Informacije

1.4: Enzimi koji modificiraju DNK - biologija

1.4: Enzimi koji modificiraju DNK - biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Metilaze

Baš kao što je proučavanje sistema bakterijske restrikcije-modifikacije omogućilo niz specifičnih endonukleaza, tako su dostupne i različite specifične DNK metilaze.

  • Sekvence prepoznavanja metilaza su iste kao povezane endonukleaze (npr. EcoR1 metilaza prepoznaje i metilira u sekvenci "GAATTC").
  • Sve metilaze prenose metilnu grupu sa S-adenozilmetionina (SAM) na određenu bazu u sekvenci prepoznavanja, a SAM je neophodna komponenta u reakciji metilacije.
  • Metilacija DNK obično ima učinak zaštite DNK od srodne restrikcijske endonukleaze. Međutim, postoje metilaze sa minimalnom specifičnošću. Na primjer, Sss I metilaza će metilirati ostatke citozina u sekvenci 5' … CG … 3'. U ovom slučaju, metilirana DNK će biti zaštićena od širokog spektra restrikcijskih endonukleaza.
  • Neke restrikcijske endonukleaze će prerezati DNK na svojim mjestima prepoznavanja samo ako je DNK je metilirani (npr. Dpn I).
  • Ostale restrikcijske endonukleaze će se smanjiti oboje metilirana i nemetilirana DNK na njihovim sekvencama prepoznavanja (npr. BamH I).

Brana i dcm Metilacija

  • Metilaza koju kodira brana gen (dam metilaza) prenosi metilnu grupu sa SAM na N6 položaj adeninske baze u nizu 5' … GATC … 3'.
  • Metilaza koju kodira dcm gen (dcm metilaza) metilira unutrašnju bazu citozina, na C5 poziciju, u sekvencama 5' … CCAGG … 3' i 5' … CCTGG … 3'.
  • Gotovo sve vrste E. coli koji se obično koriste u kloniranju imaju a brana+dcm+ genotip. Poenta je ovdje ne da posebno želimo da naša DNK bude metilirana, ali da napravimo a dam-dcm- domaćin neko mora da mutira bakteriju i izoluje ispravnog mutanta. To očigledno nije učinjeno za mnogo sojeva bakterija. Vjerovatno zato što brana i dcm metilacija utiče na samo mali podskup potencijalnih restrikcijskih endonukleaza

DNK izolovan iz dam+dcm+ sojevi zapravo neće biti isječen skromnim podskupom dostupnih restrikcijskih endonukleaza:

Slijed prepoznavanja
Restrikcioni enzim
GATC
GjaATC
TGATCA
Bcl I
+
-
GATC
Mbo I
+
-
ATCGAT
Cla I
+
-
TCTAGA
Xba I
+
-
TCGA
Taq I
+
-
GAAGA
Mbo II
+
-
GGTGA
Hph I
+
-

DNK će se možda morati pripremiti od sojeva E. coli koji su dam-dcm- da bi ih ovi enzimi presjekli.

DNK polimeraze

Širok izbor polimeraza je okarakterisan i komercijalno dostupan. Sve DNK polimeraze dijele dvije opće karakteristike:

  1. Oni dodaju nukleotide u 3'-OH kraj prajmera
  2. Redoslijed nukleotida u nastajućem polinukleotidu je šablonsko usmjereno

Slika 1.4.1: DNK replikacija

Pored aktivnosti 5'->3' polimeraze, polimeraze mogu sadržavati aktivnost egzonukleaze. Ova aktivnost egzonukleaze može se odvijati ili u smjeru 5'->3', ili u smjeru 3'->5'.

  • Aktivnost egzonukleaze u smjeru 3'->5' omogućava polimerazi da ispravi grešku ako inkorporira netačan nukleotid (tzv.aktivnost ispravljanja grešaka"). Takođe može polako degradirati 3' kraj prajmera.
  • Aktivnost egzonukleaze u smjeru 5'->3' će mu omogućiti da razgradi bilo koji drugi hibridizirani prajmer na koji može naići. Bez aktivnosti egzonukleaze 5'->3', ometajući prajmeri mogu ili ne moraju biti fizički zamijenjeni, ovisno o polimerazi koja se koristi.

Različite polimeraze imaju različite stope greške pogrešnog ugradnje i različite stope polimerizacije.

