Informacije

Tumačenje qPCR krivulja: kako pronaći Ct vrijednost u mom slučaju?

Tumačenje qPCR krivulja: kako pronaći Ct vrijednost u mom slučaju?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Čitam svoje qPCR rezultate i nemam pojma zašto se vrijednost Ct vraća ovako:

Ovo je qPCR kriva mojih uzoraka, a softver je vratio Ct vrijednosti za većinu krivulja kao što se vidi: 33,99-38,4 za krive koje imaju nižu osnovnu liniju. Problem su 2 krivulje (plava i crna) sa višom baznom linijom na prvom mjestu. Pročitao sam Ct vrijednosti ovih krivulja kao 32-33, ali softver kaže da su vrijednosti Ct 35,4 za ove krive.

Šta bi mogao biti problem i koji bi bio pravi odgovor, moje vrijednosti ili softver? Hvala unaprijed!


Softver je ispravan. Vrijednosti $C_t$ su odabrane da budu dovoljno iznad pozadine. Kao što vidite, nivo pozadine je veoma različit za dve krive, tako da ne možete koristiti isti prag signala za određivanje njihovog $C_t$.


Interpretacija oblika qPCR krive.

U ovomjesečnom ispitivanju tema od interesa u laboratoriji za molekularnu dijagnostiku, pogledat ćemo radnu snagu mnogih singleplex ili multipleks metoda niske pletenosti – lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (PCR) – i razmotriti koju vrstu informacije koje možemo dobiti iz oblika krivulje pojačanja. Zapažanja koja ćemo razmotriti podjednako su važeća i za metode u realnom vremenu zasnovane na sondi i za vezujuće boje, i, kao što ćemo otkriti u nastavku, mogu pružiti izuzetan stepen uvida u ono što bi se moglo dešavati u reakcionoj bušotini.

Počnimo s razmatranjem klasičnog, "normalnog" oblika krivulje qPCR amplifikacije kao što je prikazano na slici 1. Kao što je općenito prikazano, ovo je sigmoidalni oblik sa onim što ćemo nazvati kao tri vizualno različite prividne faze ili regije. Prva faza (do otprilike 15. ciklusa na slici 1) je blizu osnovne linije sa sporim uzlaznim trendom u liniji. Druga faza je snažan uzlazni zamah u liniji, između otprilike 15. i 30. ciklusa naše zamišljene figure podataka. Konačno, treća faza, od otprilike 30. ciklusa nadalje, je plato gdje se signal pojačanja smanjuje i prestaje da raste.

Dvije tačke na krivulji nas posebno zanimaju. Jedna je CT vrijednost, iako tačna definicija zavisi od softverskih algoritama instrumenta, ovo je u osnovi tačka u kojoj se kriva prvo jasno podiže od osnovne linije do statistički značajnog stepena. (U zavisnosti od vašeg instrumenta i softvera, ovo se može alternativno nazvati CP). Prelazak ovog statističkog praga šuma je osnova za nazivanje uzorka pozitivnim u kvalitativnom testu, a broj ciklusa u kojem se javlja je osnova za generisanje standardne krive i kvantitaciju početnog šablona u kvantitativnom PCR-u. Druga tačka - koja nije posebno zanimljiva za svakodnevnu kliničku laboratoriju, ali je ovdje relevantna - je tačka na sredini prividne "druge faze" krivulje, gdje postoji neprimjetna promjena u odnosu na krivu koja raste u nagibu svakim ciklusom , na smanjenje nagiba svakog ciklusa, ili ono što bi matematičar nazvao prevojnom tačkom.

Zatim, važno je shvatiti da kriva pojačanja prikazana na vašem ekranu nisu (generalno) neobrađeni podaci. Obrađen je kroz softver instrumenta za primjenu filtera kanala specifičnih za fluorofore ili kompenzaciju i za uklanjanje pozadinske buke, a moguće je i podvrgnut algoritmima za izravnavanje. Vertikalne ose najčešće nisu totalna fluorescencija, već promjena fluorescencije po ciklusu. U stvari, ako možete pogledati čistu sirovu fluorescenciju u odnosu na podatke ciklusa (a na većini sistema postoje načini da se to uradi), podaci neće mnogo ličiti na našu lijepu sigmoidnu krivu. Različite obrade sirovih podataka kako bi se napravila naša tradicionalna krivulja pomažu da se lakše interpretiraju, ali treba imati na umu jer u nekim slučajevima to može dovesti do pogrešnih zaključaka.

