Informacije

6.5: Lančana reakcija polimeraze (PCR) - Biologija

6.5: Lančana reakcija polimeraze (PCR) - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Pregled

Replikaciju DNK postiže enzim DNK polimeraza koji ima sljedeće karakteristike:

  1. DNK polimeraza katalizira proširenje oligonukleotida u 5'→3' smjer. Ne može ići u suprotnom smjeru.
  2. A DNK šablon (tj. jednolančani oligonukleotid) je potreban. Ovo je informacija koja se replicira (preko Watson-Crick baznog uparivanja). Ako želite da replicirate "sense" lanac DNK dupleksa, tada je šablon anti-sense lanac. Pošto je DNK dupleks, koji zajedno drže nekovalentne sile, možemo razdvojiti niti dupleksa (i dobiti odgovarajući šablon) toplotnom (ili alkalnom) denaturacijom.
  3. DNK polimeraza može samo produžiti postojeći oligonukleotid, ne može pokrenuti replikaciju. Dakle, pored šablona, ​​DNK polimeraza zahtijeva prajmer oligonukleotid. DNK polimeraza produžava prajmer u 5'3' smjer.
  4. Nukleotidi ugrađeni u novonastali oligonukleotid moraju biti nukleozid trifosfati (tj. dNTP-ovi). Energija koja se oslobađa pri hidrolizi fosfat anhidridnih veza koristi se za stvaranje kovalentnih veza (ugradnja a-fosfata u fosfodiestersku kičmu rastućeg oligonukleotida)
  5. Iako DNK polimeraze kataliziraju produžetak u 5'3' smjer, neki imaju mogućnost "lektorisano". "Provera čitanja" je sposobnost prepoznavanja pogrešne inkorporacije baze i sposobnost da se napravi rezervna kopija i izrezivanje netačne baze, a zatim nastavi dalje.

Slika 6.5.1: DNK sinteza

  • PCR je an in vitro tehnika za amplifikaciju regije DNK koja leži između dva regiona poznate sekvence.
  • PCR amplifikacija se postiže upotrebom oligonukleotidnih prajmera. To su obično kratki, jednolančani oligonukleotidi koji jesu komplementarni vanjskim regijama poznatog niza.

Slika 6.5.2: PCR amplifikacija

Oligonukleotidi služe kao prajmeri za DNK polimerazu i svaki od denaturiranih lanaca roditeljskog DNK dupleksa služi kao predložak.

Ovo rezultira sintezom novih lanaca DNK koji su komplementarni matičnim lancima šablona.

Koraci:

  1. Denaturacija šablona
  2. Prajmer žarenje
  3. Produžetak prajmera

obuhvataju jedan "ciklus" u metodologiji PCR amplifikacije.

  • Nakon svakog ciklusa, novosintetizovani lanci DNK mogu služe kao šabloni u sljedećem ciklusu (PCR prajmeri se obično dodaju u značajnom molarnom višku šablonskoj DNK)

Sažetak proizvoda na kraju svakog PCR ciklusa:

Slika 6.5.3: PCR proizvodi

Željeni PCR proizvod će biti a dupleks fragmenta definisane dužine. Pitanje je koliko će ih biti proizvedeno?

· Očekivano pojačanje proizvoda željene definirane dužine u odnosu na izvornu koncentraciju šablona 'x' se stoga može predstaviti formulom:

[(2n - (n + 1)) - (n + 1)] x

ili

(2n - 2(n + 1))

(ovo se često skraćuje na jednostavno pravilo za pojačanje: (2n - 2n) x)

· Tumačenje ove formule je to

  • Za dati broj ciklusa 'n' pravimo '2n x' ukupno mogući dupleks
  • Za dati broj ciklusa postojat će '2(n+1) (ili 2n u našoj aproksimaciji) x' dupleksa koji su formirani ili iz originalnog šablona, ​​ili iz fragmenta neodređene dužine, zajedno sa fragmentom definisane dužine ( i predstavljaju neželjeni proizvod)
  • Dakle, ukupna koncentracija željenog proizvoda (dupleksi sa dužinom definisanom PCR prajmerima) će biti
    (2n - 2(n+1)) x (gdje je x koncentracija originalnog dupleksa)

Teoretska vrijednost pojačanja se nikada ne postiže u praksi. Nekoliko faktora sprečava da se to dogodi, uključujući:

1. Konkurencija komplementarnih ćerki lanaca sa prajmerima za ponovno određivanje (tj. dva ćerka lanca reannealing rezultira bez pojačanja).

2. Gubitak aktivnosti enzima zbog termičke denaturacije, posebno u kasnijim ciklusima

3. Čak i bez termičke denaturacije, količina enzima postaje ograničavajuća zbog viška molarnog cilja u kasnijim ciklusima (tj. nakon 25 - 30 ciklusa previše prajmera treba proširiti)

4. Moguće žarenje prajmera na drugom mjestu i neproduktivno prajmeriranje

Parametri termičkog ciklusa

Parametri termičkog ciklusa su kritični za uspješan PCR eksperiment. Važni koraci u svakom ciklusu PCR-a uključuju:

1. denaturacija šablona (obično se izvodi na najvišoj temperaturi - 100°C)

2. žarenje prajmera (temperatura se bira na osnovu temperature topljenja prajmera)

3. produženje prajmera (izvedeno na optimalnom nivou za polimerazu koja se koristi)

Reprezentativni temperaturni profil za svaki ciklus može izgledati ovako:

Slika 6.5.4: Termalni biciklizam

Puferi i MgCl2 u PCR reakcijama

Tipičan reakcijski pufer za PCR bi nešto poput:

  • 10 mM Tris, pH 8,3
  • 50 mM KCl
  • 1,5 mM MgCl2
  • 0,01% želatina
  • The MgCl2 koncentracija u konačnoj reakcijskoj smjesi je obično između 0,5 do 5,0 mM, a optimalna koncentracija se određuje empirijski (obično između 1,0 - 1,5 mM). Mg2+ joni:
    • formiraju rastvorljivi kompleks sa dNTP-ima koji su neophodni za inkorporaciju dNTP-a
    • stimulišu aktivnost polimeraze
    • povećati Tm (temperaturu topljenja) interakcije prajmera i šablona (tj. služi za stabilizaciju dupleks interakcije

Općenito,

  • nisko Mg2+ dovodi do niskih prinosa (ili bez prinosa) i
  • visoko Mg2+ dovodi do nakupljanja nespecifičnih proizvoda (pogrešno nanošenje).

Izbor polimeraza za PCR

  • Jedan od važnih napredaka koji je omogućio razvoj PCR-a bila je dostupnost termostabilnih polimeraza.
  • Ovo je omogućilo inicijalno dodanom enzimu da preživi temperaturne cikluse koji se približavaju 100 °C.
  • Osobine DNK polimeraza koje se koriste u PCR

Taq/Amplitaq®

Vent™

Deep Vent™

Pfu

Tth

ULTma

95 °C poluživot

40 min

400 min

1380 min

>120 min

20 min

>50 min

Brzina proširenja (nt/sec)

75

>80

?

60

>33

?

Rezultat se završava

3' A

>95% tupo

>95% tupo

tup

3' A

tup

Stranddisplacement

+

+

5'®3' exo

+

+

3'®5' exo

+

+

+

+

Temeljni premazi

Dizajn prajmera

  • Obično se koriste prajmeri dužine 20 - 30 m. Ovo osigurava praktične temperature žarenja (režima visoke temperature gdje je termostabilna polimeraza najaktivnija).
  • Prajmeri bi trebali izbjegavati nizove polibaznih sekvenci (npr. poli dG) ili ponavljajuće motive - oni se mogu hibridizirati s neodgovarajućim registrom na šablonu.
  • Obrnute sekvence ponavljanja treba izbjegavati kako bi se spriječilo stvaranje sekundarne strukture u prajmeru, što bi spriječilo hibridizaciju sa šablonom
  • Treba izbjegavati sekvence komplementarne drugim prajmerima koji se koriste u PCR-u kako bi se spriječila hibridizacija između prajmera (posebno važna za Kraj 3' prajmera)
  • Ako je moguće, 3' kraj prajmera trebao bi biti bogat G, C bazama kako bi se poboljšalo žarenje kraja koji će se produžiti
  • Udaljenost između prajmera treba biti manja od 10 Kb dužine. Obično se primećuje značajno smanjenje prinosa kada se prajmeri protežu jedan od drugog preko ~3 Kb.

Temperatura topljenja (Tm) prajmera

  • Tm hibridizacije prajmera može se izračunati korišćenjem različitih formula. Najčešće korištena formula je:

(1) Tm = [(broj A+T ostataka) x 2 °C] + [(broj G+C ostataka) x 4 °C]

  • Primjeri Tm kalkulacije

G

A

T

C

Tm

15 mer

3

5

2

5

46

20 mer

6

5

4

5

62

30 mer

8

6

8

8

92

Ako je temperatura žarenja previsoka, prajmeri se neće žariti. ako je preniska, mispriming može se pojaviti na mjestima slične DNK sekvence kao i predviđeno mjesto vezivanja prajmera

Analiza PCR eksperimenta

  • Uobičajeno je 25-30 ciklusa
  • Glavni proizvod bi trebao biti dupleks DNK molekul čiji su 5' i 3' krajevi definirani sa dva PCR prajmera
  • Međutim, mogu se proizvoditi i drugi proizvodi. Oni će često predstavljati proizvode sekundarnih mjesta prajminga (pogrešnog prajminga) ili greške pogrešnog ugradnje polimeraze
  • Dakle, PCR proizvod može biti heterogen i mora se odvojiti i analizirati
  • Agarose gel elektroforeza, u kombinaciji sa bojenjem etidij bromidom, najčešća je metoda za odvajanje i analizu PCR proizvoda

Amplifikacija nukleinskih kiselina

Multipleksna polimerazna lančana reakcija

U multipleks PCR-u, dva ili više seta prajmera dizajniranih za amplifikaciju različitih ciljeva uključeni su u istu PCR reakciju. Koristeći ovu tehniku, više od jedne ciljne sekvence u kliničkom uzorku može se pojačati u jednoj epruveti. Kao proširenje praktične upotrebe PCR-a, ova tehnika može uštedjeti vrijeme i trud. Prajmeri koji se koriste u multipleksnim reakcijama moraju biti pažljivo odabrani kako bi imali slične temperature žarenja i ne smiju biti komplementarni jedan drugom. Veličine amplikona trebaju biti dovoljno različite da formiraju različite trake kada se vizualiziraju gel elektroforezom. Multipleks PCR se može dizajnirati ili u PCR reakciji s jednim šablonom koja koristi nekoliko setova prajmera za amplifikaciju specifičnih regija unutar šablona ili PCR reakcijom s više šablona, ​​koja koristi više šablona i nekoliko setova prajmera u istoj reakcionoj cijevi (Slika 9.6 ). Iako upotreba multipleksnog PCR-a može smanjiti troškove i vrijeme za istovremeno otkrivanje dva, tri ili više patogena u uzorku, multipleks PCR je složeniji za razvoj i često je manje osjetljiv od PCR-a s jednim prajmerom. Prednost multipleksnog PCR-a je što se set prajmera može koristiti kao interna kontrola, tako da možemo eliminisati mogućnost lažnih pozitivnih ili negativnih rezultata. Nadalje, multipleks PCR može uštedjeti skupu polimerazu i šablon u nedostatku.

Slika 9.6. Multiplex PCR pregled.


Zašto se Taq koristi u PCR?

Taq polimeraza je toplotno stabilan oblik DNK polimeraza koji mogu funkcionirati nakon izlaganja visokim temperaturama potrebnim za PCR. Druge polimeraze izložen visokim temperaturama korišteno u lančana reakcija polimeraze (PCR) bi denaturirao i postao nefunkcionalan.

Moglo bi se zapitati i zašto je otkriće Taq DNK polimeraze bilo važno za razvoj PCR? Taq polimeraza, prva termostabilna DNK polimeraza za PCR, bio otkriveno 1966 godine. PCR transformisan DNK pojačanje, čineći proces brzim i efikasnim. Ovo bi revolucionisalo kloniranje, DNK testiranje, forenziku i dizajn medicine.

Zašto se onda Thermus aquaticus koristi u PCR?