E. coli DNK polimeraza I
E. coli DNK polimeraza I - Klenow fragment
T4 DNK polimeraza
T7 DNK polimeraza
Taq DNK polimeraza
M-MuLV reverzna transkriptaza
5'->3' aktivnost egzonukleaze
*
*
3'->5' aktivnost egzonukleaze
*
*
*
*
Stopa greške (x10-6)
9
40
<1
15
285
Strand Displacement
*
Inaktivacija toplote
*
*
*
*

Upotreba polimeraza

Različite aktivnosti različitih polimeraza omogućavaju im različite primjene. Na primjer, restrikcijske endonukleaze mogu dati fragmente DNK sa 3' ili 5' nukleotidnim "prevjesima".

  • U slučaju prepusta od 5', aktivnost polimeraze 5'->3' može ih ispuniti kako bi tupi krajevi.
  • U slučaju prepusta od 3', aktivnost egzonukleaze 3'->5' prisutna u nekim polimerazama (posebno T4 DNK polimerazi) može "zažvakati" ove krajeve kako bi se također napravili fragmenti DNK sa tupim krajevima.

Slika 1.4.2: Aktivnost polimeraze

"Nick-prijevod"

Ova metoda se koristi za dobijanje visoko radioaktivno označenih jednolančanih DNK fragmenata, koji koristi aktivnost 5'->3' egzonukleaze prisutne u nekim polimerazama (E. coli DNK polimeraza I, na primjer).

  • U ovoj metodi, DNK dupleks od interesa je "urezan" (tj. jedan od lanaca se preseče; vidi DNKazu I).
  • Zatim se dodaje DNK pol I zajedno sa radioaktivno obeleženim nukleotidima. Aktivnost egzonukleaze 5'->3' žvaće 5' kraj na mjestu "nick", a aktivnost polimeraze uključuje radioaktivno označene nukleotide. Rezultirajući polinukleotid će biti visoko radioaktivno obilježen i hibridizirat će se sa DNK sekvencom od interesa.

Slika 1.4.3: Nick-prijevod

  • Termostabilne polimeraze imaju sposobnost da ostanu funkcionalne u temperaturnim rasponima gdje će se dupleks DNK zapravo "stopiti" i odvojiti. To je omogućilo razvoj "lančana reakcija polimeraze" tehnika (PCR), koja je imala dubok uticaj na modernu biotehnologiju. O ovoj metodi ćemo razgovarati kasnije.
  • Ugradnja dideoksi baza (tj. bez hidroksilnih grupa na 2' ili 3' ugljiku šećera riboze) dovodi do prekid reakcije polimeraze. O tome će se detaljnije govoriti kasnije. Međutim, ovaj završetak lanca inkorporacijom dideoksinukleotida je osnova Sangerove metode sekvenciranja DNK, kao i terapije kojima se pokušava inhibirati replikacija virusa.

Nukleaze

Nukleaza BAL-31

  • Ovo je an exonukleaza (počinje na terminusima i radi prema unutra) koja će razgraditi i 3' i 5' završetak dvolančane DNK. Neće napraviti unutrašnje cijepanje („ureze“), međutim, degradiraće krajeve DNK na postojećim unutrašnjim „urezima“ (koji stvaraju i 3' i 5' krajeve).
  • Degradacija završetaka nije koordinirana, što znači da proizvod jeste ne 100% tupim krajem (iako je originalni dupleks možda imao tup vrh).
  • Takvi "izderani" krajevi mogu se zatupiti popunjavanjem i žvakanjem odgovarajućom polimerazom (npr. T4 DNK polimerazom). Definicija jedinice 1 jedinica je količina enzima potrebna za uklanjanje 200 parova baza sa svakog kraja dupleks DNK za 10 minuta na 30 °C.

Slika 1.4.4: Aktivnost nukleaze BAL-31

Egzonukleaza III

  • Katalizuje postepeno uklanjanje nukleotida sa 3' hidroksilnih završetaka dupleks DNK.
  • Enzim će napasti 3' hidroksil na dupleks DNK sa tupim krajevima, sa 5' previsima ili sa unutrašnjim "urezima".
  • Pošto je potreban dupleks DNK, enzim neću probaviti 3' kraj dupleks DNK gdje su krajevi 3' prevjesi.

Slika 1.4.5: Aktivnost egzonukleaze III

Nukleaza mungo pasulja (izolovana iz klica mahuna)

  • A specifične za jednu lancu DNK i RNA endonukleaza koja će razgraditi jednolančane produžetke sa krajeva DNK i RNK ostavljajući tupe krajeve.
  • Jednostruki nastavci mogu biti od 5' ili 3' - oba se uklanjaju i ostavlja se tupi dupleks.

