proteine ​​također mogu biti korisni za domaćina, na primjer, obezbjeđivanjem dendritskih ćelija sa virusnim antigenima kako bi se olakšalo pokretanje adaptivnih imunoloških odgovora. Hipotetički, sposobnost EV-a da regulišu životni vek permisivnih ćelija i da modifikuju antivirusne imune odgovore može dati dodatnu fleksibilnost domaćinu u reagovanju na virusnu infekciju. Stoga, EV formirani tokom virusne infekcije mogu igrati ili pro- ili kontravirusnu ulogu (slika 3). Trenutno je nepoznato mogu li se različite funkcije pripisane virusom izazvanom EV djelomično objasniti razlikama u čistoći EV populacija korištenih u različitim studijama. Stoga još uvijek nedostaje opće razumijevanje parametara koji određuju neto učinak EV-a na virusne infekcije.

Provirusni i antivirusni efekti EV-a koje oslobađaju ćelije inficirane retrovirusom. Retrovirusna infekcija može dovesti do oslobađanja modificiranih EV-a koji olakšavaju ili potiskuju infekciju. Potencijalni antivirusni efekti uključuju (A) EV posredovana isporuka antivirusnih komponenti, kao što je APOBEC3G, za povećanje otpornosti na infekciju (B) širenje TLR liganada, kao što je virusna RNK, preko EV-a kako bi se upozorile neosjetljive susjedne stanice na prisustvo virusne infekcije i (C) obezbjeđivanje ćelija koje predstavljaju antigen virusnim antigenom kako bi se olakšalo pokretanje adaptivnih imunoloških odgovora. Potencijalni provirusni efekti uključuju (D) inhibicija neutralizirajućeg efekta EV, što dovodi do smanjenog vezivanja EV za virione i povećanja broja viriona koji mogu inficirati druge stanice (E) EV posredovana isporuka virusnih komponenti (npr. Nef) koje induciraju ćelijsko starenje ili smrt antivirusnih imunih ćelija (F) EV posredovana isporuka virusnih komponenti koje potiskuju funkciju imunih ćelija (npr. Nef-inducirana regulacija proizvodnje antitijela od strane B ćelija) i (G) povećanje broja ćelija osjetljivih na viruse, npr. prijenosom koreceptora za vezivanje virusa na druge stanice.

EV olakšavaju virusnu infekciju.

Nekoliko HIV proteina i RNK otkriveno je u EV-ovima oslobođenim iz ćelija inficiranih HIV-om. Jedna od virusnih komponenti koje se oslobađaju putem EV je RNA elementa odgovora na transaktivaciju HIV-a (TAR) (51). TAR je struktura RNA matične petlje koja se nalazi na 5′ krajevima HIV-1 transkripata, koji u inficiranim ćelijama mogu biti vezani Tat, čime se olakšava regrutovanje faktora elongacije i povećana proizvodnja virusne RNK (52). Kada se prenosi putem EV, TAR RNA može povećati populaciju osjetljivih ciljnih stanica. Unutar ćelija ciljanih na EV, TAR RNK pune dužine se obrađuje u miRNA, koje utišaju mRNA koja kodira za Bcl-2 interagirajući protein. Posljedično povećanje otpornosti na apoptozu omogućava ćeliji da proizvodi virus na duži period, čime se olakšava infekcija HIV-om (51).

Osim toga, EV koje oslobađaju ćelije inficirane HIV-om selektivno inkorporiraju HIV faktor virulencije Nef putem interakcije regije modifikacije Nef sekrecije sa mortalinom, članom Hsp70 porodice pratilaca uključenih u promet ćelijskih proteina (53). Isporuka Nef-a povezanih s EV u T ćelije utiče na ove ćelije na nekoliko načina. Prvo, preneseni Nef može aktivirati T ćelije, čineći ih podložnijim HIV infekciji (54). Drugo, EV mogu isporučiti Nef nekim CD4 + T ćelijama posmatrača i izazvati ćelijsko starenje ili smrt (55). Ovaj mehanizam može doprinijeti visokom nivou smrti T-ćelija u ranim fazama HIV infekcije, kada je virusno opterećenje još uvijek nisko (55). Konačno, međućelijski prijenos Nef-a putem EV-a može olakšati izbjegavanje humoralnog imunološkog odgovora supresijom proizvodnje IgG2 i IgA u B ćelijama, kao što je također pokazano za prijenos Nef-a od strane makrofaga inficiranih HIV-om u B ćelije preko međućelijskih kanala (56).U in vitro sistemima, pokazalo se da EV mogu prenijeti HIV koreceptore CCR5 i CXCR4 u druge ćelije, čineći ih tako sklonim HIV infekciji (57, 58). Ovaj proces posredovan EV može proširiti spektre ćelija inficiranih HIV-om, ali još uvijek nije poznato da li takav fenomen igra važnu ulogu in vivo.