Upravo zbog ovog svojstva Taq polimeraza je tako važna roba. DNK polimeraza pronađena u Thermus aquaticus ostaje stabilan čak i na vrlo visokim temperaturama. Zbog ove stabilnosti može biti korišteno u procesu poznatom kao lančana reakcija polimeraze, ili PCR.


U biološkim naukama došlo je do tehnološkog napretka koji je disciplinu katapultirao u zlatno doba otkrića. Na primjer, polje mikrobiologije se transformiralo pojavom mikroskopa Antona van Leeuwenhoeka, koji je omogućio naučnicima da po prvi put vizualiziraju prokariote. Razvoj lančane reakcije polimeraze (PCR) jedna je od onih inovacija koje su promijenile tok molekularne nauke svojim uticajem koji obuhvata nebrojene poddiscipline u biologiji. Keppe i saradnici ocrtali su teorijski proces 1971. godine, međutim, prošlo je još 14 godina dok Kary Mullis nije opisao i eksperimentalno primijenio kompletnu PCR proceduru dok je bio u Cetus Corporation 1985. godine. Automatizacija i usavršavanje ove tehnike napredovalo je uvođenjem termički stabilna DNK polimeraza iz bakterije Thermus aquaticus, samim tim i ime Taq DNK polimeraza.

PCR je moćna tehnika amplifikacije koja može generirati dovoljno zaliha specifičnog segmenta DNK (tj. amplikona) iz samo male količine početnog materijala (tj. DNK šablona ili ciljne sekvence). Iako je jednostavna i općenito bez problema, postoje zamke koje komplikuju reakciju dajući lažne rezultate. Kada PCR ne uspije, može dovesti do mnogih nespecifičnih DNK proizvoda različitih veličina koji se pojavljuju kao ljestve ili mrlje od traka na agaroznim gelovima. Ponekad se uopće ne formiraju proizvodi. Drugi potencijalni problem se javlja kada se mutacije nenamjerno uvedu u amplikone, što rezultira heterogenom populacijom PCR proizvoda. Neuspjesi PCR-a mogu postati frustrirajući osim ako se ne upotrijebe strpljenje i pažljivo rješavanje problema kako bi se riješili i riješili problemi. Ovaj protokol opisuje osnovne principe PCR-a, pruža metodologiju koja će rezultirati amplifikacijom većine ciljnih sekvenci i predstavlja strategije za optimizaciju reakcije. Prateći ovaj PCR vodič, studenti bi trebali biti u mogućnosti:

  • Postavite reakcije i uslove termičkog ciklusa za konvencionalni PCR eksperiment
  • Razumjeti funkciju različitih komponenti reakcije i njihov ukupni učinak na PCR eksperiment
  • Dizajnirajte i optimizirajte PCR eksperiment za bilo koji DNK šablon
  • Rješavanje problema s neuspjelim PCR eksperimentima

Povećanje specifičnosti lančane reakcije polimeraze pomoću grafenskog oksida kroz modifikaciju površine: cviterionski polimer je superiorniji od drugih polimera s različitim nabojima

1 Odsjek za biomaterijale, Fakultet za materijale, 2 Državna ključna laboratorija za biologiju ćelijskog stresa, Škola prirodnih nauka, 3 Odsjek za fiziku, Istraživački institut za biomimetiku i meku materiju, Univerzitet Xiamen, Xiamen, People&rsquos Republika Kina

*Ovi autori su podjednako doprinijeli ovom radu

sažetak: Pripremljeni su oksidi grafena (GO) sa različitim površinskim karakteristikama, kao što su veličina, stepen redukcije i naboj, i istraženi su njihovi efekti na specifičnost lančane reakcije polimeraze (PCR). U ovoj studiji pokazujemo da je GO sa velikom veličinom i visokim stepenom redukcije superiorniji od malog i neredukovanog GO u povećanju specifičnosti PCR-a. Negativno nabijena poliakrilna kiselina (PAA), pozitivno nabijeni poliakrilamid (PAM), neutralni polietilen glikol (PEG) i cviterionski polimer poli(sulfobetain) (pSB) koriste se za modificiranje GO. Sposobnost povećanja specifičnosti PCR-a povećava se sljedećim redoslijedom: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Stoga je GO modificiran cviterionskim polimerom superioran u odnosu na druge derivate GO s različitim nabojima u poboljšanju specifičnosti PCR-a. GO derivati ​​se također uspješno koriste za poboljšanje specifičnosti PCR-a za amplifikaciju ljudske mitohondrijske DNK koristeći genomsku DNK krvi kao šablon. Simulacije molekularne dinamike i molekularno spajanje izvode se kako bi se razjasnila interakcija između polimera i Pfu DNK polimeraza. Naši podaci pokazuju da veličina, stepen redukcije i površinski naboj GO utiču na specifičnost PCR-a. Na osnovu naših rezultata, zwitterionski polimer-modifikovani GO može se koristiti kao efikasan aditiv za poboljšanje specifičnosti PCR-a.

Ključne riječi: PCR aditiv, punjenje, pSB, Pfu DNK polimeraza

Lančana reakcija polimerazom (PCR) jedan je od najprisutnijih i najrazvijenijih alata u molekularnoj biologiji. 1,2 Zbog svoje sposobnosti da proizvede milijarde kopija DNK brzim i selektivnim amplifikacijom određene regije u lancu DNK, ima širok spektar primjena u amplifikaciji gena, molekularnom kloniranju i dijagnostici bolesti. 3 Osnovni PCR obično zahtijeva sljedećih pet komponenti: 1) DNK šablon koji sadrži ciljnu regiju DNK, 2) dva prajmera za iniciranje sinteze DNK, 3) termostabilnu DNK polimerazu koja katalizira sintezu DNK, 4) deoksinukleozid trifosfate (dNTPs, zgrada blokovi novog DNK lanca) i 5) pufer uključujući dvovalentne katjone (obično Mg 2+). 4 Često može biti potreban dugotrajan proces optimizacije da bi se postigao uspješan PCR, prvenstveno kada je potrebna amplifikacija iz genomske DNK.

Mnogi faktori će uticati na specifičnost PCR-a, kao što su čistoća prajmera i sekvenca, čistoća DNK šablona, ​​koncentracija Mg 2+, temperatura žarenja i drugi aditivi kao što je dimetil sulfoksid (DMSO), koji se često uključuju u PCR mešavinu . 5,6 Obično, kada je koncentracija DNK šablona vrlo niska, ili je struktura DNK šablona vrlo komplikovana, kao što je gen bogat GC ili genomska DNK sisara, specifičnost PCR-a može biti vrlo niska. Razvijene su različite strategije za poboljšanje specifičnosti PCR-a, kao što je ugniježđeni PCR korištenjem dva odvojena seta prajmera, touchdown PCR s postupno sniženim temperaturama žarenja i vrući start PCR zadržavanjem DNK polimeraze ili prajmera dok reakciona smjesa ne dostigne temperaturu iznad prag za nespecifično vezivanje prajmera za šablon. 4 Međutim, optimizacija dizajna prajmera, uslova ciklusa PCR-a i temperatura žarenja i prilagođavanje koncentracija PCR komponenti su dugotrajni i frustrirajući procesi. Kako bi se poboljšala specifičnost PCR-a, nekoliko malih molekula je korišteno kao aditivi, kao što su DMSO, glicerin, betain, formamid i goveđi serum albumin (BSA). 7,8 Njihova upotreba pojedinačno ili u kombinaciji ne garantuje poboljšanje specifičnosti PCR-a. Stoga je učinak ovih aditiva nepredvidiv. Stoga ostaje izazov pronaći nove aditive za poboljšanje specifičnosti PCR-a.

Poslednjih godina u PCR sistemima se koriste nanomaterijali, uključujući metalne nanočestice, poluprovodničke kvantne tačke, ugljenične nanomaterijale i polimerne nanočestice. 9󈝿 Nanomaterijali često posjeduju jedinstvena fizička i kemijska svojstva, npr. površinski efekat koji proizlazi iz njihovog velikog odnosa površine i zapremine, koji se uvelike razlikuju od makroskopskih materijala. Učinak nanomaterijala na PCR uglavnom ovisi o snažnoj interakciji između PCR komponenti i nanomaterijala. 20 Međutim, iz različitih istraživačkih grupa dobijeni su oprečni rezultati. 21󈞅 Stoga je učinak nanomaterijala s različitim površinskim karakteristikama na PCR još uvijek nejasan i potrebna su mnogo sistemskija i dublja istraživanja da bi se razumio odgovarajući mehanizam.

Naša prethodna studija je pokazala da smanjeni grafen oksid (RGO) može značajno poboljšati specifičnost PCR-a. 19 Međutim, RGO je slabo rastvorljiv u vodi zbog nedostatka funkcionalnih grupa na njegovoj površini, što inhibira dalju primjenu RGO. U poređenju sa RGO, postoji mnogo hidroksilnih, epoksi i karboksilnih grupa na grafen oksidu (GO) ploče, što rezultira visokim polaritetom i hidrofilnošću GO.Dakle, GO je hidrofilan i može se dobro raspršiti u vodi. Dalja modifikacija površine GO-a može dati GO-u neka nova svojstva površine. 26󈞋 U ovoj studiji, GO je modificiran negativno nabijenom karboksil-terminiranom poliakrilnom kiselinom (PAA), pozitivno nabijenim amino-terminiranim poliakrilamidom (PAM), neutralnim polietilen glikolom (PEG) ili zwitterionskim polimerom poli(sulfobetain) (pSB). Pored toga, istražili smo uticaj GO sa različitim svojstvima površine, kao što su veličina, stepen redukcije i modifikacija površine, na specifičnost PCR-a. Otkrili smo da je veliki i RGO bio superiorniji od malih i ne-RGO u poboljšanju specifičnosti PCR-a. Površinski naboj GO je takođe uticao na specifičnost PCR-a sledećim redosledom: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Za polimer-modificirani GO, utvrđeno je da je zwitterionski pSB superiorniji u poboljšanju specifičnosti PCR-a u poređenju s neutralnim i negativno i pozitivno nabijenim polimerima. Ovi GO derivati ​​s različitim površinskim nabojem uspješno su korišteni kao aditivi u amplifikaciji mitohondrijske DNK koristeći genomsku DNK krvi kao šablon. Na osnovu naših rezultata, sugeriramo da GO derivati ​​također mogu poboljšati specifičnost PCR-a DNK male količine dobijene iz kliničkih uzoraka. Simulacije molekularne dinamike i molekularno spajanje se dalje koriste za istraživanje interakcije između polimera i Pfu DNK polimeraza za razumijevanje mehanizma povećanja specifičnosti. Rezultati naših istraživanja mogu u konačnici unaprijediti primjenu GO u biomedicinskim poljima.

Prirodni grafitni prah (320 mesh, Alfa, 99%) kupljen je od Tianjin Guangfu Chemical Agent Co., Ltd. (Tianjin, Narodna Republika Kina). NaNO3, KMnO4, K3PO4 (99%), L-lizin (98%), ninhidrin (97%) i H2O2 kupljeni su od Guoyao Co., Ltd. (Šangaj, Narodna Republika Kina). Akrilna kiselina (AA), akrilamid (AM), H2SO4, HCl, hidrazin hidrat (80%), etanol, NaHCO3, NaOH, Mg2SO4 (99%), metil-crvena i natrijum borat su kupljeni od Xilong Chemical (Guangzhou, Narodna Republika Kina). Kalijum peroksosulfat je kupljen od Dahao Nanhong Industrial Co., Ltd. (Shantou, Narodna Republika Kina). mPEG-NH2 je kupljen od Kaizheng Biotech Development Co., Ltd. (Peking, People’s Republic of China). 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidrohlorid (EDC, 98%) kupljen je od Aladdin Industrial Corporation (Šangaj, Narodna Republika Kina). BSA (98%) i [2-(metakriloiloksi)etil] dimetil-(3-sulfopropil) amonijum hidroksid (SB, 98%) su kupljeni od Sigma-Aldrich. Svi upotrijebljeni reagensi bili su analitičke čistoće reagensa osim posebno navedenih. Cijev za dijalizu (8.000󈝺.000 MWCO) kupljena je od Solarbio Life Sciences (Peking, Narodna Republika Kina). PET-32a plazmidna DNK je kupljena od Novegan, Šangaj, Narodna Republika Kina. The Pfu polimeraza, dNTP, 10× pufer, 0,22 μm filter, agaroza, glicerol, Luria-Bertani bujon, etidijum bromid (EB), DNK marker, pufer za punjenje DNK, bezvodni CaCl2, PCR epruvete, 50× TAE pufer i ampicilin su kupljeni od Sangon Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Narodna Republika Kina). Prajmere je sintetizirao Sangon Biotech Co., Ltd. (Tablica S1). PCR proizvode je sekvencirao Sangon Biotech Co., Ltd. Mini plazmid komplet je kupljen od TIANGEN Biotech Co., Ltd. (Peking, People’s Republic of China). Komplet za pripremu šablona za PCR visoke čistoće kupljen je od Roche Ltd. (Njemačka). U svim eksperimentima korištena je deionizirana voda.