Slika 1.4.6: Aktivnost nukleaze Mung Bean

Deoksiribonukleaza I (DNKaza I) iz goveđe pankreaze

  • Ovaj enzim hidrolizira dupleks ili pojedinačne lance DNK prvenstveno na fosfodiestarskim vezama 5' do pirimidin nukleotidi
  • U prisustvu Mg2+ ion, DNKase I napada svaki lanac nezavisno i proizvodi ureze na nasumičan način (korisno za prevođenje nicka)
  • U prisustvu Mn2+ jona DNK-aza I cijepa oba lanca DNK na približno istoj poziciji (ali ostavljajući "izlomljene" krajeve)

Ligaze

  • Ligaze katalizuju formiranje fosfodiestarske veze između suprotstavljenih 5' fosfata i 3' hidroksilnih završetaka nukleotida (potencijalno RNK ili DNK u zavisnosti od ligaze).
  • U određenom smislu, one su suprotne restrikcijskim endonukleazama, ali izgleda da na njih ne utječe lokalna sekvenca, per se.
  • Ligaze zahtijevaju ili rATP ili NAD+ kao kofaktor, a to je u suprotnosti sa restrikcijskim endonukleazama.

Slijede različite vrste ligaza i njihove karakteristike.

T4 DNK ligaza

  • Izolirano iz bakteriofaga T4.
  • Vezaće krajeve dupleks DNK ili RNK.
  • Ovaj enzim će spojiti krajeve tupih krajeva, kao i krajeve sa kohezivnim (komplementarnim) previsokim krajevima (ili 3' ili 5' komplementarni prevjesi).
  • Ovaj enzim će također popraviti jednolančane udubljenja u dupleks DNK, RNK ili DNK/RNA dupleksima. Zahteva ATP kao kofaktor.

Taq DNK ligaza

  • Ova ligaza će katalizirati fosfodiestarsku vezu između dva susjedna oligonukleotida koji su hibridizirani u komplementarni lanac DNK:

Slika 1.4.7: Aktivnost Taq DNK ligaze

  • Ligacija je efikasna samo ako se oligonukleotidi savršeno hibridiziraju sa lancem šablona.
  • Enzim je aktivan na relativno visokim temperaturama (45 - 65 °C). Zahteva NAD+ kao kofaktor.

T4 RNA ligaza

  • Kataliziraće stvaranje fosfodiestarske veze između RNA/RNA oligonukleotida, RNA/DNK oligonukleotida ili DNK/DNK oligonukleotida.
  • Zahteva ATP kao kofaktor.
  • Ovaj enzim ne zahtijeva šablonski lanac.

T4 RNA ligaza se može koristiti u različite svrhe, uključujući konstruiranje RNA/DNK hibridnih molekula.

Slika 1.4.8: Aktivnost T4 RNA ligaze

DNK ligaza (E. coli)

  • Kataliziraće fosfodiestersku vezu između dupleks DNK koji sadrže kohezivne krajeve.
  • To će ne efikasno ligirati tupo završne fragmente.
  • Zahteva NAD+ kao kofaktor.

Slika 1.4.9: Aktivnost DNK ligaze (E. Coli).

T4 polinukleotidna kinaza

  • Katalizuje prijenos i razmjenu fosfatne grupe iz g položaj rATP (adenin riboza trifosfat nukleotid) na 5' hidroksilnom kraju dvolančane i jednolančane DNK ili RNK, i nukleozid 3' monofosfati.
  • Enzim će također ukloniti 3' fosforilne grupe.
  • Oligonukleotidi koji se dobijaju iz automatizovanih sintisajzera nemaju 5' fosfatnu grupu i stoga se ne mogu vezati za druge polinukleotide.

T4 polinukleotid kinaza se može koristiti za fosforilaciju 5' kraja takvih polinukleotida:

Slika 1.4.10: Aktivnost T4 polinukleotid kinaze

Intestinalna fosfataza teleta (CIP)

  • Katalizuje uklanjanje 5' fosfatnih grupa iz RNK, DNK i ribo- i deoksiribonukleozid trifosfata (npr. ATP, rATP).
  • CIP obrađen dupleks DNK se ne može samoligirati.
  • Hemi-fosforilirani dupleksi će biti vezani na jednom lancu (fosforilirani lanac) i ostati "izrezani" na drugom.

Slika 1.4.11: CIP aktivnost


T4 DNK ligaza (MB007)

Opis: T4 DNK ligaza je ultračisti rekombinantni enzim pročišćen od Escherichia coli isporučuje se sa optimiziranim puferom reakcije 10×, koji uključuje ATP. T4 DNK ligaza katalizira formiranje fosfodiestarske veze između suprotstavljenih 5′-fosforilnih i 3′-hidroksilnih završetaka u dupleks DNK. On popravlja jednolančane rezove u dupleksnoj DNK i spojiće restrikcijske fragmente dupleks DNK ili RNK i tupih i kohezivnih krajeva. Enzimu je potreban ATP kao kofaktor.