Imajući sve to na umu, razmislimo o tome šta uzrokuje da obrađena kriva ima karakterističan oblik kao na slici 1. Prva prividna faza – malo ili nikakav signal – prvenstveno nastaje zbog ograničenja osjetljivosti instrumenta. Čak iu hipotetičkoj savršenoj PCR reakciji sa savršenim dvostrukim pojačanjem po ciklusu počevši od jedne kopije šablona, ​​instrumenti jednostavno ne mogu "vidjeti" fluorescentni signal iz pojačanja dok ne dostigne određeni nivo. To ne znači da se u ovim ranim ciklusima ne detektuje pozadinski fluorescentni signal i da fluktuira, ali "pravi" signal proizvoda je beznačajno mala komponenta ovog signala.

Ova pozadinska buka je zapravo korisna u mnogim instrumentima, njeno mjerenje se koristi za postavljanje CT praga kao nekog statistički relevantnog povećanja izvan opsega šuma. (To jest, svaki signal koji je dovoljno daleko iznad ovog nivoa signala smatra se da dolazi od amplikona.) Stoga očekujemo da će ova faza ranog ciklusa u suštini biti "ravna" u našoj krivulji pojačanja, au nekim sistemima ovo očekivanje primjenjujemo kao alat: pretpostavlja se da je svaki mali trend drifta pozadinske buke posljedica promjena u samim fluoroforima (propadanje reportera ili gasitelja zbog termičkog ciklusa). Algoritmi za oduzimanje pozadine općenito djeluju tako da osiguraju da ova rana faza krivulje pojačanja izgleda ravno. Neki čak idu tako daleko da aktivno ispravljaju bilo koje trendove u signalu koji su otkriveni u ovoj fazi, dodajući ili oduzimajući ovu količinu da bi "izravnali" područje rane krivulje.

Druga prividna faza se javlja kada fluorescentni signal izveden iz amplikona zapravo postane dovoljno jak da ga instrument pouzdano detektuje. U nekom ranom trenutku ovoga, CT vrijednost se prelazi, a naš test daje pozitivan rezultat (i dobijamo CT broj ciklusa koristan za kvantitaciju, ako se želi). PCR proces je dvostruki eksponencijalni rast po ciklusu i otkrivanje ovoga dovodi do jake, ravne faze "rasta krivulje" u najčešćim oblicima dijagrama amplifikacije.

Međutim, kao iu svakoj ekonomiji, korištenje ograničenih resursa (prajmera, nukleotida, pa čak i aktivnosti enzima na raspolaganju) u reakcionoj posudi na kraju počinje ograničavati rast, PCR više ne može raditi na svoju teoretsku maksimalnu neograničenu efikasnost resursa (šta god to bilo savršenih 2,0 po ciklusu, ili nešto manje). Ova tačka u kojoj se ograničenje resursa prvo polako javlja, je naša prelomna tačka koja je gore pomenuta i kako ograničenje resursa postaje sve ozbiljnije, kriva pojačanja pada i konačno postaje plato u našoj trećoj fazi, efektivno iscrpljeni resursi i nesposobni da dalje rastu.

PCR kriva amplifikacije koja izgleda kao na slici 1 općenito je znak "zdrave" dobre PCR reakcije. Kao direktnu mjeru toga, zapravo bismo mogli ući i izmjeriti nagib naše krive tokom ranog dijela (prije tačke infleksije) druge faze krivulje. U zavisnosti od tačnog oblika ose krivulje, izvodi se različita matematika, ali rezultat je merenje "N" u jednačini N^(broj ciklusa), gde savršeno efikasan PVR ima N=2 (udvostručavanje svakog ciklusa) real- svjetski dobri testovi uglavnom spadaju u raspon N>1.9. Mnogi softverski paketi mogu direktno pružiti korisniku N za dati PCR test, bilo izvan jedne krive (kao što je ovdje opisano) ili van krive standardnog razrjeđenja.

Druga mjera koju možemo uzeti iz zdrave krivulje amplifikacije je CT vrijednost kao što je gore diskutovano, ili zapravo koliko kasno u ciklusu počinje regija faze 2. Naravno, ne smijemo dodijeliti nikakvu korelaciju između vrijednosti fluorescencije u području platoa faze 3 i početne koncentracije šablona. (Ako je vaš autor elaborirao ovu tačku tokom tri godine ove serije, to je zato što je to i dalje preuobičajena zabluda!)