Sinteza GO i njegovih derivata

GO je sintetiziran prema našoj prethodnoj metodi. 32,33 Prvo, 2,0 g grafitnog praha i 1,0 g NaNO3 dodani su u 46 mL 98% H2SO4 u ledenom kupatilu, a zatim 6,0 g KMnO4 je polako dodavan u smjesu uz snažno miješanje. Smjesa je neprekidno miješana 2 sata u ledenom kupatilu i stavljena u vodeno kupatilo na 35°C 30 minuta. Zatim je postepeno dodavano 92 mL vode i temperatura je podignuta na 95°C. Rastvor je mešan 3 sata. Na kraju je dodano 400 mL vode i 6 mL 30% H2O2 je upao u reakciju. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, smjesa je filtrirana i isprana sa 1:10 HCl (volumenski omjer), nakon čega je uslijedilo ponovljeno pranje vodom da bi se uklonila kiselina. Filterski kolač je zatim raspršen u vodi da se dobije grafitni oksid. Eksfolijacija grafitnog oksida do GO postignuta je ultrazvučnom obradom u trajanju od 3 sata na 500 W. Agregat je uklonjen centrifugiranjem na 4.000 rpm tokom 10 minuta. Supernatant je sakupljen i dijaliziran u vodi 1 sedmicu da bi se uklonile zaostale soli.

Mali GO (S-GO) i veliki GO (L-GO) pripremljeni su prema literaturi. 34 Dijalizirani GO rastvor je sonikiran 10 sati, nakon čega je uslijedilo centrifugiranje na 12.000 rpm tokom 20 minuta. Supernatant je sakupljen kao S-GO. Agregat je ponovo dispergovan u vodi i centrifugiran na 2000 o/min 10 minuta. Supernatant je sakupljen kao L-GO. RGO je pripremljen od GO, koji je redukovan hidrazin hidratom u amonijaku. Ukupno 50 mL od 1 mg mL 𕒵 GO stavljeno je u tikvicu sa četiri grla, a zatim je dodano 6 μL 80% hidrazin hidrata i 100 μL 28% amonijum hidroksida. Nakon temeljitog miješanja, otopina je zagrijavana u uljnom kupatilu na 95°C 1 sat. Supernatant je sakupljen i dijaliziran nedelju dana u vodi. Drugi uzorak RGO sa višim stepenom redukcije pripremljen je dodavanjem 42 μL 80% hidrazin hidrata i 700 μL 28% amonijum hidroksida.

GO-PAA i GO-PAM su pripremljeni prema našem prethodnom protokolu. 35 Prvo, 1 mL 1 g mL 𕒵 AA monomera je dodat u 50 mL 1 mg mL 𕒵 GO rastvora uz snažno mešanje na sobnoj temperaturi. Uz pročišćavanje dušikom 30 minuta, 80 mg (NH4)2S2O8 je dodan i zagrijavan na 70°C 3 sata u uljnom kupatilu. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, dodano je 200 mL vode i sonikirano 1 sat, nakon čega je uslijedila dijaliza u trajanju od jedne sedmice da bi se uklonila slobodna PAA. Nakon centrifugiranja na 4000 rpm tokom 30 minuta, supernatant je sakupljen kao GO-PAA. GO-PAM i GO-pSB su pripremljeni na sličan način samo što je AA monomer zamijenjen AM ili SB monomerom. Za pripremu GO-pSB, kao inicijator je korišćen kalijum peroksosulfat i reakciona smeša je zagrevana na 70°C 15 sati.

GO-PEG je pripremljen prema literaturi. 36 Prvo, 10 mL 3 M NaOH je pomiješano sa 20 mL 2 mg mL 𕒵 GO rastvora i sonikirano 3 sata. Zatim je dodat 10% HCl da se rastvor neutrališe na pH 7. Smeša je filtrirana i isprana vodom. Filterski kolač je zatim dispergovan u 40 mL vode. Ukupno 80 mg mPEG-NH2 je dodan u otopinu i sonikiran 5 minuta. Zatim je dodano 20 mg EDC-a i sonikirano još 30 minuta, nakon čega je uslijedilo dodavanje 60 mg EDC-a i miješanje preko noći. Supernatant je sakupljen i dijaliziran nedelju dana u vodi da se ukloni višak mPEG-NH2. Nakon 30 minuta centrifugiranja na 4000 rpm, supernatant je sakupljen kao GO-PEG.

Karakterizacija GO i njegovih derivata

Slike mikroskopije atomske sile (AFM) su dobijene u režimu tapkanja u vazduhu pomoću Nanoscope Multimode 8 (Veeco Instruments Inc., SAD). Spektri apsorpcije UV–vis dobijeni su korištenjem TU-1901 UV–Vis spektrometra (Peking Purkinje General Instrument, People’s Republic of China). Infracrveni spektri Fourierove transformacije (FTIR) su snimljeni na Nicolet iS10 spektrometru (Thermo Scientific, SAD). Sistem difrakcije rendgenskih zraka na prahu (XRD) (Ultima IV Rigaku, Japan) opremljen Cu Kα zračenjem (λ ɣ.542 Å) je korišten za karakterizaciju kristalografskih struktura materijala. Spektri rendgenske fotoelektronske spektroskopije (XPS) snimljeni su na rendgenskom fotoelektronskom spektrometru Phi Quantum 2000 (PHI, SAD). Termička gravimetrijska analiza (TGA) je izvedena na SDT-Q600 (TA Instruments, SAD) u atmosferi azota pri brzini zagrijavanja od 10°C min 𕒵 . Zeta potencijali su mjereni pomoću Malvern Nano-ZS (Malvern Instruments, Co., UK). Provedene su Boehmove titracije 37 da bi se odredio sadržaj karboksilnih i hidroksilnih grupa na površini RGO. Afinitet vezivanja Pfu polimeraza sa GO i RGO proučavana je izotermnim titracionim kalorimetrima (NANO ITC TA Instruments) na 25°176°C. Pfu polimeraza je titrirana sa GO i RGO različitog sadržaja karboksila (8.39%, 7.28% i 5.43%, respektivno). Ćelija uzorka je napunjena sa 0,12 μg mL 𕒵 Pfu polimeraze, a referentna ćelija je napunjena vodom. U svakom eksperimentu, 50 μL od 100 μg mL 𕒵 RGO je uzeto špricom i dodavano u ćeliju uzorka u jednakim intervalima od 200 sekundi. Promjene topline su mjerene nakon svakog dodavanja. Kalorimetrijski podaci za grafen–Pfu vezivanje polimeraze je analizirano korišćenjem softvera NanoAnalyze za NANO ITC.

PCR i elektroforeza u agaroznom gelu

PET-32a plazmid je korišten kao šablon za PCR. Sljedeće komponente su pomiješane u prvom krugu PCR-a: 1× PCR pufer koji sadrži 2 mM Mg 2+, dNTP (svaki 0,2 mM), prajmer F1 (0,4 μM), prajmer R1 (0,4 μM) ( Tabela S1), plazmidna DNK (0,5 ng μL 𕒵 ) i Pfu polimeraza (0,1 U μL 𕒵 ). U PCR sistem su dodavani GO ili njegovi derivati ​​različitih koncentracija. Svaki uzorak je dopunjen vodom do konačne zapremine od 25 μL. U drugom krugu PCR-a, postavljeni su isti uvjeti reakcije, osim što je 0,5 μL PCR proizvoda korišteno za zamjenu plazmidne DNK kao šablona. PCR uslovi su opisani u tabeli S2.

Studiju je odobrio Etički komitet Medicinskog fakulteta Univerziteta Xiamen. Uzorci krvi su uzeti od zdravih dobrovoljaca koji su dali pismeni informirani pristanak. Ljudska genomska DNK je izolovana korišćenjem kompleta za pripremu šablona za PCR visoke čistoće. Ukupno 20 ng μL 𕒵 DNK je dodato umjesto plazmidne DNK. Prajmeri F2 i R2 (Tabela S1) korišteni su za amplifikaciju fragmenta ljudske mitohondrijalne DNK. PCR komponente su bile iste kao gore, osim što je plazmidna DNK zamijenjena sa 2,5 μL genomske DNK. U drugom ili trećem krugu PCR-a, 2,5 μL posljednjeg kruga PCR proizvoda korišteno je kao šablon umjesto genomske DNK. PCR uslovi su navedeni u tabeli S2. PCR su rađeni u T3 termocikleru (Biometra, Njemačka). PCR proizvodi su podvrgnuti elektroforezi u 1,5% agaroznom gelu 30 minuta, obojeni sa 0,5 μg mL 𕒵 EB i analizirani korištenjem Gel Doc XR sistema (Bio-Rad, SAD). Intenzitet fluorescencije trake PCR proizvoda analiziran je modulom za analizu optičke gustine softvera Image Lab.

In silico simulacija Pfu interakcija polimeraze–polimera

Simulacije molekularne dinamike i molekularno spajanje korišteni su za proučavanje moguće interakcije između polimera i Pfu polimeraza. Ionizirani oblici PAA, PAM i pSB korišteni su u svim pristajanjima i simulacijama (slika S1). Simulacije molekularne dinamike izvedene su pomoću Groningen mašine za hemijsku simulaciju (GROMACS 5.0.4). 38 Polje sile CHARMM36 39 korišteno je za DNK polimerazu, a voda jednostavnog punjenja za rastvarač. Svaki polimer–proteinski kompleks stavljen je u kutiju za simulaciju (14吊吊 nm) i napunjen rastvaračem. PAA i PAM imaju neto troškove od 󔽎e i 70e, respektivno. PEG i pSB su neutralni. Pfu polimeraza ima neto naboj od 𕒸e. Na + i Cl − joni su dodani da neutraliziraju neto naboje sistema. U svakoj nezavisnoj simulaciji, polimer je stavljen na nasumično mjesto oko proteina. Prije dinamike, struktura je opuštena kroz minimiziranje energije korištenjem algoritma najstrmijeg spuštanja. Da bi se uravnotežio sistem, izvršena je 100 ps NVT simulacija, nakon čega je uslijedila 100 ps NPT simulacija. Temperatura sistema je održavana na 345 K (72°C), što je temperatura istezanja za Pfu polimeraza. Elektrostatičke interakcije su obrađene korištenjem Ewald metode glatke mreže čestica. Sve veze u simuliranim molekulima su ograničene na njihove referentne vrijednosti pomoću Linear Constraint Solver-a. Energije Coulovog kratkog dometa su izračunate nakon postizanja ravnoteže.

Kako bi se izračunala moguća aktivna mjesta u DNK polimerazi, Molecular Operating Environment (2012.10) je izvršio Site Finder. 40 Svrha simulacije spajanja je izračunavanje i bodovanje interakcija između liganada i Pfu polimerazu pomoću softvera AutoDockVina 1.1.2 sa svojim zadanim parametrima polja sile. 41 Pet nezavisnih simulacija pristajanja, svaka sa 10 lokacija Pfu polimeraze za probno ispitivanje, provedene su za svaki polimer–proteinski sistem.

Priprema i karakterizacija GO i njegovih derivata

Slika 1 prikazuje pripremu S-GO, L-GO, GO-PAA, GO-PEG, GO-PAM i GO-pSB. GO je sintetiziran iz prirodnog grafita modificiranom Hummers metodom. 32,33 S-GO i L-GO pripremljeni su tehnologijom centrifugiranja velike brzine. AFM slike su pokazale da je prosječna veličina S-GO (50 nm) bila mnogo manja od L-GO (500 nm), dok je debljina bila Ӭ,9 nm za oba uzorka (Slika S2). Rezultat pokazuje da su i S-GO i L-GO jednoslojni listovi iste debljine. 42 Dakle, možemo isključiti uticaj debljine GO na specifičnost PCR-a u potonjim eksperimentima. Kalemljenje polimera na površinu GO rezultiralo je povećanjem debljine na 1𔃁 nm (slika S2C–F). Boehmove titracije su pokazale da je količina karboksilnih grupa S-GO i L-GO bila 9,01% i 8,17%, respektivno. S-GO je imao više karboksilnih grupa zbog većeg odnosa površine i zapremine. Zeta potencijal S-GO (󔼵.1۪.6 mV) bio je niži od L-GO (󔼫.6۪.8 mV), što znači da je sadržaj karboksilnih grupa u S-GO veći od tog L-GO, a rezultat je u skladu s rezultatima iz Boehm titracije.