Karakteristike:
– Bez detektivnih nespecifičnih aktivnosti nukleaze, endonukleaze, RNaze i DNaze
– Isporučuje se sa optimizovanim puferom reakcije za efikasne reakcije ligacije

Prijave:
– Kloniranje restrikcijskih fragmenata tupog i ljepljivog (kohezivnog) kraja
– Kloniranje PCR proizvoda
– Spajanje linkera i adaptera za DNK
– Popravak nicka
– Samocirkularizacija linearne DNK

specifikacije:

Koncentracija enzima: 5 U/μL
Izvor: Rekombinantna E. coli naprezanje
Optimalna temperatura reakcije: 16-20 °C
Inaktivacija topline: 65 °C 10 min
Uslovi skladištenja: Čuvati na -20 °C
Uslovi dostave: Šalje se na suvom ledu

Komponente:
– T4 DNK ligaza (5 U/μL)
– Reakcioni pufer (4x)


Molecular Cell Biology. 4. izdanje.

Molekuli DNK mogu se savijati i savijati u prostoru, što dovodi do promjena u topologiji, uključujući formiranje negativnih ili pozitivnih superzavojnica. Na primjer, kao što je objašnjeno u poglavlju 4, lokalno odmotavanje dupleksa DNK čiji su krajevi fiksirani uzrokuje stres koji se oslobađa supersmotanjem. Enzimi koji kontroliraju topologiju DNK funkcioniraju u nekoliko različitih koraka u replikaciji u prokariotskim i eukariotskim stanicama. U ovom dijelu opisujemo dvije različite klase topoizomeraza i njihovu ulogu u replikaciji DNK.


Dnaza I (bez RNAze)

Prijave:
DNaza I se obično dodaje reagensima za lizu ćelija kako bi se uklonio viskozitet uzrokovan sadržajem DNK u lizatima bakterijskih ćelija ili za uklanjanje DNK šablona iz RNK proizvedene in vitro transkripcijom.
DNaza I uklanja neželjenu DNK iz ćelijskih lizata kako bi poboljšala efikasnost ekstrakcije proteina.

Opis:
Dnaza I (bez Rnaze), deoksiribonukleaza I je jednostruki, glikozilirani polipeptid koji razgrađuje jednolančanu i dvolančanu DNK. Enzim djeluje tako što cijepa DNK na 5' fosfodinukleotidne i male oligonukleotidne fragmente.
DNaza I se koristi za primjenu koja zahtijeva probavu DNK u kojoj je ključno izbjeći oštećenje RNK.

Sadržaj:
DNase I (bez RNase)
2 jedinice/&mul DNase I u 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM CaCl2, 10 mM MgCl2 i 50 % [v/v] glicerola

DNase I reakcioni pufer
10 x konc. reakcijski pufer koji sadrži 100 mM Tris-HCl pH 7,6 (25°C), 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2

Uslovi reakcije
1x DNase I reakcioni pufer
Inkubacija na 37°C
Visoki nivoi monovalentnih jona kao što su Na+ i K+ (tj. 100 mM) mogu smanjiti aktivnost DNaze I.

Inaktivacija:
DNaza I je potpuno inaktivirana inkubacijom na 65 °C u trajanju od 10 minuta.

Aktivnost:
> 2500 jedinica/mg proteina


[1] Aktivnost DNaze I se također mjeri u 'Jedinicama testa razgradnje' definirane kao količina enzima potrebna za potpunu razgradnju 1 &mg plazmidne DNK za 10 minuta na 37 °C u 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgCl2 i 13 mM CaCl2.
1 'Jedinica za ispitivanje degradacije' je ekvivalentna 0,3 'Kunitz jedinica'.

Citati proizvoda:
Kliknite na crnu strelicu na desnoj strani da proširite listu citata. Kliknite na naslov publikacije za cijeli tekst.

Odabrane reference:
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Njujork: Cold Spring Harbor Laboratory Press 10.6
Tabor et al. (1997) DNK-zavisne DNK polimeraze. u: Trenutni protokoli u molekularnoj biologiji. Ausubel et al., ur. Wiley & Sons Inc. 3.5.4-6.
Pan et al. (1999) Ca2+- zavisna aktivnost ljudske DNaze I i njenih hiperaktivnih varijanti. Protein Sci. 8:1780.