Iako je poznavanje tačnog broja nagiba korisno (ako ustanovite da je on 1,6, vašem testu je potrebna optimizacija uslova), čak je i poređenje oblika krive "iz oka" korisno. Ako vaša kriva ima slabu (nizak nagib) ili čak nerazlučivu fazu 2 kao što je naša slika 2, nešto nije u redu. Ako je ovo generalno zapažanje vašeg testa na čistim standardnim materijalima, onda bi prva stvar koju treba uzeti u obzir bila bi vrijednost Tm ciklusa. Ako je ovo previsoko, vaši amplifikacijski prajmeri se ne mogu vezati na svoja prajmerska mjesta što je moguće efikasnije, smanjujući vašu maksimalnu efikasnost po ciklusu i dovodeći do "sporo" (niskog nagiba) područja faze 2. Ako je ovo jednokratno opažanje na jednom uzorku, a vaš kontrolni materijal pokazuje "jaku" (strmi nagib) fazu 2 u poređenju, onda je vjerojatnije da imate primjer inhibicije PCR specifične za uzorak, na visokom nivou dovoljno da ometa efikasnost (što znači da su svi kvantitativni podaci koje pokušate protumačiti iz CT-a na tom uzorku vjerovatno pogrešni, s kasnijim CT-om od očekivanog), ali očito ne na dovoljno visokom nivou da bi dali potpuno negativan rezultat.

Slična krivulja može se pojaviti i iz vrlo različitih razloga. Ako vaši PCR prajmeri imaju vrlo slabu specifičnost (vjerovatno zbog preniskog Tm, što im omogućava da se vezuju neselektivno), tada je moguće istovremeno imati mnogo različitih "slučajnih" amplikona različite efikasnosti koji se svi stvaraju odjednom u reakciji. Ovo nadmetanje između reakcija i njihovog pojedinačnog udaranja u različite "faze" reakcije u različito vrijeme, dovodi do oblika krivulje sličnije slici 2, jer njihovi agregatni fluorescentni signali ugušuju različite regije faze 2 i faze 3.

(Imajte na umu da bi u većini slučajeva ovo bilo potencijalno zapažanje u testovima vezanim na bazi boja, koji, za razliku od testova baziranih na sondi, nisu specifični u signaliziranju samo signala iz željenih ciljnih sekvenci, ovo je jedan od značajnih razloga za preferenciju sonde eseji zasnovani na vezivanju na bazi boja, jer se ova vrsta greške efektivno "gurne pod tepih." Međutim, u nekim nesrećnim slučajevima, nusproizvodi mogu imati dovoljno homologije sekvence sa sondama da daju signal tako da ova vrsta posmatranja može se javljaju, iako rjeđe, u testovima baziranim na sondi. Stoga, bez obzira na metodologiju, valjanost tumačenja krive amplifikacije sa slabom regijom faze 2 treba gledati sa određenom sumnjom.)

Konačno, šta je sa oblikom krive kao što je prikazano na slici 3? Iako se na prvi pogled može činiti bizarnim, ovaj oblik krivulje koji se nerijetko sreće zapravo je vrlo karakterističan za vrlo specifičnu reakciju: kada se primjenjuju određeni softverski algoritmi. Iako ova kriva završava ispod CT praga i neko bi mogao biti u iskušenju da reakciju nazove negativnom, zapravo je tačno suprotno: ova kriva nastaje zbog izuzetno visoke početne ciljne koncentracije šablona.

Podsjetimo odozgo da neki softver prisiljava region faze 1 da izgleda ravno, dodavanjem ili oduzimanjem bilo kakvih trendova krivulje otkrivenih u ranim ciklusima pod pretpostavkom da oni proizlaze iz promjena u pozadini fluorofora i da je sav signal ranog ciklusa šum. Ako umjesto toga, reakcija započne s tako velikim opterećenjem šablona da već ima detektljiv stvarni signal u ovim ranim ciklusima (to jest, analiza je efektivno prošla pravi CT u vrlo ranom ciklusu), tada se ovi algoritmi pozadinske korekcije sada uklanjaju. stvarni, ciljni signal.

Ovo oduzimanje realnog signala ima grafički rezultat efektivnog rotiranja krive pojačanja oko početka ose. Faza 1, koja bi trebala nagnuti prema gore, sada izgleda ravno ili čak blago opadajuća. Faza 2 se pojavljuje, ali budući da je njena stvarna stopa rasta nedovoljno prijavljena, izgleda "slabo" i u nekim slučajevima možda neće preći CT liniju. Konačno, faza 3, gdje se javlja stvarni plato, sada izgleda kao regija negativnog nagiba, budući da nijedan rast minus rastuća "pozadina" ne daje negativnu vrijednost.