Slika 1 Priprema GO i njegovih derivata.
napomene: (A) Priprema S-GO i L-GO. (B) Priprema četiri GO derivata. Fotografije pokazuju boju različitih GO i GO derivata u vodi. (C) Molekularne formule PAA, PAM, PEG i pSB.
Skraćenice: EDC, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidrohlorid GO, grafen oksidi L-GO, veliki GO PAA, poliakrilna kiselina PAM, poliakrilamid PEG, polietilen glikol pSB, poli(sulfobetain) S-GO, mali GO.

GO-PAA, GO-PAM i GO-pSB su pripremljeni polimerizacijom slobodnih radikala AA, AM i SB monomera na GO površini, respektivno. S druge strane, mPEG-NH2 je konjugiran sa karboksilnim grupama na GO putem formiranja amida kataliziranog karbodiimidom. Ultraljubičasti–vidljivi (UV–vid) spektri (Slika S3), FTIR spektri (Slika S4), XRD spektri (Slika S5) i XPS spektri (Slika S6) korišteni su za karakterizaciju svih uzoraka i navedenih u Dodatnim materijalima. Sve ove karakteristike su pokazale da su PAA, PAM, PEG i pSB uspješno presađeni na GO. TGA GO, GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG i GO-pSB prikazan je na slici S7. TGA GO sa sadržajem 8,39% karboksila pokazuje dva regiona gubitka mase. Prvi gubitak težine na temperaturi °C pripisuje se gubitku adsorbirane vode. Drugi gubitak težine između 180°C i 230°C pripisuje se razgradnji funkcionalnih grupa koje sadrže kiseonik, kao što su karboksilne, epoksidne i hidroksilne grupe, u GO. Gubitak težine grafena opada sa smanjenjem sadržaja karboksila (slika S7A). U poređenju sa GO, drugi gubitak težine derivata GO se dešava na višoj temperaturi, što je uglavnom posledica razgradnje polimernog lanca. Izračunavanjem procenta gubitka težine, izračunati sadržaji PAA, PAM, PEG i pSB iznosili su 43,48%, 40,96%, 42,53% i 38,70%, respektivno (Tabela S3). Ovi polimerom modificirani GO imaju sličan sadržaj polimera. Dakle, možemo isključiti efekte sadržaja polimera na specifičnost PCR-a u potonjim eksperimentima.

Zeta potencijali GO i RGO bili su 󔼯.1۪.5 mV i 󔼗.6۪.3 mV, respektivno, što ukazuje da je GO stabilniji od RGO. Nakon cijepljenja polimera na površinu GO, zeta potencijal GO-PAA (󔼶.9۪.9 mV) postao je negativniji zbog negativnog naboja COO − u PAA. Zeta potencijal GO-PAM povećan je na 󔼠.1۫.2 mV zbog pozitivno nabijenog NH3 + u PAM-u. Negativan potencijal GO-PEG (󔼫.7۪.8 mV) i GO-pSB (󔼜.4۪.9 mV) rezultat je COO − grupa na GO površini, iako je PEG bio neutralni polimer i pSB bio je cviterionski polimer (tablice S4 i S5).

Utjecaj veličine GO na PCR

Uobičajeni proces PCR-a uključuje 25󈞊 ciklusa ponovljene promjene temperature. Tipičan PCR ciklus sastoji se od sljedeća tri koraka: 1) denaturacija DNK šablona, ​​2) žarenje dva sintetička prajmera na DNK šablona i 3) produžavanje vezanih prajmera katalizovanih termostabilnom DNK polimerazom. 5 Iako PCR može eksponencijalno umnožiti ciljni gen, nespecifična amplifikacija ostaje problem. Naročito u višestrukom PCR-u, neizreagirani početni DNK šablon i prajmeri ometaju reakciju i uzrokuju nakupljanje nespecifičnih proizvoda. 43 U početnim studijama koristili smo plazmid pET-32a kao šablon PCR amplifikacije. Optimalna koncentracija šablona određena je serijskim eksperimentima razrjeđivanja (Slika S8). Ukupno 0,5 ng μL 𕒵 plazmida smatrano je optimalnom koncentracijom šablona u prvom krugu PCR-a, a 0,5 μL prvog kruga PCR proizvoda je optimalna koncentracija šablona u drugom krugu PCR-a. Ispitivan je efekat GO različitih veličina (S-GO i L-GO) na dva kruga PCR-a. U prvom krugu PCR-a, intenzitet ciljne trake od 689 bp opada s povećanjem koncentracije GO, što ukazuje da reakciju inhibiraju i S-GO i L-GO pri visokoj koncentraciji (4,8 μg mL 𕒵 za S-GO i 6,4 μg mL 𕒵 za L-GO Slika 2A–C). U drugom krugu PCR-a, prvi krug PCR-a je korišten kao šablon.Budući da PCR proizvod sadrži ne samo ciljni proizvod već i neizreagirani početni DNK šablon, prajmere i nespecifične proizvode, ove tvari bi poremetile drugi krug PCR-a i uzrokovale akumulaciju nespecifičnih proizvoda, što bi dovelo do očitih razmaznih traka bez GO (slika 2D i E). Međutim, nakon dodavanja S-GO ili L-GO, mrlje su nestale. Nespecifični proizvodi su smanjeni sa povećanjem koncentracije S-GO i L-GO. L-GO je imao bolji učinak od S-GO, jer je imao širi raspon efikasnosti koncentracije za poboljšanje specifičnosti PCR-a (1.6𔃁.2 μg mL 𕒵 za S-GO u odnosu na 0.8𔃂.8 μg mL 𕒵 za L-GO tabelu S6).

Slika 2 Učinak GO različitih veličina na PCR prvog i drugog kruga.
napomene: M: DNK marker. (A) S-GO u prvom krugu PCR. (B) L-GO u prvom krugu PCR. (C) Intenzitet PCR trake pri različitim koncentracijama GO u prvom krugu PCR. (D) S-GO u drugom krugu PCR-a. (E) L-GO u drugom krugu PCR. (F) Intenzitet PCR trake pri različitim koncentracijama GO u drugom krugu PCR-a. Koncentracija GO u stazama 1𔃅 je 0 μg mL 𕒵 , 0,8 μg mL 𕒵 , 1,6 μg mL 𕒵 , 3,2 μg mL 𕒵 , 3,2 μg mL . 𕒵 , 6,4 μg mL 𕒵 i 8,0 μg mL 𕒵, respektivno.
Skraćenice: GO, grafen oksidi L-GO, veliki GO PCR, lančane reakcije polimeraze S-GO, mali GO.

Naša radna hipoteza za uočeni efekat koncentracije GO je sljedeća. Kada je koncentracija GO niska, adsorbirana količina je pozitivno nabijena Pfu polimeraze i Mg 2+ na negativno nabijenoj GO površini bila je relativno visoka. Zatim negativno nabijene molekule, kao što su DNK šablon, prajmeri i dNTP, privlače pozitivno nabijeni Pfu polimeraza na GO površini. Tako se smanjuje vjerovatnoća neusklađenosti i poboljšava specifičnost PCR-a. Međutim, daljnjim povećanjem koncentracije GO povećava se količina negativno nabijenog GO u PCR sistemu, pa se adsorbirana količina pozitivno nabijenog Pfu polimeraza i Mg 2+ na jednoj GO površini se smanjuju. Štaviše, višak negativnih naboja GO će odbiti negativno nabijene prajmere i dNTP, što će dovesti do supresije PCR-a. Mjerili smo zeta potencijale GO i njegove mješavine sa Pfu polimeraze u vodi (Tabela S4). Zeta potencijal S-GO je porastao sa 󔼵.1۪.6 mV na 󔼩.2۪.9 mV, dok je zeta potencijal L-GO porastao sa 󔼫.6۪.8 mV na �V. , potvrđujući jaču elektrostatičku interakciju između S-GO i Pfu polimeraze nego kod L-GO i Pfu polimeraza. Sličan trend je dobijen u PCR puferu (Tabela S5). Rezultat se pripisuje većem sadržaju negativno nabijenih karboksilnih grupa u S-GO (9.01%) nego u L-GO (8.17%). Stoga, S-GO inhibira PCR pri nižoj koncentraciji (1,6 μg mL 𕒵) od L-GO (6,4 μg mL 𕒵), a L-GO ima širi raspon koncentracija kako bi poboljšao specifičnost PCR-a .

Efekat stepena redukcije GO na PCR

RGO smo pripremili koristeći hidrazin kao reduktor u amonijaku. Boehmove titracije i TGA (slika S7A) pokazali su da je sadržaj karboksila smanjen sa 8,39% na 5,43% nakon redukcije. Zeta potencijali su nakon redukcije povećani sa 󔼯.1۪.5 mV na 󔼗.6۪.3 mV. U prvom krugu PCR-a, intenzitet traka se smanjivao s povećanjem koncentracija GO i RGO (Slika 3A–D). Istovremeno je smanjen inhibicijski efekat smanjenjem sadržaja karboksilnih grupa na GO. U drugom krugu PCR-a pojavile su se očigledne mrlje koje su se smanjivale s povećanjem koncentracija GO i RGO. Efikasni raspon koncentracije za optimalnu specifičnost PCR-a GO (8.39%), RGO (7.28%) i RGO (5.43%) je 0.8𔃁.2 μg mL 𕒵 , 3.2𔃂.8 μg mL 𕒵 i 0,8𔃄.4 μg mL 𕒵, respektivno. Specifičnost PCR se povećava, a inhibicijski efekat na PCR opada sa smanjenjem sadržaja karboksila u GO, što pokazuje da karboksilne grupe na GO imaju značajan uticaj na PCR. RGO ima manje negativnih naboja od GO, što rezultira manjim elektrostatičkim odbijanjem negativno nabijenih PCR komponenti. Osim toga, jača interakcija između prstenastih struktura nukleobaza i poliaromatične ugljovodonične strukture RGO dovodi do većeg afiniteta RGO sa DNK lancima nego one GO sa DNK. RGO ima savršeniju heksagonalnu rešetku od GO, tako da ima jače hidrofobne interakcije i interakcije s π slaganje sa Pfu polimeraze nego GO sa Pfu polimeraza. The Pfu polimeraza se sastoji od 775 aminokiselina, uključujući 26 fenilalanina, 47 tirozina i 11 triptofana, da svi ovi molekuli sadrže benzenske prstenove. Bogati nepolarni benzeni ovih aromatičnih aminokiselina mogu se snažno vezati za grafenski list putem π–π interakcije. 44 Stoga je RGO superiorniji od GO u poboljšanju specifičnosti PCR-a zbog manje elektrostatičke odbijanja negativno nabijenih PCR komponenti i većeg afiniteta prema DNK šablonu i Pfu polimeraza. Elektrostatička apsorpcija između pozitivno nabijenih Pfu polimeraze i RGO je manji od onog između Pfu polimeraza i GO sa više negativnih naboja, a hidrofobna interakcija je pokretačka snaga za adsorpciju enzima na RGO. 45 Dakle, RGO ima jači afinitet sa Pfu polimeraza od GO. Ovaj zaključak je dodatno potkrijepljen analizom izotermalne titracione kalorimetrije (ITC) (Tablica S7 i Slika S9). Konstante disocijacije (Kd) za grafen–Pfu interakcija polimeraze iznosila je 12,3 mol 𕒹, 10,5 mol 𕒹 i 3,96 mol 𕒹 za GO (8,39% karboksil), RGO (7,28% karboksil) i RGO (5,43% karboksil), redom. Negativne vrijednosti promjene Gibbsove slobodne energije (ΔG) potvrdio spontano vezivanje grafena sa Pfu polimeraza. 46,47 Što više RGO (5.43%) ima najnižu Kd i više negativnih ΔG vrijednosti, što ukazuje na veći afinitet između RGO i Pfu polimeraze nego između GO i Pfu polimeraza.