Tabela odabira DNK polimeraze

DNK ligaze formiraju fosfodiestarske veze između lanaca DNK, spajajući ih zajedno. DNK ligaza je odgovorna za popravku prekida u jednolančanoj i dvolančanoj DNK. U laboratorijama molekularne biologije, DNK ligaza se obično koristi za aplikacije molekularnog kloniranja.

Svaka DNK ligaza ima posebne karakteristike, što je čini korisnom za specifične primjene. Poznavanje ovih karakteristika vam omogućava da odaberete pravu ultra čistu DNK ligazu za vašu aplikaciju.


Amerike

Stranica će biti prikazana na engleskom jeziku.

Koristimo ove kolačiće kako bismo osigurali da naša web stranica funkcionira sigurno i ispravno, neophodni su za funkcioniranje naših usluga i ne mogu se isključiti u našim sustavima. Obično se postavljaju samo kao odgovor na vaše radnje koje predstavljaju zahtjev za usluge, kao što je prijava, korištenje košarice ili popunjavanje obrazaca. Možete postaviti svoj pretraživač da blokira ili vas upozorava na ove kolačiće, ali neki dijelovi naših usluga neće raditi bez njih. Kao i drugi kolačići koje koristimo, strogo neophodni kolačići mogu biti kolačići prve strane ili kolačići treće strane.

Koristimo ove kolačiće da zapamtimo vaše postavke i postavke. Na primjer, možemo koristiti ove kolačiće da zapamtimo vaše jezične postavke.
Dozvoli preferirane kolačiće

Koristimo ove kolačiće da prikupimo informacije o tome kako komunicirate s našim uslugama i da nam pomognemo da ih mjerimo i poboljšamo. Na primjer, možemo koristiti ove kolačiće da utvrdimo da li ste bili u interakciji s određenom stranicom.
Dozvoli kolačiće performansi/statistike

Mi i naši reklamni partneri koristimo ove kolačiće za isporuku reklama, kako bismo ih učinili relevantnijim i značajnijim za vas i za praćenje efikasnosti naših reklamnih kampanja, kako na našim uslugama, tako i na drugim web stranicama i društvenim medijima.
Dozvoli marketinške kolačiće


T4 DNK ligaza

Definicija jedinice: Jedna Weissova jedinica je definirana kao količina enzima potrebna da katalizira izmjenu 1 nmol 32 P iz pirofosfata u ATP u materijal koji se može adsorbirati u Noritu za 20 minuta na 37 °C.

Dostava: isporučen na plavom ledu

Uslovi skladištenja: čuvati na -20 °C
izbjegavajte cikluse zamrzavanja/odmrzavanja

Rok trajanja: 12 mjeseci

Forma: tečnost (isporučuje se u 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 &mg/ml BSA i 50 % [v/v] glicerola)

koncentracija: 2.5 Weiss jedinica/&mul (500 CE jedinica/&mul)

Opis:
T4 DNK ligaza katalizira formiranje fosfodiestarske veze između suprotstavljenih 5' fosfata i 3'-hidroksilnih završetaka u dupleks DNK ili RNK.

Sadržaj:
Standardni pufer za ligaciju, 10x konc.
500 mM Tris-HCl pH 7,8 na 25 °C, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP i 25 &mug/ml BSA

Pufer za brzo ligiranje, 2x konc.
60 mM Tris-HCl pH 7,8 na 25 °C, 20 mM MgCl2, 20 mM DTT, 2 mM ATP i 10 % PEG

komponentaEN-149SEN-149L
T4 DNK ligaza160 &mul5 x 160 &mul
Standardni pufer za ligaciju, 10x konc.1 ml5 x 1 ml
Pufer za brzo ligiranje, 2x konc.5 ml5 x 5 ml

Inaktivacija topline:
T4 DNK ligaza se može inaktivirati inkubacijom na 65 °C u trajanju od 10 minuta.

  • Jedna jedinica kohezivnog kraja (CEU) definira se kao količina enzima koja je potrebna da se dobije 50% ligacije Hind III fragmenti λ DNK (koncentracija 5' DNK završetaka od 0,12 µM, 300 µg/ml) u ukupnom reakcionom volumenu od 20 µm za 30 minuta na 16 °C u 1x T4 DNK ligaznom reakcionom puferu.
  • Jedna Weiss jedinica je ekvivalentna cca. 200 CE jedinica.
  • T4 DNK ligazu snažno inhibiraju NaCl ili KCl ako koncentracija prelazi 200 mM.
  • Ligacija tupih krajeva i fragmenata parnih para s jednom bazom zahtijeva oko 50 puta više enzima da bi se postigao isti opseg ligacije kao i fragmenti DNK kohezivnog kraja. Ligacija tupog kraja može se poboljšati dodatkom PEG 4000 (10 % w/v konačne koncentracije) ili heksamin hlorida, ili smanjenjem koncentracije ATP-a na 50 µM.
  • Za razblaživanje T4 DNK ligaze za naknadno skladištenje na -20 °C treba koristiti pufer za skladištenje koji sadrži 50% glicerola, za razblaživanje Ligaze za trenutnu upotrebu, preporučuje se 1x reakcioni pufer.