Iako je ovaj oblik krivulje amplifikacije sam po sebi gotovo definitivan, ako softver instrumenta koji se koristi postavlja CT vrijednosti specifične za reakciju, drugi nagovještaj da se to događa je kada je CT prag vrlo visok u poređenju s kontrolama ili drugim uzorcima koji se dobro ponašaju, tj. pozadinski signali su mnogo veći od normalnog. Srećom, ako se posmatra ovaj lako prepoznatljiv oblik krivulje, dokazivanje osnovnog uzroka se lako može uraditi ponavljanjem testa na jako razblaženom uzorku (1/10 000 bi bio razuman izbor). Alternativno, neki softverski paketi dozvoljavaju korisniku da uđe i ručno isključi korekciju pozadine, čineći tako da u ovom slučaju odmah daje "pravu" krivu pojačanja (predstavljena kao Slika 3, neispravljena linija). Imajte na umu da su važeće CT vrijednosti za kvantitaciju, međutim, moguće postići samo razrjeđivanjem i ponovnim testiranjem, ali za čisto kvalitativni rezultat, onemogućavanje pozadinske korekcije može biti dovoljno za odgovarajuće pozivanje rezultata.

Iako gore navedeno predstavlja samo mali podskup stvari koje nam krive PCR amplifikacije u realnom vremenu mogu reći, nadamo se da je ovaj pregled bio informativan i izazvao interesovanje čitaoca. Ako je tako, može biti vrlo poučno uzeti skup podataka za PCR u stvarnom vremenu i (gdje to podržava određeni softver) eksperimentirati s promjenom parametara korekcije pozadine (početni i završni ciklusi, ili pozadinsko uključivanje ili isključivanje) također kao opcije izglađivanja krivulja, kao što je usrednjavanje vagona, i gledanje kakve efekte one imaju na prikazane oblike krivih. Poznavanje koje proizilazi iz ovoga može biti korisno u rješavanju problema sljedeći put kada se pojavi neobična qPCR kriva amplifikacije - a velike su šanse da to nije daleko u vašoj budućnosti.

John Brunstein, dr., član je Uredničkog savjetodavnog odbora MLO-a. On služi kao predsjednik i glavni naučni službenik za PathoID, Inc., sa sjedištem u Britanskoj Kolumbiji, koji pruža konsalting za razvoj i validaciju molekularnih testova.


Provjerite svoju metodu

Postoje dva glavna načina za analizu qPCR podataka: dvostruka delta Ct analiza i metoda relativne standardne krive (Pfaffl metoda). Obje metode prave pretpostavke i imaju svoja ograničenja, tako da će metoda koju trebate koristiti za svoju analizu ovisiti o vašem eksperimentalnom dizajnu.

Dvostruka delta Ct analiza pretpostavlja da:

  • postoji jednaka efikasnost prajmera između setova prajmera (tj. unutar 5%)
  • postoji skoro 100% efikasnost amplifikacije referentnih i ciljnih gena
  • geni unutrašnje kontrole su stalno eksprimirani i na njih ne utiče tretman.

Metoda općenito služi za eksperimente s velikim brojem uzoraka DNK i malim brojem gena za testiranje.

Metoda relativne standardne krive pretpostavlja da:

Ova metoda radi bolje ako imate manje uzoraka DNK, ali veći broj gena za testiranje.


Metode analize

Za razliku od apsolutne kvantifikacije količine mRNA u uzorku, relativna kvantifikacija koristi internu kontrolu (referentni gen) i/ili kontrolnu grupu (referentna grupa) za kvantificiranje mRNA od interesa u odnosu na ove reference. Ova relativna kvantifikacija dovoljna je za izvođenje zaključaka u većini biomedicinskih aplikacija koje uključuju qPCR. Razvijeno je nekoliko metoda za izvođenje ove relativne kvantifikacije. Ove metode zahtijevaju različite pretpostavke i modele. Ovdje su objašnjene najčešće dvije od ovih metoda.

Komparativne (C_T) metode

Komparativne (C_T) metode pretpostavljaju da cDNK šabloni gena od interesa kao i kontrolni/referentni gen imaju sličnu efikasnost amplifikacije. I da je ova efikasnost pojačanja skoro savršena. Što znači, na određenom pragu tokom linearnog dijela PCR reakcije, količina gena od interesa i kontrole se udvostručuju u svakom ciklusu. Druga pretpostavka je da se razlika u ekspresiji između dva gena ili dva uzorka može uhvatiti oduzimanjem jednog (gena ili uzorka od interesa) od drugog (referenca). Ova konačna pretpostavka također zahtijeva da se ove reference ne mijenjaju s tretmanom ili kursom o kojem je riječ.
Formalna derivacija dvostrukog delta (C_T) modela je opisana ovdje (Livak i Schmittgen 2001). ukratko,
(DeltaDelta C_T) daje:

[ DeltaDelta C_T = Delta C_ - Delta C_ ]

I relativni izraz:

  • (Delta C_) je razlika u (C_T) (ili njihovom ) od a gen od interesa i a referenca gen u grupi od interesa
  • (Delta C_) je razlika u (C_T) (ili njihovom ) od a gen od interesa i a referenca gen u a referenca grupa

A termin greške je dat:

Standardne metode krive

Za usporedbu, ovaj model ne pretpostavlja savršeno pojačanje, već aktivno koristi pojačanje u izračunavanju relativnog izraza. Dakle, kada je efikasnost amplifikacije svih gena 100% obje metode bi trebale dati slične rezultate. Metoda standardne krive se primjenjuje u dva koraka. Prvo, serijska razrjeđenja mRNA iz uzoraka od interesa se koriste kao ulaz za PCR reakciju. Linearni trend ulaznog iznosa dnevnika i rezultirajuće vrijednosti (C_T) za svaki gen se koriste za izračunavanje presjeka i nagiba. Drugo, ovi presjeci i nagibi se koriste za izračunavanje količine mRNA gena od interesa i kontrole/reference u uzorcima od interesa i kontrolnom uzorku/referenci. Ovi iznosi se konačno koriste za izračunavanje relativnog izraza na način sličan kasnijoj metodi, samo koristeći dijeljenje umjesto oduzimanja.
Formalna derivacija modela je opisana ovdje (Yuan et al. 2006). ukratko,
Količina RNK u uzorku je data kao:

A relativni izraz je dat:

(C_T) je prag ciklusa gena

A termin greške je dat:

(cv) je ili relativna standardna devijacija


Kako PCR zapravo otkriva COVID-19?

Kao što smo ranije spomenuli, PCR testovi su dizajnirani da traže virus&rsquo genetski materijal. Budući da koronavirusi nemaju DNK, prvi korak PCR testiranja je pretvaranje virusne RNK u DNK u procesu koji se naziva reverzna transkripcija. To je zato što je DNK mnogo stabilnija od RNK. PCR mašina zatim pravi milione kopija DNK pokretanjem više &ldquociklusa&rdquo (poput mašine za pranje veša). Ovaj proces se naziva amplifikacija i izuzetno je važan u pronalaženju čak i najmanjih količina DNK. Kako se izvodi više ciklusa, stvara se više kopija DNK &mdashudvostručujući svaki put kada se kopira &mdashand što olakšava pronalaženje. Ako se dio DNK ne može kopirati, u uzorku nema virusa ili je tako mala količina da ga čak ni ovaj vrlo osjetljiv test ne može otkriti.


Koja je CT vrijednost u Covid-19 RT-PCR testu | Sve što treba da znaš

Nedavno, u pismu ministru za zdravstvo Maharaštre, šef Indijskog vijeća za medicinska istraživanja (ICMR) dr. Balram Bhargava rekao je niže prag za određivanje da je uzorak pozitivan na Covid povećalo bi stopu prenošenja bolesti.

Suočen sa neviđenim porastom slučajeva Covid-19, Maharaštra je zatražila od Centra da ponovo razmotri norme za testiranje na Covid. ICMR je odgovorio da će predložena revizija u kriterijima pozitivnosti uzrokovati da se previše infekcija propusti i dalje prenijeti bolest.

Prema ICMR-u, trenutni kriteriji pozitivnosti temelje se na pragu ciklusa (CT), koji je mjera koliko brzo nakon RT-PCR testa, SARS-CoV-2 se otkriva u uzorku.

Kako se uzorci kreću kroz cikluse, što se prije otkrije virus, pretpostavlja se da će virusno opterećenje biti veće.

"Svi pacijenti sa CT vrijednošću jednakom ili manjom od 35 mogu se smatrati pozitivnim, dok se oni sa CT vrijednošću većom od 35 mogu smatrati negativnim. Svi uzorci sa CT vrijednošću jednakom ili manjom od 35, što se vidi kao lošu sigmoidnu krivu, u suštini treba ponovo testirati. Implementacija CT vrijednosti od 24 uopće nije preporučljiva jer bi to dovelo do nestanka nekoliko infektivnih pacijenata i povećalo prijenos bolesti", navodi se u pismu od 5. aprila.

ICMR navodi da je globalno prihvaćena granica za CT vrijednost za Covid-19 u rasponu od 35-40, ovisno o uputama koje su postavili pojedinačni proizvođači.

ŠTA JE CT VRIJEDNOST?

CT se odnosi na broj ciklusa potrebnih da se virusna RNK pojača do nivoa koji se može detektovati

KAKO SE ODREĐUJE CT VRIJEDNOST?

Ovo može postati malo tehničko -

Kada se uzorak prikupi, RNA se ekstrahuje i tretira enzimom reverzne transkriptaze.

Komplementarna DNK se ekstrahuje iz početne RNK

Sada se DNK može lako umnožiti upotrebom lančane reakcije polimerizacije kako bi se napravile milijarde kopija fragmenta.

DNK se umnožava svakim ciklusom
Svaki ciklus amplificira DNK za dvostruko x2

KAKO SE MJERI?