Slika 3 Utjecaj stepena redukcije GO na PCR.
napomene: (A) GO (8.93%) u prvom krugu PCR. (B) RGO (7.28%) u prvom krugu PCR. (C) RGO (5.43%) u prvom krugu PCR. (D) Intenzitet PCR trake pri različitim koncentracijama GO i RGO u prvom krugu PCR. (E) GO (8.93%) u drugom krugu PCR. (F) RGO (7.28%) u drugom krugu PCR. (G) RGO (5.43%) u drugom krugu PCR. (H) Intenzitet PCR trake pri različitim koncentracijama GO i RGO u drugom krugu PCR. M: DNK marker. Procenti ukazuju na sadržaj karboksilnih grupa određen TGA i Boehm titracijom u GO i RGO. Koncentracija GO i RGO u trakama 1𔃅 je 0 μg mL 𕒵 , 0,8 μg mL 𕒵 , 1,6 μg mL 𕒵 , 3,2  μg μg mL. #956g mL 𕒵 , 6,4 μg mL 𕒵 i 8,0 μg mL 𕒵, respektivno.
Skraćenice: GO, grafen oksid RGO, redukovani grafen oksid PCR, polimerazna lančana reakcija TGA, termalna gravimetrijska analiza.

Učinak modifikacije GO površine na PCR

Da bismo dalje istražili učinak modifikacije GO površine na specifičnost PCR-a, modificirali smo GO negativno nabijenim PAA, pozitivno nabijenim PAM-om, neutralnim PEG-om i zwitterionskim pSB-om. U prvom krugu PCR-a nisu pronađene razmazane trake za sve uzorke, što ukazuje na dobru specifičnost PCR-a (Slika 4A–E). U drugom krugu PCR-a, nespecifični razmaz se pojavio u kontrolnim eksperimentima bez aditiva, ali su razmazi opadali s povećanjem koncentracije GO derivata, što ukazuje da je specifičnost PCR-a pojačana u svim PCR sistemima potpomognutim GO derivatima. U poređenju sa GO-PAA, GO-PAM i GO-PEG, GO-pSB ima manje trake razmazivanja (slika 4F–J) i širi opseg efektivne koncentracije (9,6󈞄.0 μg mL 𕒵 tabela S6), što ukazuje da GO-pSB ima bolje performanse za poboljšanje specifičnosti PCR-a od drugih polimer-modifikovanih GO. Sposobnost poboljšanja specifičnosti PCR-a povećava se sljedećim redoslijedom: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Rezultati pokazuju da je GO-pSB superiorniji u odnosu na druge polimer-modificirane GO u poboljšanju specifičnosti PCR-a. Tabela S6 poredi efikasan opseg koncentracije za optimalnu specifičnost PCR-a GO, RGO, polimer-modifikovanih GO i četiri polimera prema rezultatima drugog kruga PCR-a. U poređenju sa RGO, GO-pSB ima mnogo bolju rastvorljivost. U međuvremenu, on takođe ima mnogo širi opseg efikasnosti koncentracije od GO i RGO.

Slika 4 Učinak GO derivata na PCR prvog i drugog kruga.
napomene: M: DNK marker. Koncentracija GO derivata u trakama 1𔃆 u (A), (B), (F) i (G) je 0 μg mL 𕒵 , 0.8 μg mL 𕒵 , 1.6 μg mL 𕒵 , 3.2 μg mL 𕒵 , 4.8  _ 956g mL 𕒵 , 8,0 μg mL 𕒵 i 9,6 μg mL 𕒵, respektivno. Koncentracija GO derivata u trakama 1𔃄 u (C), (D), (H) i (I), je 0 μg mL 𕒵 , 4,8 μg mL 𕒵 , 9,6 μg mL 𕒵 , 14,4 μg mL 𕒵 , 19,2 g 𕒵 _ i 42 m . #956g mL 𕒵 , respektivno. Sadržaj PAA, PAM, PEG i pSB u GO derivatima je 43,48%, 40,96%, 42,53% i 38,70%, redom. (E) Intenzitet PCR trake pri različitim koncentracijama GO derivata u 1. krugu PCR. (J) Intenzitet PCR trake pri različitim koncentracijama GO derivata u 2. krugu PCR.
Skraćenice: GO, grafen oksid PAA, poliakrilna kiselina PAM, poliakrilamid PCR, polimerazne lančane reakcije PEG, polietilen glikol pSB, poli(sulfobetain).

Kako bismo potvrdili da je povećanje specifičnosti PCR rezultat polimer-modificiranih GO, a ne polimera, istražili smo učinak golih polimera na specifičnost PCR-a bez GO. Izračunate količine polimera prema TGA podacima derivata GO dodane su u PCR sistem. Rezultati pokazuju da nema promjene u opsegu (slika S10). Tek kada je koncentracija polimera povećana ɭ.000 puta sa mikrograma po mililitru na miligram po mililitru, specifičnost PCR-a bi se mogla poboljšati (slika S11). Ovi rezultati ukazuju na to da je povećanje specifičnosti PCR rezultat polimerom modificiranog GO, a ne golih polimera. Na osnovu prethodnih rezultata, GO nije dobar pojačivač specifičnosti PCR-a. Dakle, povećanje specifičnosti PCR derivata GO pripisuje se kombinaciji ili sinergističkom učinku GO i polimera.

Slika 5 pokazuje da su pri visokim koncentracijama GO ili GO derivata kontrolne trake (traka 1) inhibirane. Da bi se testiralo da li Pfu polimeraza se adsorbuje na površine GO i njegovih derivata, BSA je dodat u PCR sistem inhibiran viškom GO i GO derivata. Nakon dodavanja BSA, svi PCR se obnavljaju i intenzitet trake se povećava sa povećanjem koncentracije BSA. Rezultat se pripisuje konkurentnoj adsorpciji BSA na površini GO i njegovih derivata. Dakle, adsorbovana Pfu polimeraza je puštena u otopinu, što je rezultiralo oporavkom PCR-a. Rezultati pokazuju da postoji jaka interakcija između GO ili GO derivata i Pfu polimeraza. Takođe smo inkubirali GO i njegove derivate sa Pfu polimeraze 1 sat u ledu kako bi se omogućila dovoljna apsorpcija Pfu polimeraza sa GO ili njenim derivatima. Zatim smo dodali druge PCR komponente i izvršili PCR. Slika S12 potvrđuje efikasan PCR nakon adsorpcije Pfu polimeraze na GO ili njenih derivata.

Slika 5 Učinak BSA na PCR inhibiran od strane GO i njegovih derivata.
napomene: M: DNK marker. (A) GO (9,6 μg mL 𕒵 ), (B) GO-PAA (4,8 μg mL 𕒵 ), (C) GO-PAM (8.0 μg mL 𕒵 ). (D) GO-PEG (24,0 μg mL 𕒵 ) i (E) GO-pSB (24,0 μg mL 𕒵). Koncentracija BSA u trakama 1𔃂 je 0 μg mL 𕒵 , 2,0 μg mL 𕒵 , 20,0 μg mL 𕒵 i 200,0 μg mL 𕒵, odnosno 200,0 μg mL.
Skraćenice: BSA, goveđi serum albumin GO, grafen oksid PAA, poliakrilna kiselina PAM, poliakrilamid PCR, polimerazna lančana reakcija PEG, polietilen glikol pSB, poli(sulfobetain).

PCR je inhibiran kada je koncentracija derivata GO dodatno povećana (slika 4). Svaki GO list može adsorbirati pozitivno nabijen Pfu polimeraze ili Mg 2+ zbog svoje velike površine i mnogih negativno nabijenih karboksilnih grupa. Povećanje koncentracije derivata GO će smanjiti količinu adsorpcije Pfu polimeraza i Mg 2+ na jednom GO listu, što rezultira manjom efikasnošću PCR-a. Kada se višak Mg 2+ doda u PCR sistem, više Mg 2+ će se dalje adsorbirati na negativno nabijenim GO derivatima sa Pfu polimeraza za oporavak PCR. Slika 6 pokazuje da se inhibirane trake obnavljaju nakon dodavanja 1𔃀 mM Mg 2+. Stoga, rezultati dalje pokazuju da će PCR biti inhibiran ako se Pfu polimeraza i Mg 2+ adsorbirani na jednom GO derivatu se smanjuju.

Slika 6 Utjecaj koncentracije Mg 2+ na PCR uz pomoć GO i njegovih derivata.
napomene: M: DNK marker. (A) GO (9,6 μg mL 𕒵 ). (B) GO-PAA (4,8 μg mL 𕒵). (C) GO-PAM (8.0 μg mL 𕒵 ). (D) GO-PEG (24,0 μg mL 𕒵 ). (E) GO-pSB (24,0 μg mL 𕒵). Koncentracija dodanog Mg 2+ u stazama 1𔃂 je 0 mM, 0,4 mM, 1,0 mM i 2,0 mM, respektivno (originalni 2 mM Mg 2+ nije uključen).
Skraćenice: GO, grafen oksid PAA, poliakrilna kiselina PAM, poliakrilamid PCR, polimerazna lančana reakcija PEG, polietilen glikol pSB, poli(sulfobetain).

Pfu polimeraza ima lektorsku aktivnost i može se koristiti umjesto Taq polimeraze za obavljanje veće vjernosti sinteze DNK. Kako bi se potvrdilo da li bi GO ili njegovi derivati ​​utjecali na vjernost PCR-a, sekvencirani su svi PCR proizvodi u odsustvu ili prisustvu GO i njegovih derivata. Podaci potvrđuju da GO i njegovi derivati ​​nemaju utjecaja na vjernost Pfu polimeraza (Slika S13). Rezultati dalje pokazuju da je poboljšana specifičnost PCR-a i vjernost Pfu polimeraza je zagarantovana u prisustvu GO derivata.

Primjena u kliničkim uzorcima

Konačno, GO derivati ​​su također korišteni za poboljšanje specifičnosti PCR-a za amplifikaciju komplikovanih kliničkih uzoraka. Kao šablon je korištena genomska DNK ljudske krvi. Umnožen je fragment mitohondrijske DNK od 324 bp. U prvom i drugom krugu PCR-a, za sve uzorke nisu uočene razmazane trake, ali je ciljna traka slabija za PCR drugog kruga bez GO derivata nego kod uzorka sa GO derivatima (slika 7). U trećem krugu PCR-a postoji jaka razmazna traka za PCR bez GO derivata i ciljna traka postaje zanemarljiva. Međutim, ciljni pojasevi su i dalje izvanredni sa niskim nespecifičnim proizvodima u prisustvu GO derivata. Stoga, GO derivati ​​povećavaju specifičnost PCR-a za amplifikaciju komplikovanih kliničkih uzoraka. Rezultati pokazuju da derivati ​​GO mogu imati potencijalnu primjenu u kliničkoj molekularnoj dijagnostici.

Slika 7 Primjena GO derivata za pojačavanje kliničkih uzoraka.
napomene: Predložak je mitohondrijska DNK iz genomske DNK ljudske krvi dobijena iz kliničkih uzoraka. M: DNK marker 1: prvi krug PCR 2: drugi krug PCR 3: treći krug PCR C: kontrolni eksperimenti bez GO derivata. Koncentracije GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG i GO-pSB su 0,6 μg mL 𕒵 , 2,4 μg mL 𕒵, 4,8 μg mL 𕒵 i 956. mL 𕒵 , respektivno.
Skraćenice: GO, grafen oksid PAA, poliakrilna kiselina PAM, poliakrilamid PCR, polimerazna lančana reakcija PEG, polietilen glikol pSB, poli(sulfobetain).