Postavljanje testa:
Standardni test ligacije

comp.konačni iznos/konc.20 &mul test
Standardni pufer za ligaciju, 10x konc.1x2 & mul
Vektor/Insert DNK100 ng - 1 & šoljica100 ng - 1 & šoljica
T4 DNK ligaza0,1 - 1 Weiss jedinica0,04-0,4 &mul
Voda za PCR-napuniti do 20 &mul

Inkubirajte 20 - 30 min na 16 °C za optimalnu ligaciju.

comp.konačni iznos/konc.20 &mul test
Pufer za brzo ligiranje, 2x konc.1x10 &mul
Vektor/Insert DNK100 ng - 1 & šoljica100 ng - 1 & šoljica
T4 DNK ligaza0,1 - 1 Weiss jedinica0,04-0,4 &mul
Voda za PCR-napuniti do 20 &mul

Inkubirajte 5 minuta za ligacije sa kohezivnim krajevima ili 15 minuta za ligacije sa tupim krajevima na temperaturi okoline (20 - 25 °C).

Citati proizvoda:
Kliknite na crnu strelicu sa desne strane da proširite listu citata. Kliknite na naslov publikacije za cijeli tekst.


Restrikcijska enzimska probava

Priprema DNK za tradicionalne metode kloniranja ovisi o digestiji restrikcijskim enzimima kako bi se stvorili kompatibilni krajevi koji mogu biti povezani zajedno. DNK koja se klonira može uvelike varirati, od genomske DNK ekstrahirane iz čiste bakterijske kulture ili mješovite populacije, do prethodno kloniranog gena koji treba premjestiti s jednog vektora na drugi (subkloniranje). Restrikcioni enzimi se također mogu koristiti za stvaranje kompatibilnih krajeva na PCR proizvodima. U svim slučajevima, jedan ili više restrikcijskih enzima se koriste za varenje DNK što rezultira bilo neusmjerenim ili usmjerenim umetanjem u kompatibilni plazmid.

Genomska DNK, bez obzira na izvor, obično se probavlja restrikcijskim enzimima koji prepoznaju 6-8 uzastopnih baza, jer se ta mjesta prepoznavanja javljaju rjeđe u genomu nego 4-bazna mjesta i rezultiraju većim fragmentima DNK. Željena veličina umetka za biblioteku klonova određuje koji će enzimi biti odabrani, kao i uslove varenja. Najčešće, serijsko razrjeđivanje odabranog(ih) restrikcijskih enzima(a) se koristi za varenje početnog materijala, a željeni raspon veličine umetka se izoluje elektroforezom nakon čega slijedi ekstrakcija DNK gelom. Ova metoda pripreme daje DNK fragmente željene veličine sa krajevima kompatibilnim sa odabranom DNK vektora.

Subkloniranje zahtijeva korištenje 1-2 restrikcijska enzima koji seče neposredno izvan fragmenta umetka bez rezanja unutar samog umetka. Restrikcioni enzimi koji imaju mjesto za prepoznavanje unutar mjesta višestrukog kloniranja (MCS) se obično koriste jer ne sijeku na drugom mjestu u DNK vektora i tipično proizvode dva lako razlučiva fragmenta DNK. Gen od interesa se najčešće subklonira u vektor ekspresije radi poboljšane ekspresije proteina i/ili dodavanja oznake za pročišćavanje. U ovom slučaju, bitno je da gen bude umetnut u ispravnoj orijentaciji iu okviru sa promotorom transkripcije.

Lančana reakcija polimeraze (PCR) se obično koristi za amplifikaciju gena ili fragmenta DNK od interesa, iz bilo kojeg izvora DNK, koji se klonira. Da bi se stvorili kompatibilni krajevi, uobičajeno je dodati restrikcijska mjesta na 5&rsquo kraj oba PCR prajmera. Prilikom dodavanja restrikcijskih mjesta u PCR prajmer, preporučuje se uključiti 6 baza između mjesta prepoznavanja i 5&rsquo kraja prajmera. Ove dodatne baze obezbjeđuju dovoljno DNK za restrikcijski enzim da veže mjesto prepoznavanja i efikasno seče. Prilikom odabira restrikcijskih mjesta za dodavanje prajmerima, važno je odrediti koje će mjesto(a) biti kompatibilne s vašim odabranim vektorom, da li je poželjno usmjereno kloniranje i, što je najvažnije, potvrditi da mjesto(a) prepoznavanja se ne pojavljuje unutar gena ili fragmenta DNK.