EV suzbijaju virusnu infekciju.

U in vitro eksperimentima je pokazano da T ćelije mogu proizvesti EV koji sadrže HIV receptor CD4. Ovi EV se mogu vezati za virusne čestice, čime se smanjuje broj viriona koji bi inače inficirali CD4 + T ćelije (59). Međutim, HIV može da se suprotstavi tome stimulišući ugradnju HIV-Nef u ove EV, što dovodi do inhibicije inkorporacije CD4 u EV i smanjene efikasnosti gore opisanog antivirusnog odgovora domaćina (59).

Drugi EV-posredovani mehanizam zaštite ćelije domaćina od HIV-a uključuje EV posredovani transport antivirusnog proteina domaćina APOBEC3G. Ova citidin deaminaza se obično inkorporira u virione zajedno sa retrovirusnom RNK i inhibira replikaciju virusa stvaranjem G-to-A mutacija u transkribovanoj virusnoj DNK (60). Antivirusno djelovanje APOBEC3G se suprotstavlja HIV-kodiranim proteinom Vif, koji ometa ugradnju APOBEG3G u virione. Isporuka APOBEC3G bez Vif-a putem EV može suprotstaviti efektu Vif-a i na taj način povećati otpornost ćelija ciljanih na EV na HIV infekciju (34). Slično tome, nedavni podaci pokazuju da je drugi glasnik ciklički gvanozin monofosfat-adenozin monofosfat (cGAMP) (induciran cGAMP sintazom) zatvoren i u HIV česticama i u EV-ima koji se oslobađaju iz inficiranih ćelija. Međućelijski transfer cGAMP-a, iako se efikasnije postiže virusima nego EV, pokreće antivirusne IFN odgovore u novoinficiranim ćelijama na način zavisan od stimulatora gena za interferon (STING) (35, 36).

EV iz ćelija inficiranih virusom ne samo da sadrže endogene (mi)RNA, već se pokazalo i da su selektivno obogaćene virusnim RNA (npr. u slučaju EV-a izazvanih HCV) (38). PRR-ovi u ćelijama ciljanim na EV mogu prepoznati takve RNK kao molekularne obrasce povezane s patogenom (PAMP) i odgovoriti tako što će pokrenuti urođeni antivirusni odgovor (38, 61). Makrofagi zaraženi HIV-om također oslobađaju virusne RNK koje sadrže EV (virusne miRNA vmiR88 i -99) koje pokreću endosomalnu TLR8 i NF-κB signalizaciju u EV-ciljanim makrofagima promatrača (61). Naknadna proizvodnja proinflamatornih citokina (npr. TNFα) doprinosi pokretanju imunološkog odgovora na HIV. Diseminacija virusne RNK putem EV-a pruža strategiju za upozorenje neosjetljivih susjednih stanica na prisustvo virusne infekcije. Tokom HCV infekcije, na primjer, plazmacitoidni DC su ciljani virusnom RNK koja sadrži EV i, kao rezultat, iniciraju inflamatorni odgovor (38). Osim toga, EV koji sadrže miRNA domaćina koju proizvode ćelije otporne na viruse mogu dati otpor drugim stanicama. Ovo je pokazano za trofoblaste, koji su u velikoj mjeri otporni na infekciju raznim virusima, uključujući HIV, što vjerovatno doprinosi zaštiti fetusa in vivo. EV koje proizvode ove stanice in vitro nose miRNA domaćina i isporučuju ih ćelijama osjetljivim na viruse, čineći ih otpornim na virusnu infekciju (62).


John Joseph Karijolich, dr.

Veza između infekcije virusima i neoplazije je dobro utvrđena za različite vrste raka. U stvari, oko 12% ljudskih karcinoma širom svijeta uzrokovano je onkogenim virusnim infekcijama, a više od 80% slučajeva javlja se u zemljama u razvoju. Uprkos njihovoj rasprostranjenosti i važnosti za javno zdravlje, naše razumijevanje i sposobnost upravljanja virusom izazvanim karcinomima i dalje je ograničeno. To je dijelom zbog složenosti interakcija domaćin-virus koji dovode do ćelijske transformacije.