Simulacija interakcije između polimeraze i polimera

Vrlo je teško direktno simulirati interakciju između polimeraze i polimerom modificiranog GO. Stoga su simulacija molekularne dinamike i molekularno spajanje korišteni za proučavanje moguće interakcije između polimera i polimera. Pfu polimeraza kada je GO zanemaren radi pojednostavljenja. Pfu polimeraza sadrži sljedećih pet domena: N-terminal (ostaci 1� i 327�), egzonukleazu (131�), dlan (369� i 501� i 501� i 501� i 501� domene prstiju2585) 589�) (Slika S14). Mehanizam korekture i polimerizacije koordinira se iz interakcije između petlje (144�) domene egzonukleaze i pozitivno nabijene ivice domene palca. 48 Molekularno spajanje je pokazalo da su mjesta vezivanja polimera locirana u domenu egzonukleaze, palca, dlana i prstiju pomoću proračuna pristajanja (Slika S14). Afiniteti vezivanja su se smanjivali sljedećim redoslijedom: PAA > PAM > PEG > pSB (Tabela S8). Energije Coulovog kratkog dometa su široko fluktuirale tokom ravnoteže od 10 ns, dostižući stabilno nakon Ӱ ns (Slika S15A i B). Coul Short Range analiza energije pokazuje da postoji jaka elektrostatička interakcija između PAA i Pfu (𕒶,248𫐳 kJ mol 𕒵 ). Energija Coul Short Range of Pfu-PAM je �𫏓 kJ mol 𕒵 , dok PEG i pSB nemaju skoro nikakvu elektrostatičku interakciju sa Pfu (Tabela S9). Ovaj redosled je u skladu sa PCR rezultatima (Slika S11). Površina pristupačne rastvaraču (SASA) je površina biomolekule koja je dostupna otapalu. SASAs of Pfu-PEG i Pfu-pSB su gotovo ekvivalentni u 10 ns (slika S15C), što ukazuje da PEG i pSB imaju sličan utjecaj na vezivanje enzima i supstrata. Minimalna udaljenost PEG i Pfu fluktuira u širokom rasponu, što ukazuje na veću fleksibilnost PEG-a od pSB-a (slika S15D).Kumulativna distribucija rastvarača pokazuje da je dipolna površina molekula rastvarača oko PEG-a mnogo veća od one kod pSB-a (Slika S15E i F), što ukazuje da PEG i pSB utiču na otapalo i protein na različitim nivoima. Simulacije molekularne dinamike pokazale su da je Pfu–PAA kompleks (PAA: smeđa traka ispod Pfu) je imao najjaču interakciju, a zatim slijedi Pfu–PAM kompleks (PAM: plava traka ispod Pfu) (Slike 8A i B). Interakcija bi bila elektrostatička i hidrofobna interakcija i van der Waalsova sila. Očigledno, ne postoji direktna interakcija između Pfu polimeraza i PEG, i Pfu polimeraza i pSB (Slike 8C i D). Ovi rezultati su u skladu sa Coul Short Range energetskom analizom. Rezultati simulacije molekularne dinamike i molekularnog spajanja su razumni jer PEG može smanjiti adsorpciju proteina, 49 i cviterionski polimer ima bolju sposobnost smanjenja adsorpcije proteina od PEG-a. 50 Afiniteti vezivanja polimera sa Pfu polimeraza (Tabela S8) takođe podržava rezultat.

Slika 8 MD simulacije interakcije Pfu polimeraza sa PAA (A), PAM (B), PEG (C) i pSB (D).
Skraćenice: MD, molekularna dinamika PAA, poliakrilna kiselina PAM, poliakrilamid PEG, polietilen glikol pSB, poli(sulfobetain).

Osim interakcije između Pfu polimeraza i polimer, negativno nabijeni GO i pozitivno nabijeni Pfu polimeraza također ima jake elektrostatičke, hidrofobne i π–π interakcije slaganja. PEG i pSB će smanjiti ove interakcije zbog smanjenja adsorpcije Pfu polimeraza. Dakle, GO-PEG i GO-pSB ne inhibiraju PCR u širem rasponu koncentracija od GO-PAA i GO-PAM, što je u skladu s eksperimentalnim rezultatima (Slika 4). Mala količina pozitivno nabijenog Pfu polimeraza se i dalje adsorbuje negativno nabijenim GO u GO-PEG i GO-pSB, iako će PEG i pSB smanjiti njegovu adsorpciju. Stoga je specifičnost PCR-a također poboljšana PCR-om uz pomoć GO derivata. Stoga, ovi rezultati dodatno potvrđuju da ovi GO derivati ​​mogu poboljšati specifičnost PCR-a.

Istraživali smo učinak GO s različitim veličinama, stupnjevima redukcije i površinskim modifikacijama na specifičnost PCR-a. Rezultati pokazuju da su L-GO i RGO superiorniji od S-GO i ne-RGO u poboljšanju specifičnosti PCR-a. Za GO derivate, sposobnost da se poboljša specifičnost PCR-a povećava se sljedećim redoslijedom: GO-PAA < GO-PAM < GO-PEG < GO-pSB. Naša studija pokazuje da i GO i njegova površinska svojstva utiču na specifičnost PCR-a. GO derivati ​​se mogu koristiti kao efikasni aditivi za poboljšanje specifičnosti PCR-a u kliničkoj molekularnoj dijagnozi.

Ova studija je podržana od strane Nacionalnog projekta osnovnih istraživanja 973 (2014CB932004) i Nacionalne fondacije za prirodne nauke Narodne Republike Kine (31371005, 81571764 i 81171453). Zahvaljujemo profesoru Zhiliang Jiu iz Državne ključne laboratorije za biologiju ćelijskog stresa, Fakulteta prirodnih nauka Univerziteta Xiamen, na njegovom prijedlogu u simulaciji. Zahvaljujemo doktoru Yoavu Pelegu sa Weizmann instituta za nauku, Izrael, na njegovom ljubaznom savjetu i reviziji jezika. Također zahvaljujemo profesoru Chuanliu Wuu i njegovom doktorantu Yaqi Chenu na njihovoj ljubaznoj pomoći oko svih ITC mjerenja.

Svi autori su doprinijeli analizi podataka, izradi i kritičkom revidiranju rada i saglasni su da budu odgovorni za sve aspekte rada.

Autori navode da nema sukoba interesa u ovom radu.

Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzimska amplifikacija genomskih sekvenci b-globina i analiza restrikcijskih mjesta za dijagnozu anemije srpastih stanica. Nauka. 1985230(4732):1350�.

Markus R, Robert Q, Hans-Jörg W, Hans L, Marie-Laure Y, Sylvia K. Efikasna i ekonomična mješavina pojačivača za PCR. Biochem Biophys Res Commun. 2006347(3):747�.

Zhang L, Cui XF, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. Amplifikacija cijelog genoma iz jedne ćelije: implikacije za genetsku analizu. Proc Natl Acad Sci U S A. 199289(13):5847�.

Michael RG, Joseph S. Poglavlje 7: lančana reakcija polimeraze. Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik. Četvrto izdanje. Michael RG, Joseph S, urednici New York, NY: Cold Spring Harbor 2012:455�.

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Enzimska amplifikacija DNK usmjerena na prajmer. Nauka. 1988239(4839):487�.

Chakrabarti R, Schutt CE. Poboljšanje PCR amplifikacije sulfonima male molekularne težine. Gene. 2001274(1𔃀):293�.

Ely J, Reeves-Daniel A, Campbell M, Campbell ML, Kohler S, Stone WH. Utjecaj koncentracije magnezijevih jona i uvjeta PCR amplifikacije na PCR među vrstama. Biotehnike. 199825(1):38󈞖.

Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorret D, Loening SA. Betain poboljšava PCR amplifikaciju GC-bogatih DNK sekvenci. Nukleinske kiseline Res. 199725(19):3957�.

Li H, Huang J, Lv J, et al. PCR nanočestica: PCR uz pomoć nanoglata sa poboljšanom specifičnošću. Angew Chem Int Ed Engl. 200544(32):5100�.

Khaliq A, Sonawane PJ, Sasi BK, et al. Povećanje efikasnosti lančane reakcije polimeraze pomoću TiO2 nanočestice: ključna uloga poboljšane toplotne provodljivosti. Nanotehnologija. 201021(25):255704.

Nie L, Gao L, Yan X, Wang T. Funkcionalizirane tetrapodne ZnO nanostrukture za pročišćavanje plazmidne DNK, lančanu reakciju polimeraze i isporuku. Nanotehnologija. 200618(1):015101.

Zhang ZZ, Wang MC, An HJ. Vodena suspenzija ugljičnog nanopraha poboljšava efikasnost lančane reakcije polimeraze. Nanotehnologija. 200718(35):355706.

Abdul KR, Kafafy R, Hamzah MS, Waleed FF. Povećanje efikasnosti lančane reakcije polimeraze upotrebom grafenskih nanopahuljica. Nanotehnologija. 201223(45):455106.

Wang L, Zhu Y, Jiang Y, et al. Efekti kvantnih tačaka u lančanoj reakciji polimeraze. J Phys Chem B. 2009113(21):7637�.

Chen J, Cao X, Guo R, et al. Visoko efikasan pojačivač lančane reakcije polimeraze zasnovan na zlatnim nanočesticama zarobljenim u dendrimerima. Analyst. 2012137(1):223�.

Wang H, Wang L, Yuan L, Yang W, Brash JL, Chen H. Inhibicijski efekat silicijumskih nanožica na lančanu reakciju polimeraze. Nanotehnologija. 201223(36):365101.

Yang W, Shen C, Ji Q, et al. Nanočestice srebra materijala za skladištenje hrane ometaju vjernost replikacije DNK i vezuju se za DNK. Nanotehnologija. 200920(8):085102.

Ding K, Wang N, Yan Q, Guan W. Efekat nanomaterijala na lančanu reakciju polimeraze. Curr Nanosci. 20139(3):415�.

Jia J, Sun LP, Hu N, Huang GM, Weng J. Grafen poboljšava specifičnost lančane reakcije polimeraze. Mala. 20128(13):2011�.

Pan D, Mi L, Huang Q, Hu J, Fan C. Genetička analiza sa nano PCR. Integr Biol. 20124(10):1155�.

Ma L, He S, Huang J, Cao L, Yang F, Li L. Maksimiziranje specifičnosti i prinosa PCR-a pomoću same kvantne tačke, a ne svojstva površine kvantne tačke. Biochimie. 200991(8):969�.

Bai Y, Cui Y, Paoli GC, Shi C, Wang D, Shi X. Nanočestice utiču na PCR prvenstveno preko površinskih interakcija sa PCR komponentama: koristeći amino-modifikovane magnetne nanočestice obložene silicijumom kao glavni model. ACS Appl Mater interfejsi. 20157(24):13142�.

Cao X, Shen M, Zhang X, Hu J, Wang J, Shi X. Utjecaj površinskih funkcionalnih grupa nanočestica zlata zarobljenih dendrimerom na poboljšanje lančane reakcije polimeraze. Elektroforeza. 201233(16):2598�.

Cao X, Chen J, Wen S, Peng C, Shen M, Shi X. Utjecaj površinskog naboja polietileniminom modificiranih višezidnih ugljičnih nanocijevi na poboljšanje lančane reakcije polimeraze. Nanoscale. 20113:1741�.

Tong W, Cao X, Wen S, et al. Povećanje specifičnosti i efikasnosti lančane reakcije polimeraze upotrebom derivata na bazi polietilenimina i hibridnih nanokompozita. Int J Nanomedicine. 20127:1069�.

Kuila T, Bose S, Mishra AK, Khanraa P, Kimc NH, Lee JH. Hemijska funkcionalizacija grafena i njegove primjene. Prog Mater Sci. 201257(7):1061�.

Li C, Yang Y, Wu D, Li T, Yin Y, Li G. Poboljšanje enzimskog imunosorbentnog testa za višebojnu detekciju biomarkera. Chem Sci. 20167:3011�.

Huang Y, Li H, Fan Q, Wang L, Wang Y, Li G. Multifunkcionalna ultraosjetljiva detekcija transglutaminaze ljudskog tkiva na bazi nanokatalizatora 2. Biosens Bioelectron. 201683(15):85󈟆.

Gao T, Yang D, Ning L, Lei L, Ye Z, Li G. Ultrafini i dobro dispergovani nanokristali srebra na 2D nanolistovima: sinteza i primjena kao multifunkcionalni materijal za elektrohemijsku katalizu i biosenzivanje. Nanoscale. 20146(24):14828�.

Gao T, Liu F, Yang D, Yu Y, Wang Z, Li G. Sastavljanje selektivne biomimetičke površine na površini elektrode: dizajn nano–bio interfejsa za biosenzivanje. Anal Chem. 201587(11):5683�.

Chen H, Ruckenstein E. Nanomembrana koja sadrži nanopore u otopini elektrolita: pristup molekularne dinamike. J Phys Chem Lett. 20145(17):2979�.

Yang Q, Wang Z, Weng J. Samosastavljanje prirodnog tripeptidnog glutationa izazvanog grafen oksidom. Soft Matter. 20128:9855�.