Enzimi uključeni u replikaciju DNK

Ovo je lista enzima uključenih u replikaciju DNK. Hajde da razgovaramo o tome detaljno…

  • Jednolančani vezujući protein (SSBP)
  • DNK helikaze
  • Topoizomeraze
  • DNK primaza
  • DNK ligaza
  • DNK polimeraze

1. Jednolančani vezujući protein (SSBP)

SSBP znači Jednolančani vezivni proteini. Ima veoma važnu ulogu u replikaciji DNK kod E.Coli.

Jednolančani vezujući proteini vezuju se i stabilizuju jednolančanu DNK tokom replikacije DNK sve dok se jednolančana DNK ne može koristiti kao šablon za novi lanac za koji se vezuje.

SSB proteini su vezani i za zaostajuću i za vodeći lanac kako bi se spriječilo ponovno povezivanje lanaca.

2.DNK helikaza

  • Funkcije enzima DNK helikaze „Odmotava DNK“.
  • Imaju molekularnu težinu 300.000, koja sadrži ŠEST identičnih podjedinica.
  • Okazaki fragmenti” su kratki delovi od 1000-2000 baza proizvedenih tokom diskontinuirane replikacije, a kasnije se spajaju u kovalentno netaknut lanac.
  • Dna.B helikaza” i “Dna.G Primase” čine funkcionalnu jedinicu unutar kompleksa replikacije, nazvanu “PRIMOSOME”.
  • DNK se nalazi oko Dna.B helikaze na replikacijskoj vilici, DNK primaza se povremeno povezuje sa Dna.B helikazom i sintetiše kratak RNA prajmer.
  • Vjeruje se da “helikaza” i “nukleaza” aktivnosti enzima Rec B, C, D pomažu u pokretanju homologne genetske rekombinacije u E.Coli. Također je uključen u popravak dvolančanih prekida na srušenoj replikacijskoj vilici.
  • “Helikaza” je enzim koji razdvaja lance DNK obično hidrolizom ATP-a kako bi se osigurala potrebna energija.

3. Topoizomeraze

  • Topoizomeraza je takođe poznata kao "DNK giraza".
  • “Topoizomeraze” su enzim koji može promijeniti “broj povezivanja” (Lk).
  • Svaka ćelija ima enzime koji povećavaju (ili) smanjuju stepen odmotavanja DNK naziva se "topoizomeraze", a svojstvo DNK koje menjaju je broj povezivanja.
  • Topoizomeraze“, ovi enzimi igraju posebno važnu ulogu u procesima kao što su „replikacija“ i „pakiranje DNK“.
  • Postoje dvije klase topoizomeraza.
    • Topoizomeraze tipa I
    • Topoizomeraze tipa II

    A) Topoizomeraze tipa I:

    Ovaj čin prolaznim prekidom jednog od dva lanca DNK, rotiranjem jednog od krajeva neprekinutog lanca i ponovnim spajanjem prekinutih krajeva mijenjaju Lk u koracima od 1.

    B) Topoizomeraze tipa II:

    Enzim razbija oba lanca DNK i mijenja Lk u koracima od 2.

    Prokariotske topoizomeraze

    ČETIRI različite topoizomeraze (I i IV) se javljaju u E.Coli.

    1) Tip I (Topoizomeraza I i III):

    Tip I općenito opušta DNK uklanjanjem negativnih super-zavojnica (povećavajući Lk)

    2) Tip II (Topoizomeraza II i IV):

    Topoizomeraza II se takođe naziva “DNK giraza“, može uvesti negativne superzavojnice. (Smanjenje Lk).

    • Koristi energiju ATP-a i iznenađujući mehanizam da to postigne.
    • Stepen supersmotanja bakterijske DNK održava se regulacijom neto aktivnosti topoizomeraze-I i II.

    Eukariotske topoizomeraze

    Eukariotske ćelije takođe imaju topoizomeraze tipa I i tipa II. Topoizomeraze-I i amper II su obje tipa-I. Dvije topoizomeraze tipa II, topoizomeraze IIa i IIb, ne mogu odmotati DNK (uvesti negativne superzavojnice).

    Iako oba mogu opustiti pozitivne i negativne superzavojnice. Razmatramo jedno vjerovatno porijeklo negativnih superzavojnica u eukariotskim ćelijama.