Istraživanja u našoj laboratoriji usmjerena su na definiranje interakcije domaćin-virus u kontekstu gamaherpesvirusne infekcije. ¿-herpesvirusi, koji uključuju humane onkogene viruse herpesvirusa povezanog sa Kaposi sarkomom (KSHV) i Epstein Barrov virus (EBV), su porodica velikih dvolančanih DNK limfotrofnih virusa koji su uzročnici raznih poremećaja, uključujući limfoproliferativne bolesti, limfome, kao i druge nelimfoidne karcinome kod sisara. Studije odgovora domaćina na virusnu infekciju su se povijesno fokusirale na gene koji kodiraju proteine, pa je naše razumijevanje o tome kako transkriptom koji ne kodira proteine, uključujući i nekodirajuće RNK iz virusa i iz domaćina, utječe na interakcije između domaćina i virusa ograničeno. U tom pravcu, naši primarni istraživački ciljevi usmjereni su na razumijevanje kako su nekodirajuće RNK i njihovi proteini koji se vezuju za RNK integrirani u regulaciju ekspresije gena i modulaciju imunološkog odgovora domaćina tokom ¿-herpesvirusne infekcije. Da bismo to postigli, preduzimamo multidisciplinarni pristup koji kombinuje virologiju, imunologiju, biohemiju RNK, proteomiku i genomiku/transkriptomiku. Glavna tematska pitanja laboratorije uključuju:

1) Koje su endogene i egzogene nekodirajuće RNK vrste koje doprinose urođenoj imunološkoj modulaciji i kako su te funkcije posredovane?

2) Kako urođeni imuni sistem ćelije oblikuje životni ciklus ¿-herpesvirusnog i koji su domaćin i virusni entiteti u igri?

3) Kakav je doprinos endogenih retrovirusa i transpozona interakciji domaćin-virus?

Ye X, Zhao Y, Karijolich J. Krajolik inicijacije transkripcije kroz latentne i litičke KSHV genome. PLoS Patog. 15. jun 2019. (6): e1007852. PMID: 31188901, PMCID: PMC6590836, PII: PPATHOGENS-D-19-00162, DOI: 10.1371/journal.ppat.1007852, ISSN: 1553-7374.

Heinrich MJ, Purcell CA, Pruijssers AJ, Zhao Y, Spurlock CF, Sriram S, Ogden KM, Dermody TS, Scholz MB, Crooke PS, Karijolich J, Aune TM. Endogeni dvolančani Alu RNA elementi stimulišu IFN-odgovore u recidivirajućoj remitentnoj multiploj sklerozi. J. Autoimmun [print-elektronski]. 2019. jun 100: 40-51. PMID: 30826177, PMCID: PMC6513682, PII: S0896-8411(18)30699-1, DOI: 10.1016/j.jaut.2019.02.003, ISSN: 1095-9157.

Zhao Y, Ye X, Dunker W, Song Y, Karijolich J. Sensing receptora poput RIG-I na RNK domaćina olakšava ćelijski intrinzični imuni odgovor na KSHV infekciju. Nat Commun. 2018 Nov 19.11.2018. 9(1): 4841. PMID: 30451863, PMCID: PMC6242832, PII: 10.1038/s41467-018-07314-7, DOI: 10.1038/s41467-018-07314-7, DOI: 10.1038/s41467-018-07314-7. 1723.

Dunker W, Song Y, Zhao Y, Karijolich J. FUS negativno reguliše ekspresiju gena herpesvirusa povezanu sa Kaposijevim sarkomom. Virusi. 2018 Jul 7/6/2018 10(7): PMID: 29986386, PMCID: PMC6070805, PII: v10070359, DOI: 10.3390/v10070359, ISSN: 1999.-4918

Hesser CR, Karijolich J, Dominissini D, He C, Glaunsinger BA. Modifikacija N6-metiladenozina i protein čitača YTHDF2 igraju ulogu specifične za ćelijski tip u ekspresiji litičkih virusnih gena tokom infekcije herpesvirusom povezane s Kaposijevim sarkomom. PLoS Patog. 14. april 2018. (4): e1006995. PMID: 29659627, PMCID: PMC5919695, PII: PPATHOGENS-D-17-02239, DOI: 10.1371/journal.ppat.1006995, ISSN: 1553-7374.