Dong J, Weng J, Dai L, Dong J, Weng J, Dai L. Utjecaj grafena na donju kritičnu temperaturu otopine poli(N-izopropilakrilamid). Carbon N Y. 201352:326�.

Khan U, O’Neill A, Porwal H, Peter M, Nawaz K, Coleman JN. Odabir veličine dispergiranih, eksfolijiranih grafenskih pahuljica kontroliranim centrifugiranjem. Carbon N Y. 201250(2):470�.

Dong J, Ding J, Weng J, Dai L. Grafen poboljšava memoriju oblika poli (akrilamid-koakrilne kiseline) cijepljene na grafen. Macromol Rapid Commun. 201334(8):659�.

Liu Z, Robinson JT, Sun X, Dai H. PEGilirani nanografen oksid za isporuku u vodi netopivih lijekova protiv raka. J Am Chem Soc. 2008130(33):10876�.

Boehm HP, Diehl E, Heck W, Sappok R. Površinski oksidi ugljika. Angew Chem Int Ed Engl. 19643(10):669�.

Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen HJC. GROMACS: brz, fleksibilan i besplatan. J Comput Chem. 200526(16):1701�.

Huang J, MacKerell AD. CHARMM36 all-atom aditivno proteinsko polje sile: validacija zasnovana na poređenju sa NMR podacima. J Comput Chem. 201334(25):2135�.

Vilar S, Cozza G, Moro S. Medicinska hemija i molekularno radno okruženje (MOE): primjena QSAR-a i molekularnog spajanja na otkrivanje lijekova. Curr Top Med Chem. 20088(18):1555�.

Trott O, Olson AJ. AutoDock Vina: poboljšanje brzine i tačnosti spajanja uz novu funkciju bodovanja, efikasnu optimizaciju i multithreading. J Comput Chem. 201031(2):455�.

Lu C, Yang H, Zhu C, Chen X, Chen G. Grafenska platforma za otkrivanje biomolekula. Angew Chem. 2009121(26):4879�.

Pan J, Li H, Cao X, et al. Višestruka lančana reakcija polimeraze (PCR) uz pomoć nanoglata. J Nanosci Nanotechnol. 20077(12):4428�.

Guan G, Zhang S, Liu S, et al. Protein indukuje sloj po sloj ljuštenje dihalkogenida prelaznih metala. J Am Chem Soc. 2015137(19):6152�.

Zhang Y, Zhang J, Huang X, Zhou X, Wu H, Guo S. Sastavljanje konjugata grafen oksida i enzima kroz hidrofobnu interakciju. Mala. 20128(1):154�.

Chervenak MC, Toone EJ. Kalorimetrijska analiza vezivanja lektina sa specifičnostima liganda koji se preklapaju za vezivanje ugljenih hidrata. Biohemija. 199534(16):5685�.

Cooper A. Efekti toplotnog kapaciteta u savijanju proteina i vezivanju liganda: ponovna procena uloge vode u biomolekularnoj termodinamici. Biophys Chem. 2005115(2𔃁):89󈟍.

Kim S, Kim D, Kim J, Kangd L, Cho H. Kristalna struktura Pfu, DNK polimeraza visoke vjernosti iz Pyrococcus furiosus. Int J Biol Macromol. 200842(4):356�.

Gooth NW, Hlady V. Dva površinska gradijenta polietilen glikola za smanjenje adsorpcije proteina. Surf Innov. 20153(3):172�.

Keefe AJ, Jiang SY. Poli(zwitterionic)proteinski konjugati nude povećanu stabilnost bez žrtvovanja afiniteta vezivanja ili bioaktivnosti. Nat Chem. 20124(1):59󈞫.

/>Ovo djelo je objavljeno i licencirano od strane Dove Medical Press Limited. Puni uslovi ove licence dostupni su na https://www.dovepress.com/terms.php i uključuju Creative Commons Attribution - Nekomercijalna (neprenesena, v3.0) licenca. Pristupanjem radu prihvatate Uslove. Nekomercijalna upotreba djela je dozvoljena bez ikakve dalje dozvole Dove Medical Press Limited, pod uslovom da je djelo pravilno pripisano. Za dozvolu za komercijalnu upotrebu ovog djela, pogledajte paragrafe 4.2 i 5 naših Uslova.

&kopija Copyright 2021 &bik Dove Press Ltd &bull razvoj softvera od strane maffey.com &bull Web dizajn od strane Adhesion

Mišljenja izražena u svim ovdje objavljenim člancima su mišljenja određenih autora i ne odražavaju nužno stavove Dove Medical Press Ltd ili bilo kojeg od njegovih zaposlenika.

Dove Medical Press je dio Taylor & Francis Group, odjela za akademsko izdavaštvo kompanije Informa PLC
Autorsko pravo 2017 Informa PLC. Sva prava zadržana. Ovaj sajt je u vlasništvu i kojim upravlja Informa PLC („Informa“) čija je registrovana kancelarija 5 Howick Place, London SW1P 1WG. Registrovan u Engleskoj i Velsu. Broj 3099067. UK PDV Grupa: GB 365 4626 36

Kako bismo posjetiteljima naše web stranice i registriranim korisnicima pružili uslugu prilagođenu njihovim individualnim preferencijama, koristimo kolačiće za analizu prometa posjetitelja i personaliziranje sadržaja. O našoj upotrebi kolačića možete saznati čitajući našu Politiku privatnosti. Također zadržavamo podatke u vezi s našim posjetiteljima i registriranim korisnicima za interne svrhe i za dijeljenje informacija sa našim poslovnim partnerima. Možete saznati koje vaše podatke čuvamo, kako se obrađuju, s kim se dijele i vaše pravo na brisanje vaših podataka čitajući našu Politiku privatnosti.

Ako se slažete s našom upotrebom kolačića i sadržajem naše politike privatnosti kliknite na 'prihvati'.


Sadržaj

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je tehnika molekularne biologije koja se koristi za amplifikaciju specifičnih segmenata DNK za nekoliko redova veličine. Specifični segmenti DNK se umnožavaju kroz tri procesa, denaturacije, žarenja i ekstenzije – gdje se lanci DNK odvajaju podizanjem temperature na optimalnu sa sobne temperature prije nego što se prajmeri vežu i polimeraza poravna nukleotide za lanac šablona. Koristi DNK polimerazu, koja je malo aktivna na niskim temperaturama. [1] U konvencionalnom PCR-u, reakciona mješavina je završena na sobnoj temperaturi, a zbog aktivnosti DNK polimeraze, prajmeri mogu formirati dimere prajmera ili se nespecifično zagrijati na DNK. Tokom PCR procedure, DNK polimeraza će proširiti bilo koji dio DNK vezanim prajmerima, stvarajući ciljne proizvode, ali i nespecifične proizvode koji smanjuju prinos. U PCR-u s vrućim startom, neki od reagensa se drže odvojeno dok se smjesa ne zagrije do određene temperature žarenja. Ovo smanjuje vrijeme žarenja, što zauzvrat smanjuje vjerovatnoću ekstenzije nespecifične DNK i utjecaj nespecifičnog vezivanja prajmera prije denaturacije. [6] [5]

U konvencionalnom PCR-u, niže temperature ispod optimalne temperature žarenja (50-65 °C) rezultiraju modifikacijama izvan cilja, kao što su nespecifične amplifikacije gdje će se prajmeri nespecifično vezati za nukleinsku kiselinu. [5] Ovi nespecifični kompleksi prajmera, koji su u višku u smeši, uzrok su sinteze nusproizvoda kao što su dimer prajmera i pogrešno prajming. [10] Pogrešno postavljanje uvelike ometa i smanjuje efikasnost PCR amplifikacije kroz aktivno nadmetanje sa ciljnim sekvencama za amplifikaciju. Slično, dimeri prajmera formiraju komplekse što smanjuje količinu dobijenih amplifikacija broja kopija. [10] Ovo se može kontrolisati implementacijom hot start PCR-a koji omogućava da se produžeci prajmera blokiraju dok se ne postignu optimalne temperature. [2]

U PCR-u s vrućim startom, važni reagensi (kao što su DNK polimeraza i magnezijum kofaktori) su spriječeni da reaguju u PCR mješavini sve dok se optimalne temperature ne postignu kroz fizičko odvajanje ili kemijske modifikacije. [5] [2] Hot start PCR može se desiti i kada je Taq polimeraza inhibirana/inaktivirana ili se njeno dodavanje odgodi do optimalnih temperatura žarenja, kroz modifikacije deoksiribonukleotid trifosfata ili modifikacijom prajmera kroz kavez i manipulaciju sekundarnom strukturom.

Hot start PCR je često bolji pristup za razliku od tradicionalnog PCR-a u okolnostima kada nedostaje DNK u reakcijskoj mješavini (>10 4 kopije), DNK šablon je vrlo složen ili ako postoji nekoliko parova oligonukleotidnih prajmera u PCR-u. [3]

PCR s vrućim startom je metoda koja sprječava ekstenzija DNK polimeraze na nižim temperaturama kako bi se spriječilo nespecifično vezivanje kako bi se smanjio gubitak prinosa. Hot start PCR smanjuje količinu nespecifičnog vezivanja putem ograničavajućih reagensa sve do koraka zagrijavanja PCR-a – ograničite reakciju rano ograničavanjem Taq DNA polimeraze u reakciji. Nespecifično vezivanje često dovodi do dimera prajmera i pogrešno prajmiranih/lažno pripremljenih ciljeva. [11] Oni se mogu ispraviti modificiranim metodama kao što su:

Inaktivacija/inhibicija Taq DNK polimeraze Edit

Enzimska antitijela/Taq DNK polimeraza u kompleksu s antitijelima protiv Taq DNK polimeraze:

Enzimska antitijela inaktiviraju Taq DNK polimerazu. Antitijela se povezuju i vezuju za polimerazu, sprječavajući ranu amplifikaciju DNK koja bi se mogla dogoditi na nižim temperaturama. Kada se postigne optimalna temperatura žarenja, antitijela će početi da se razgrađuju i disociraju, oslobađajući Taq DNK polimerazu u reakciju i omogućavajući da započne proces amplifikacije. [2] [12] Platinum Taq DNK polimeraza i AccuStart Taq DNK polimeraza (obe razvijene od strane Ayoub Rashtchian u Life tehnologijama i Quanta BioSciences, respektivno) su primjeri komercijalno dostupnih Taq DNK polimeraza s vrućim startom baziranih na antitijelima. Ove Taq DNK polimeraze su prethodno složene sa mješavinom monoklonskih antitijela specifičnih za Taq DNK polimerazu. [13]

Fizička barijera je stvorena između Taq DNK polimeraze i ostatka PCR komponenti pomoću perlica voska koje zavise od temperature. Kada temperatura poraste preko 70 °C, tokom koraka denaturacije u prvom ciklusu, zrno voska se topi, omogućavajući Taq DNK polimerazi da pobjegne preko barijere i pusti se u reakciju – započinjući proces amplifikacije. Sloj voska se zatim pomiče na vrh reakcione smjese tokom faze amplifikacije da bi kasnije djelovao kao parna barijera. [2]

Visoko specifični oligonukleotidi:

Oligonukleotidi su kratki polimeri nukleinske kiseline koji se lako vežu. Visoko specifični oligonukleotidi, kao što su aptameri, vezuju se za Taq DNK polimerazu na nižim temperaturama čineći je neaktivnom u smjesi. Samo na višim temperaturama oligonukleotidi će se odvojiti od Taq-a, omogućavajući mu da reaguje. [5]

Ovo su najefikasnije metode za hot start PCR, metode enzimski vezanih antitijela i visoko specifičnih oligonukleotida posebno su najprikladnije tokom procedura koje zahtijevaju kraće vrijeme inaktivacije. [14] Međutim, poznato je da se primjenjuju i druge metode kao što su:

Kasno dodavanje Taq DNK polimeraze Edit

PCR mašina se zagreva unapred dok se komponente mešaju preko leda i zatim se odmah stavlja u PCR mašinu kada dostigne optimalnu temperaturu. Ovo bi eliminisalo potreban proces zagrijavanja, smanjilo nespecifično žarenje prajmera i osiguralo da se svi promašeni prajmeri u smjesi odvoje. [15]

Zamrzavanje djeluje kao oblik fizičkog odvajanja slično kao i perle od voska. Reakciona smjesa koja sadrži prajmere, šablonski lanac, vodu i deoksiribonukleotid trifosfat (dNTP) se zamrzava prije Taq polimeraze i preostale PCR komponente se dodaju na vrh smrznute smjese. Ovo djeluje na sprječavanje nespecifičnog vezivanja. [15]

Komponente PCR-a u reakcionoj mješavini se pripremaju i zagrijavaju bez dodavanja Taq-a. Taq se tek kasnije unosi u smjesu kada se postigne optimalna temperatura. Međutim, ova metoda je najmanje pouzdana i može dovesti do kontaminacije komponenti. [15]

Druga metoda je putem deoksiribonukleotid trifosfata posredovanog vrućim start PCR-om koji modificira nukleotidne baze kroz zaštitnu grupu.