DNK se mjeri u realnom vremenu signalima fluorescentne boje. Ovo nam pomaže da izračunamo CT VRIJEDNOST

Podaci o fluorescentnim signalima prikupljeni u eksponencijalnoj fazi su zabilježeni - ovo je početna količina ciljne DNK

Samo za primjer, ako postoje dva uzorka: jedan sa 100 ng cDNK - manje ciklusa da bi se mogao otkriti - dat će mi nižu vrijednost

Drugi sa 25 ng cDNK - - treba više ciklusa - veća vrijednost.

NIŽA CT VRIJEDNOST = VEĆE virusno opterećenje
VEĆA CT VRIJEDNOST = MANJE VIRALNO OPTEREĆENJE

ZAŠTO TREBA DA ME BI BILO BILO?

Dr Samiran Panda, šef epidemiologije i zaraznih bolesti u ICMR-u, rekao je: "U situaciji bolesti, ako uzorak koji je sakupljen pokazuje da je virusno opterećenje nisko, CT vrijednost ima obrnutu vezu. S niskim ciklusom, možete dobiti pozitivan rezultat ako je vrijednosno opterećenje visoko.Ako smanjite CT vrijednost, to će predstavljati ozbiljan problem jer je osoba još uvijek zaražena, imala bi nisko virusno opterećenje - osoba bi bila negativna. možda ima bolest, možda neće tražiti liječenje. Lažno negativni rezultati mogli bi prenijeti infekciju na porodicu i društvo."

"Osoba ne znači da će biti strašno bolesna. Još uvijek mogu biti u kućnoj izolaciji, ali pazim na svoje zdravlje. Ako pazimo na zasićenost kiseonikom, klinički znaci i simptomi pomoći će doktorima da donesu dobre kliničke odluke. To je jedan od kliničkih alata u kombinaciji s ostalim simptomima", rekao je dr. Samiran Panda

Zašto bi onda Maharashtra gledala na smanjenje CT vrijednosti? "Većina proizvođača RT-PCR kompleta, ili onih koji reproduciraju komplete, 35-40 je slučaj, sve iznad 40 je negativno. To nije vrlo razborita zdravstvena praksa: visoko virusno opterećenje će se otkriti, a nisko virusno opterećenje neće biti otkriven. Ali u vrijeme kihanja, on/ona bi mogao širiti infekciju", rekao je dr Panda.

Trebaju li doktori ozbiljno shvatiti vrijednost CT-a kada pacijentima propisuju liječenje covid-19? "To je povezano sa ozbiljnošću bolesti? Nikako. To je samo povezano sa ozbiljnošću bolesti. Pacijent može imati visoku CT vrijednost, ali i dalje imati vrlo značajan nivo infekcije covid19, pacijent može imati niska CT vrijednost, ali pacijent može biti asimptomatski. Mnogi faktori kao što su uzimanje uzorka, koji dan je uzet, gdje je pohranjen, koji su reagensi korišteni", rekao je dr Dhiren Gupta, viši intenzivista u bolnici Sir Ganga Ram .

Neke studije sugeriraju da niže vrijednosti CT-a mogu biti povezane s pogoršanjem simptoma, iako mnogi stručnjaci kažu da je takvu linearnu korelaciju teško uspostaviti.


Metode

Uslovi uzgoja i uzorkovanje

Oplođena jaja romba su dobijena ukrštanjem jedne ženke sa dva mužjaka i uzgajana u rezervoarima u Instituto Oceanográfico de Vigo na tri različite temperature (15°C, 18°C ​​i 23°C). Uzorci su uzeti u sljedećim fazama: 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120 i 135 dana nakon oplodnje (dpf). Na svakoj tački uzorkovanja uzeto je 10 jedinki po temperaturi (3×10) i njihove gonade su izrezane što je preciznije moguće. Konačan broj testiranih uzoraka bio je 240: osam različitih razvojnih faza, trideset uzoraka gonada po fazi (deset po svakoj temperaturi). Uzorci su odmah ugrađeni u RNA kasnije radi očuvanja (Qiagen, Valencia, CA). Muške i ženske spolne žlijezde mogu se razlikovati na 90 dpf histološkim putem (Cal R, Lluch N, Martínez P. Diferencijacija spola gonada kod romba (Scophthalmus maximus). U pripremi) i mikromrež (Ribas L, Robledo D, Viñas A, Martínez P, Piferrer F. Transkriptomska studija procesa diferencijacije spola kod romba. U pripremi). također, cyp19a sirove vrijednosti ekspresije pomoću qPCR-a mogu savršeno razlikovati ženke od mužjaka počevši od 105 dpf (Dodatna datoteka 2: Slika S1).