Zhao Y, Dunker W, Yu YT, Karijolich J. Uloga nekodirajuće RNK pseudouridilacije u događajima ekspresije nuklearnih gena. Front Bioeng Biotechnol. 2018 6: 8. PMID: 29473035, PMCID: PMC5809436, DOI: 10.3389/fbioe.2018.00008, ISSN: 2296-4185.

Dunker W, Zhao Y, Song Y, Karijolich J. Prepoznavanje SINE-ova infekcije: Regulacija ekspresije retrotranspozona i modulacija procesa ćelije domaćina. Virusi. 2017 Dec 18/12/2017 9(12): PMID: 29258254, PMCID: PMC5744160, PII: v9120386, DOI: 10.3390/v9120386, ISSN: 1999.-4917

Ge J, Karijolich J, Zhai Y, Zheng J, Yu YT. Tretman 5-fluorouracilom mijenja efikasnost translacionog kodiranja. geni (Basel). 2017 Oct 31/10/2017 8(11): PMID: 29088058, PMCID: PMC5704208, PII: geni8110295, DOI: 10.3390/genes8110295, ISSN: 2073-4

Karijolich J, Zhao Y, Alla R, Glaunsinger B. Mapiranje SINE RNA izazvanih infekcijom u cijelom genomu otkriva ulogu u selektivnom izvozu mRNA. Nukleinske kiseline Res [print-elektronski]. 2017. mart 15.3.2017. PMID: 28334904, PII: 3071714, DOI: 10.1093/nar/gkx180, ISSN: 1362-4962.

Zhao Y, Karijolich J, Glaunsinger B, Zhou Q. Pseudouridilacija 7SK snRNA promoviše formiranje 7SK snRNP radi suzbijanja transkripcije HIV-1 i bijega od latencije. EMBO Rep [print-elektronski]. 2016. 8. 24. 2016. PMID: 27558685, PII: embr.201642682, DOI: 10.15252/embr.201642682, ISSN: 1469-3178.

Huang C, Karijolich J, Yu YT. Detekcija i kvantifikacija RNK 2'-O-metilacije i pseudouridilacije. Metode [štampano-elektronski]. 2016 7. 1. 7. 2016. 103: 68-76. PMID: 26853326, PMCID: PMC4921259, PII: S1046-2023(16)30021-4, DOI: 10.1016/j.ymeth.2016.02.003, ISSN: 1095-9130.

Karijolich J, Yi C, Yu YT. Transkriptomska dinamika pseudouridilacije RNK. Nat. Rev. Mol. Cell Biol [print-elektronski]. 2015. oktobar 16(10): 581-5. PMID: 26285676, PII: nrm4040, DOI: 10.1038/nrm4040, ISSN: 1471-0080.

Karijolich J, Yu YT. Nova era modifikacije RNK. RNA. 2015. april 21(4): 659-60. PMID: 25780180, PMCID: PMC4371322, PII: 21/4/659, DOI: 10.1261/rna.049650.115, ISSN: 1469-9001.

Karijolich J, Abernathy E, Glaunsinger BA. Nekodirajuće RNK izazvane infekcijom iz retrotranspozona povećavaju ekspresiju herpesvirusnog gena putem NF-¿B puta. PLoS Patog. 2015 11(11): e1005260. PMID: 26584434, PMCID: PMC4652899, PII: PPATHOGENS-D-15-02010, DOI: 10.1371/journal.ppat.1005260, ISSN: 1553-7374.

Karijolich J, Yu YT. Terapijska supresija kodona prijevremene terminacije: mehanizmi i klinička razmatranja (pregled). Int. J. Mol. Med [print-elektronski]. 34. avgust 2014. (2): 355-62. PMID: 24939317, PMCID: PMC4094583, DOI: 10.3892/ijmm.2014.1809, ISSN: 1791-244X.

Karijolich J, Zhao Y, Peterson B, Zhou Q, Glaunsinger B. Herpesvirus povezan sa Kaposijevim sarkomom ORF45 posreduje u transkripcijskoj aktivaciji dugog terminalnog ponavljanja HIV-1 preko RSK2. J. Virol [print-elektronski]. 2014. jun 88(12): 7024-35. PMID: 24719417, PMCID: PMC4054375, PII: JVI.00931-14, DOI: 10.1128/JVI.00931-14, ISSN: 1098-5514.