    • Molekularna težina DNK giraze je 400.000, koja sadrži ČETIRI podjedinice i funkciju “Supercoiling”.
    • Supercoiled DNK je struktura višeg reda koja se javlja u kružnim molekulima DNK omotanim oko jezgra.

    Koji je vezni broj?

    Broj povezivanja (Lk) je topološko svojstvo. Lk se može definirati kao „broj puta kada druga niti probije površinu druge niti“.

    4. DNK primaza

    U replikaciji, prije nego što DNK polimeraza iii može početi sintetizirati DNK prajmeri moraju biti prisutni na šabloni općenito kratki segmenti RNK sintetizirani enzimom zvanim "Primases”.

    • DNK primaza ima molekularnu težinu od 60.000 Daltona i sadrži samo jednu podjedinicu, čija funkcija sintetizira RNA prajmere.
    • Dna.B helikaza i Dna.G primaza čine funkcionalnu jedinicu unutar kompleksa replikacije, nazvanog "Primosome”.
    • RNK prajmer je tipično dugačak 15-50 baza. Sintetiše prajmere počevši od sekvence pppAG, nasuprot sekvenci 3’-GTC-5’ u šablonu.

    5. DNK ligaza

    Enzim koji stvara fosfodiestersku vezu između 3’ kraja jednog segmenta DNK i 5’ kraja drugog. Nakon što je RNA prajmer uklonjen i zamijenjen, susjedni Okazaki fragmenti moraju biti povezani zajedno. 3'-OH kraj jednog fragmenta je u blizini 5'-fosfatnog kraja prethodnog fragmenta. Odgovoran za zatvaranje ovog ureza je enzim DNK ligaza. Ligaze su prisutne i kod prokariota i kod eukariota.

    Mehanizam aktivnosti enzima:

    E.Coli i T4 ligaze dijele svojstvo brtvljenja ureza koji imaju 3’’-OH i 5’- P završetak. Oba enzima poduzimaju reakciju u dva koraka, uključujući "kompleks enzim-AMP".

    AMP kompleksa enzima postaje vezan za 5’-fosfat nicka i tada se formira fosfodiesterska veza sa 3’-OH krajem nicka, oslobađajući enzim i AMP.


    Podaci o autoru

    Pripadnosti

    Odsjek za signalizaciju i ekspresiju gena, Institut za imunologiju La Jolla, 9420 Athena Circle, La Jolla, CA, 92037, SAD

    Atsushi Onodera, Edahí González-Avalos, Chan-Wang Jerry Lio, Romain O. Georges i Anjana Rao

    Odsjek za imunologiju, Medicinski fakultet, Univerzitet Chiba, 1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, 260-8670, Japan

    Atsushi Onodera & Toshinori Nakayama

    Institut za globalno istaknuto istraživanje, Univerzitet Chiba, 1-33, Yayoicho, Inage-ku, Chiba, 263-8522, Japan

    Bioinformatika i diplomski program biologije sistema, Univerzitet Kalifornije, San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093, SAD

    Sadašnja adresa: Department of Microbial Infection and Immunity, Ohio State University, 460 W 12th Ave, Columbus, OH, 43210, USA

    Program za signalizaciju i epigenetiku raka i Institut za epigenetiku raka, Centar za rak Fox Chase, 333 Cottman Avenue, Philadelphia, PA, 19111, SAD

    AMED-CREST, AMED, 1-8-1 Inohana, Chuo-ku, Chiba, 260-8670, Japan

    Odjel za farmakologiju i Moores Cancer Center, Univerzitet Kalifornije, San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, CA, 92093, SAD

    Sanford konzorcij za regenerativnu medicinu, 2880 Torrey Pines Scenic Drive, La Jolla, CA, 92037, SAD

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Ovog autora možete potražiti i u PubMed Google akademiku

    Doprinosi

    A.O. prikupili, analizirali i interpretirali podatke. E.G.-A. izvršio neke od bioinformatičkih analiza. C.-W.L. obezbedio CMS-IP skupove podataka u BMDM-ovima. R.O.G. primio i održavao Tdg fl/fl miševa i dizajnirao i izvršio uzgoj za kondicion Tdg brisanje kod miševa. A.B. pod uslovom da Tdg fl/fl miševe i savjete o nekim eksperimentima. T.N. pružio savjete i ključne reagense za eksperimente s T-ćelijama. A.O. i A.R. konceptualizirao eksperimente, interpretirao podatke i napisao rukopis. Svi autori su bili uključeni u recenziju i uređivanje rukopisa. Autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

    Dopisni autor


    Pogledajte video: Ok, šta su to enzimi? (Februar 2023).