Životinje su tretirane u skladu sa Direktivom 2010/63/UE Evropskog parlamenta i Vijeća od 22. septembra 2010. o zaštiti životinja koje se koriste u eksperimentalne i druge naučne svrhe. Svi eksperimentalni protokoli odobreni su od strane Komiteta za institucionalnu negu i upotrebu životinja Univerziteta Santiago de Compostela (Španija).

Izolacija RNK i sinteza cDNK

Ukupna RNK ekstrahirana je homogenizacijom u TRIZOL-u (Invitrogen, Paisley, UK) prema protokolu proizvođača. Ukupna RNK je tretirana sa rekombinantnom DNazom I bez RNaze (Roche Diagnostics, Mannheim, DE) i koncentracija RNK je procijenjena spektrofotometrijom i njen kvalitet je provjeren korištenjem Agilent 2100 bioanalizera (Agilent Technologies, Santa Clara, SAD). Ukupna RNK (1,2 μg) je reverzno transkribovana nasumičnim prajmerima koristeći AffinityScript Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit (Agilent Technologies) prema protokolu proizvođača, a zatim razrijeđen 1:2 vodom bez nukleaza.

PCR u realnom vremenu

PCR u realnom vremenu izveden je na termocikleru Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies) koristeći Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green qPCR Master Mix u konačnoj zapremini od 12,5 μL prema protokolu proizvođača sa 1 μL cDNK po reakciji. Gene-specifični prajmeri za referentne gene RPL17 (ribosomalni protein L17), B2M (Beta-2-mikroglobulin) i ACTB (beta-aktin) dobijeni su iz [5] i prajmeri za UBQ (ubikvitin), RPS4 (Ribozomalni protein S4) i GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza) dizajnirani su u našoj laboratoriji (tabela 11). Specifičnost za svaki par prajmera je prvo proverena profilom krive topljenja, a zatim potvrđena sekvenciranjem PCR proizvoda. RPL17, B2M i ACTB izabrani su kao pretpostavljeni referentni geni jer su bili među najstabilnijim genima u prethodnoj studiji koristeći različita tkiva u romba [5], dok UBQ, RPS4 i GAPDH su izabrani zbog njihove opće upotrebe u mnogim studijama na drugim vrstama i pokazali su se stabilno eksprimiranim u studiji na mikromrežu provedenoj u našoj laboratoriji (neobjavljeni podaci). U našoj laboratoriji dizajnirani su i genski specifični prajmeri za šest ciljnih gena uključenih u spolnu diferencijaciju (CYP19a, AMH, SOX9, SOX19, SOX17 i VASA) (Tabela 11), a amplifikacija je izvršena po istom postupku. Koncentracija prajmera bila je 300 nM i svaki uzorak je rađen u duplikatu. Parametri ciklusa su bili: 50°C 2 min, 95°C 10 min, nakon čega je slijedilo 40 ciklusa amplifikacije na 95°C u trajanju od 15 sekundi i 60°C u trajanju od 1 min. Konačno, nakon amplifikacije je izveden korak disocijacije kako bi se osiguralo prisustvo jednog proizvoda amplifikacije. Svi uzorci (240) su analizirani za svaki gen. Provedena je strategija maksimizacije uzorka, što znači da je što više uzoraka stavljeno na jednu ploču, i tako je svaki gen testiran u minimalnoj mogućoj količini ploča. U svaku PCR ploču uključene su kontrole bez šablona kako bi se potvrdilo odsustvo kontaminacije. Osim toga, tri uzorka (interplate kalibratori) su rađena u tri primjerka na svakoj ploči kako bi se ispravila varijacija između testova, svaka vrijednost Cq na ploči je korigirana dodavanjem ili oduzimanjem razlike između srednje vrijednosti kalibratora međuploča na ploči i njihove ukupne srednja vrijednost za sve ploče [38]. PCR podaci u realnom vremenu su dobijeni pomoću softvera MxPro (Agilent Technologies) i vrijednosti ciklusa kvantifikacije (Cq) su izračunate za svaku repliku i zatim usrednjene da bi se dobila konačna vrijednost Cq. Prag fluorescencije za određivanje Cq bio je isti za šest gena, prag zasnovan na pozadini određen je za šest gena odvojeno, a najviši je primijenjen za šest gena.

Referentna genska analiza

Ukupno šest referentnih gena je odabrano za analizu ekspresije gena u gonadi romba (Tabela 1). Njihova stabilnost analizirana je komparativnom delta-Ct metodom [6], BestKeeperom [7], GeNormom [3] i NormFinderom [8], koji koriste različite pristupe za utvrđivanje stabilnosti gena, ali u svima njima je vrijednost manja stabilniji je gen. R program v. 3.0.2 [37] sa paketima “psych”, “gclus” i “fBasics” korišten je za druge statističke operacije i generiranje grafika. Poređenja između metoda vršena su sa cijelim skupom podataka, kao i sa podskupovima uzoraka. Upoređujemo 25 podskupova sa 3 uzorka po eksperimentalnoj grupi (72 uzorka u ukupno 24 grupe) i 25 podskupova sa 2 uzorka po eksperimentalnoj grupi (48 uzoraka u ukupno 24 grupe) kako bismo procijenili robusnost svake metode. Nadalje, šest ciljnih gena uključenih u spolnu diferencijaciju podvrgnuto je normalizaciji različitim referentnim kombinacijama gena.