Lim SJ, Scott A, Xiong XP, Vahidpour S, Karijolich J, Guo D, Pei S, Yu YT, Zhou R, Li WX. Zahtjev za CRIF1 u RNA interferenciji i stabilnosti Dicer-2. RNA Biol. 2014 11(9): 1171-9. PMID: 25483042, PMCID: PMC4615304, DOI: 10.4161/rna.34381, ISSN: 1555-8584.

Karijolich JJ, Hampsey M. The Mediator complex. Curr. Biol. 2012 Dec 18/12/2012 22(24): R1030-1. PMID: 23257183, PII: S0960-9822(12)01320-6, DOI: 10.1016/j.cub.2012.11.011, ISSN: 1879-0445.

Karijolich J, Yu YT. Pretvaranje besmislenih kodona u smislene kodone ciljanom pseudouridilacijom. Priroda. 2011. 16. 6. 2011. 474(7351): 395-8. PMID: 21677757, PMCID: PMC3381908, PII: nature10165, DOI: 10.1038/nature10165, ISSN: 1476-4687.

Huang C, Karijolich J, Yu YT. Post-transkripciona modifikacija RNK pomoću veštačkih Box H/ACA i Box C/D RNP. Metode Mol. Biol. 2011 718: 227-44. PMID: 21370052, PMCID: PMC4161979, DOI: 10.1007/978-1-61779-018-8_14, ISSN: 1940-6029.

Karijolich J, Yu YT. Spliceosomalne snRNA modifikacije i njihova funkcija. RNA Biol [print-elektronski]. 2010. mart 7(2): 192-204. PMID: 20215871, PMCID: PMC4154345, PII: 11207, ISSN: 1555-8584.

Karijolich J, Kantartzis A, Yu YT. Kvantitativna analiza RNA modifikacija. Metode Mol. Biol. 2010 629: 21-32. PMID: 20387140, PMCID: PMC4154561, DOI: 10.1007/978-1-60761-657-3_2, ISSN: 1940-6029.

Karijolich J, Kantartzis A, Yu YT. RNA modifikacije: mehanizam koji modulira ekspresiju gena. Metode Mol. Biol. 2010 629: 1-19. PMID: 20387139, PMCID: PMC4154353, DOI: 10.1007/978-1-60761-657-3_1, ISSN: 1940-6029.

Karijolich J, Yu YT. Uvid u proteinske komponente kutije H/ACA RNP. Curr Proteomics. 2008, 7/1/2008 5(2): 129-37. PMID: 19829749, PMCID: PMC2760984, DOI: 10.2174/157016408784911936, ISSN: 1570-1646.

Moelling C, Oberschlacke R, Ward P, Karijolich J, Borisova K, Bjeloš N, Bergeron L. Metal-ovisna represija siderofora i formiranja biofilma kod Actinomyces naeslundii. FEMS Microbiol. Lett [print-elektronski]. 2007. oktobar 275(2): 214-20. PMID: 17825071, PII: FML888, DOI: 10.1111/j.1574-6968.2007.00888.x, ISSN: 0378-1097.

Karijolich J, Stephenson D, Yu YT. Biohemijsko prečišćavanje box H/ACA RNP-ova uključenih u pseudouridilaciju. Meth. Enzimol. 2007 425: 241-62. PMID: 17673087, PII: S0076-6879(07)25011-6, DOI: 10.1016/S0076-6879(07)25011-6, ISSN: 0076-6879.

Copyright © 2021 Vanderbilt University. Imate problem?
Univerzitet Vanderbilt posvećen je principima jednakih mogućnosti i afirmativne akcije.


Shou-Jiang (SJ) Gao, Ph.D.

Glavno područje istraživanja u laboratoriji dr. Gaoa bila je virusna onkogeneza sa trenutnim fokusom na Kaposijev sarkom povezan herpesvirus (KSHV) i maligne bolesti povezane sa AIDS-om. Laboratorija se bavi multidisciplinarnim naporom i širi program istraživanja na translacionu terapiju i terapiju raka, metabolizam raka, mikrobiotu, upalu, angiogenezu, urođeni imunitet i mikroRNA. Laboratorija je primijenila najsavremenije pristupe i tehnologije u genomici, epigenetici, RNA epigenetici, metabolomici, visokopropusnom genomskom skriningu, visokopropusnom skriningu lijekova i sistemskoj biologiji kako bi se pozabavila ovim glavnim biomedicinskim problemima. Konkretno, laboratorija je nedavno investirala u skrining i otkrivanje lijekova kao rezultat identifikacije novih terapijskih ciljeva i razvoja novih modela sistema za infekcije i karcinome. Laboratorija dr. Gaoa je dobro podržana vanrednim finansiranjem. Trenutno postoji 6 aktivnih R01 i 1 pod-projekat aktivnog PPG-a. Evo nekih od tekućih istraživačkih pravaca i projekata:

1. Skrining i otkrivanje lijekova: Laboratorija je razvila nekoliko modela raka i infekcije i koristila ih u Crispr-Cas9 posredovanom skriningu u cijelom genomu i skriningu lijekova. Laboratorija je već identifikovala brojne nove mete i agense, za koje se pokazalo da su efikasni u in vitro i in vivo modelima.

2. Sistemska biologija: Laboratorija se bavila radovima iz epigenetike, RNA epigenetike i metabolomike kod raka i infekcija.

3. Infekcije, upale i urođeni imunitet: Laboratorija nastavlja proučavati mikroRNA, upalu, angiogenezu, urođeni imunitet i infekcije.

Representative Publications

Graffaz M, Zhou SH, Vasan K, Rushing T, Michael QL, Lu C, Jung JU, Gao S-J. Prenamjena citarabina za liječenje primarnog efuzijskog limfoma ciljanjem KSHV latentnih i litičkih replikacija. mBio, 2018, 9: e00756-18.

Tan B, Liu H, da Silva SR, Yuan HF, Sorel O, Zhang L, Meng J, Huang YF, Gao SJ. Virusni i ćelijski epitranskriptomi N6-metiladenozina i N6,2'-O-dimetiladenozina u životnom ciklusu KSHV. Nature Microbiology, 2018, 3:108-120

Graffaz M, Vasan K, Tan B, da Silva SR, Gao SJ. Upala posredovana TLR4 potiče KSHV-indukovanu ćelijsku transformaciju i tumorigenezu aktiviranjem STAT3 puta. Istraživanje raka, 2017, 77:7094-7108.

Zhu Y, Li TT, da Silva SR, Jae-Jin Lee, Lu C, Hyungjin Eoh, Jung JU, Gao SJ. Kritična uloga glutamina i asparagin γ-azota za biosintezu nukleotida u ćelijama raka koje je oteo onkogeni virus. mBio, 2017, 8. pii: e01179-17. doi: 10.1128/mBio.01179-17.

Zhu Y, da Silva SR, Liang QM, Lu C, Feng PH, Jung JU, Gao SJ. Supresija glikolize KSHV-om potiče preživljavanje stanica i onkogenu transformaciju. PLoS Pathogens, 2016, 12: e1005648.

Lee MS, Jones T, Song DY, Jang JH, Jung JU, Gao S-J. Eksploatacija sistema komplementa od strane onkogenog herpesvirusa povezanog sa Kaposijevim sarkomom za preživljavanje ćelija i trajnu infekciju. PLoS Pathogens, 2014, 10: e1004412.

Moody R, Zhu Y, Huang YF, Cui XD, Jones T, Bedolla R, Lei XF, Bai ZQ, Gao S-J. KSHV mikroRNA posreduju u ćelijskoj transformaciji i tumorigenezi redundantno ciljajući ćelijski rast i puteve preživljavanja. PLoS Pathogens, 2013, 9: e1003857.

Greene W, Zhang W, He ML, Witt C, Ye FC i Gao S-J. Ubikvitin/proteasomski sistem reguliše ulazak herpesvirusa povezan sa Kaposijevim sarkoma u endotelne ćelije. PLoS Pathogens, 2012, 8: e1002703.

Jones T, Ye FC, Bedolla RG, Huang YF, Meng J, Qian LW, Pan HY, Zhou FC, Moody R, Wagner, B, Arar M i Gao S-J. Direktna efikasna ćelijska transformacija primarnih metanefričnih mezenhimalnih ćelija pacova pomoću KSHV. Journal of Clinical Investigation, 2012, 122, 1076-1081.

Lei XF, Bai ZQ, Ye FC, Xie JP, Kim CG, Huang YF i Gao S-J. Regulacija NF-kB inhibitora IkBa i replikacije virusa pomoću KSHV mikroRNA. Nature Cell Biology, 2010, 12, 193-199.