Analiza efikasnosti

Efikasnost svakog para prajmera proverena je za svaki referentni gen pomoću četiri različite metode: LinRegPCR [14], LREanalyzer [15], DART [10] i PCR-Miner [16]. Svaka metoda izračunava pojedinačne vrijednosti efikasnosti za svaku qPCR reakciju, a zatim se usrednjavaju na dobijene srednje vrijednosti efikasnosti za svaki gen. Neobrađene vrijednosti fluorescencije (bez korekcije osnovne linije) korištene su kao ulaz za svaku metodu određivanja efikasnosti.

Normalizacija i korekcija efikasnosti na ciljnim genima

Vrijednosti Cq korigirane efikasnosti pomoću LinRegPCR i PCR-Miner-a su dobijene za šest ciljnih gena, slijedeći formulu “Cq = Cq * (log(E) / log(2))” [38]. Ovi ispravljeni Cqs su zatim normalizovani sa UBQ + RPS4 i B2M a zatim srednji centar. Ovo je proizvelo četiri skupa podataka. Srednja vrijednost i standardna devijacija dobivene su za temperaturne (visoke, normalne i niske) i spolne grupe (muške i ženske) za svaki gen u svakom skupu podataka.


Tumačenje qPCR krivulja: kako pronaći vrijednost Ct u mom slučaju? - Biologija

Smjernice za internu i međulaboratorijsku validaciju kvalitativnih qPCR metoda.

Prihvatljivost metode i parametri performansi koje treba procijeniti.

Kriterijumi prihvatljivosti koje treba ispuniti za gore navedene parametre.

Detaljna eksperimentalna postavka za internu i međulaboratorijsku validaciju.

Što se tiče mnogih područja molekularnog testiranja, otkrivanje genetski modificiranih organizama (GMO) oslanja se na tehnologiju lančane reakcije polimeraze (qPCR) u realnom vremenu. Zbog sve većeg broja GMO, pristup skriningu koji koristi kvalitativne metode skrininga postao je integralni dio detekcije GMO. Međutim, nedostaju posebne smjernice za validaciju ovih metoda. Ovdje se predlaže pragmatičan pristup provođenju in-house i međulaboratorijskih studija validacije za GMO skrining metode. Takve smjernice bi se mogle prilagoditi drugim oblastima u kojima se koriste kvalitativne qPCR metode za molekularno testiranje, omogućavajući lakše implementiranje pouzdanije faze skrininga gdje je to potrebno.


Koja je ovo CT vrijednost? Da li osoba sa većom CT vrijednosti neće biti zarazna?

Dr Shahid Jameel, virusolog i direktor Trivedi škole bioloških nauka na Univerzitetu Ashoka, otkriva u razgovoru sa FIT, that the RT-PCR test, ie, polymerase chain reaction test, examines the viral DNA or RNA to check the amount of molecules in it. There are many cycles in this test. DNA or RNA molecules are doubled in every cycle.

These tests are amplification tests - because the molecules in the sample are very small, the virus can be detected only after amplification in some cycles.

The CT value indicates the number of cycles needed for the virus to be detected. Due to amplification, a negative sample also starts giving non-specific positive signals in 40 cycles. Therefore, if the number is less than 40, the sample is considered positive.


False security

Patients in early symptomatic phase may have relatively less viral load and hence have high Ct value, which may subsequently change. “In such cases, high Ct values will give a false sense of security,” Dr. Bhargava says. “Viral loads will increase with time and then go down. It would be a sort of bell-shaped curve,” elaborates Dr. Jameel.

Besides the amount of virus present in a person, disease severity depends on host factors. “Some patients with low viral load may suffer from very severe disease due to triggering of the immunological responses. Hence high Ct values [reflecting low viral load] may give a false sense of security,” the Dr. Bhargava adds.

The high sensitivity and the nature of PCR test that looks only at the genetic material and not the virus itself can produce false positives even when the person has fully recovered as seen in over 260 people in South Korea who tested positive after recovering. But later studies found that PCR was detecting just the dead viral fragments. High Ct values may thus mean either low levels of virus or fragments of viral RNA.


Pogledajte video: RT-PCR true CT value. (Oktobar 2022).