Modifikacije deoksiribonukleotid trifosfata (dNTP) Uredi

Hot start dNTP se može hemijski modifikovati da uključi zaštitnu grupu osetljivu na toplotu na glavnom kraju 3. Ova modifikacija će spriječiti da nukleotidi stupe u interakciju s Taq polimerazom kako bi se vezali za šablonski lanac sve dok se ne postignu optimalne temperature, pa će zaštitna grupa biti uklonjena tokom koraka aktivacije topline. Hot start dNTP, dA, dT, dC i dG zamjenjuju prirodne nukleotide. [16] [17] Preporuča se korištenje sva četiri modificirana nukleotida, međutim, prethodna istraživanja pokazuju da bi zamjena jednog ili dva prirodna nukleotida sa modificiranim dNTP-ima bila dovoljna da se osigura da ne dođe do nespecifične amplifikacije. [16] [17] Još jedna hemijska modifikacija nukleinske kiseline je kroz toplotno reverzibilnu kovalentnu modifikaciju koja deluje tako da ometa hibridizaciju prajmera sa šablonom od interesa. Gvanozin amino grupa stupa u interakciju sa glioksalom da bi formirala dG. [18]

Modifikovani primeri Edit

Određena sekundarna struktura može ometati funkcije prajmera. Na primjer, oligonukleotidi sa strukturom ukosnice ne mogu djelovati efikasno kao prajmer. Međutim, nakon zagrijavanja reakcione mješavine na temperaturu žarenja, prajmer će doživjeti promjenu konformacije, omogućavajući prajmeru da umjesto toga formira linearnu strukturu, što omogućava prajmeru da se pričvrsti na ciljni segment i započne PCR. [19] [20]

Fotohemijski uklonjivi kavezi:

Kavezna grupa koja je zaštitna grupa koja se fotohemijski može ukloniti, kao što su timidin fosforamiditi u kavezu, ugrađena je u oligonukleotidni prajmer. Ovo omogućava da se funkcija prajmera aktivira i deaktivira upotrebom UV zračenja (365 nm). Stoga se prajmeri mogu aktivirati nakon što se postigne temperatura žarenja. [21]

Kontrolisano dodavanje magnezijuma Edit

Magnezijum je neophodan u PCR-u i deluje kao kofaktor jer Taq polimeraza zavisi od magnezijuma. [22] Povećanje koncentracije magnezijuma i fosfata u standardnim puferskim reagensima stvara precipitat magnezijuma, pružajući vrući početak za reakciju jer nema magnezijuma za DNK polimerazu sve do faze termičkog ciklusa. Tokom termičkog ciklusa, magnezijum će se ponovo rastvoriti u rastvor i postati dostupan za upotrebu polimeraze omogućavajući joj da normalno funkcioniše. [23]

Hot start PCR je povoljan jer zahtijeva manje rukovanja i smanjuje rizik od kontaminacije. Hot start PCR može biti hemijski modifikovan ili baziran na antitelima što pruža različite prednosti proceduri. U kemijski modificiranom PCR-u s vrućim startom, postupak se može provoditi na sobnoj temperaturi i značajno smanjuje formiranje prajmera-dimera sprečavanjem da se prajmeri vežu jedan za drugi prije nego što PCR proces započne, kao i ograničavanjem nespecifičnog prajminga. Slično, vrući start PCR inhibira vezivanje prajmera za šablonske sekvence koje imaju nisku homologiju što dovodi do pogrešnog prajminga. Takođe može poboljšati specifičnost i osjetljivost, zbog strogih uvjeta, kao i povećati prinos ciljanog fragmenta. [5] U PCR-u s vrućim startom baziranim na antitijelima, polimeraza se aktivira nakon početnog koraka denaturacije tokom ciklusnog procesa, čime se smanjuje potrebno vrijeme. To također dovodi do visoke specifičnosti. [14]

Uz svoje prednosti, hot start PCR ima i ograničenja koja se moraju uzeti u obzir prije implementacije metode. Hot start PCR zahtijeva dodavanje topline tokom dužeg vremenskog perioda za razliku od konvencionalnog PCR-a, stoga je DNK šablona podložnija oštećenju. Povećano vrijeme zagrijavanja također znači da procedura nije kompatibilna za određene procedure kao što je metoda reverzne transkripcije u jednoj epruveti, s jednim puferom-PCR koja zahtijeva nižu temperaturu da bi se podvrgla koraku reverzne transkripcije. [12] U kemijski modificiranom PCR-u s vrućim startom, na proces amplifikacije DNK može se negativno utjecati, prvo zbog značajnog povećanja vremena reaktivacije potrebnog da se polimeraza aktivira, a drugo ako je dužina ciljnog DNK šablona preduga. [14] U procedurama baziranim na antitijelima, svaki enzim zahtijeva različito antitijelo i stoga je cijena izvođenja postupka veća [15]


Tabela odabira DNK polimeraze

Sljedeća tabela navodi svojstva koja treba uzeti u obzir pri odabiru polimeraze. Pošto ova svojstva mogu zavisiti od uslova reakcije, primarne reference treba konsultovati pre upotrebe u datoj primeni.

PCR polimeraze 3&prime&ndash>5&prime egzonukleaza Vjernost 5&prime&ndash>3&prime egzonukleaza Strand Displacement Nick Translation Extend RNA Primer Produžetak od Nicka dU Tolerancija Resulting Ends Dostupni popularni formati Aplikacije
High Fidelity PCR
Q5 ® DNK polimeraza visoke vjernosti ++++ 280x Taq br _ br br br br Blunt Q5 ® DNK polimeraza visoke vjernosti PCR ultra visoke vjernosti, PCR dugog dometa, kloniranje iz in vitro materijala za ekspresiju proteina ili analizu gena, SNP analiza putem kloniranja i sekvenciranja, mutageneza usmjerena na mjesto
Q5 ® Hot Start High-Fidelity DNK polimeraza
Q5 ® DNK polimeraza visoke vjernosti 2x Master Mix
Q5 ® High-Fidelity Hot Start DNK polimeraza 2x Master Mix
NEBNext ® Ultra&trade II Q5 ® Master Mix NGS biblioteka priprema
Q5U ® Hot Start DNK polimeraza visoke vjernosti ++++ br _ br br br Da Blunt Q5U ® Hot Start DNK polimeraza visoke vjernosti Kloniranje KORISNIKA, amplifikacija visoke vjernosti bisulfitno pretvorenih ili deaminiranih DNK supstrata, sprječavanje prenošenja
NEBNext Q5U ® Master Mix
Phusion ® DNK polimeraza visoke vjernosti* ++++ 39 b -50x c Taq br _ br br br br Blunt Phusion ® DNK polimeraza visoke vjernosti PCR visoke vjernosti, kloniranje
Phusion ® High Fidelity PCR Master Mix sa HF puferom
Phusion ® High Fidelity PCR Master Mix sa GC puferom
Phusion ® Hot Start Flex DNK polimeraza
Phusion ® Hot Start Flex 2X Master Mix
Rutinski PCR
JedanTaq ® DNK polimeraza ++ 2x Da _ j Da br Da Da 3'A/Blunt JedanTaq ® DNK polimeraza Rutinski PCR, PCR kolonija, skrining genotipa
JedanTaq ® Hot Start DNK polimeraza
JedanTaq ® i jedanTaq ® Hot Start 2x Master Mixes
JedanTaq ® DNK polimeraza brzog učitavanja
JedanTaq ® Quick-Load ® 2X Master Mix
Taq DNK polimeraza _ 1x Da _ j Da br Da Da 3'A TaqDNK polimeraza sa Thermopol puferom Rutinski PCR
Hot Start TaqDNK polimeraza
Taq i Hot Start Taq 2X Master Mix
Quick-Load Taq 2X Master Mix
Multiplex PCR 5X Master Mix Multiplex end point PCR
Specijalnost PCR
LongAmp ® Taq DNK polimeraza ++ 2x Da _i Da br Da Da 3'A/Blunt LongAmp ® Taq DNK polimeraza PCR dugog dometa za složene i jednostavne šablone
LongAmp ® Hot Start Taq DNK polimeraza
LongAmp ® Taq 2X Master Mix
LongAmp ® Hot Start Taq 2X Master Mix
Hemo KlenTaq _ br _ br br br Da 3'A Hemo KlenTaq Direktni PCR u krvi
Epimark ® Hot Start Taq DNK polimeraza _ Da _ j Da br Da Da 3'A Epimark ® Hot Start Taq DNK polimeraza Bisulfitno konvertovana DNK amplifikacija, šabloni bogati AT
Izotermno pojačanje i pomicanje niti 3&prime&ndash>5&prime egzonukleaza Stopa greške (x 10 -6 )
5&prime&ndash>3&prime egzonukleaza Strand Displacement Nick Translation Extend RNA Primer Produžetak od Nicka dU Tolerancija Resulting Ends Dostupni popularni formati Aplikacije
Bst DNK polimeraza, puna dužina _ Da _ j
Da Da Da Da 3'A Bst DNK polimeraza, puna dužina Nick prevod
Bst DNK polimeraza, veliki fragment _ br ++++ br Da Da Da 3'A Bst DNK polimeraza, veliki fragment Izotermna amplifikacija (LAMP, SDA) molekularna dijagnostika, terenska dijagnostika
Bst 2.0 DNK polimeraza _ 62 (±5) e br ++++ br Da Da Da 3'A Bst 2.0 DNK polimeraza
Bst 2.0 WarmStart ® DNK polimeraza
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix sa UDG
WarmStart ® LAMP komplet (DNK i RNA)
WarmStart ® Colorimetric LAMP 2X Master Mix (DNK & RNA)
Bst 3.0 DNK polimeraza _ 70 (±23) e br ++++ br Da Da Da 3'A Bst 3.0 DNK polimeraza
Bsu DNK polimeraza, veliki fragment _ br + br Da Da Da 3'A Bsu DNK polimeraza, veliki fragment Izotermna amplifikacija (RPA, SDA, RCA)
phi29 DNK polimeraza ++++ 5 i br + br Da Da k Da Blunt phi29 DNK polimeraza WGA
Polimeraze za DNK manipulaciju 3&prime&ndash>5&prime egzonukleaza Stopa greške (x 10 -6 ) 5&prime&ndash>3&prime egzonukleaza Strand Displacement Nick Translation Extend RNA Primer Produžetak od Nicka dU Tolerancija Resulting Ends Dostupni popularni formati Aplikacije
T7 DNK polimeraza (nemodificirana) ++++ 15 h br _ br Da br Blunt T7 DNK polimeraza (nemodificirana)
Sulfolobus DNK polimeraza IV _ br _ br 3'A Sulfolobus DNK polimeraza IV Trans lezija bypass
Therminator&trade DNK polimeraza _ br + br Da Da Da 3'A Therminator&trade DNK polimeraza Terminator lanca
DNK polimeraza I (E. coli) ++ 9 f Da _ j Da Da Da Da Blunt DNK polimeraza I (E. coli) Sinteza drugog lanca, prevod nicka
DNK polimeraza I, veliki (Klenow) fragment' ++ 18 g br + br Da Da Da Blunt DNK polimeraza I, veliki (Klenow) fragment' Otupljivanje, produžetak prajmera
Klenow Fragment (3&prime&rarr5&prime exo_) _ 100 g br +++ br Da Da Da 3'A Klenow Fragment (3&prime&rarr5&prime exo_) Ispadanje, nasumično prajmersko označavanje
T4 DNK polimeraza ++++ <1 f br _ br Da br Blunt T4 DNK polimeraza Blunting
Naslijeđene polimeraze 3&prime&ndash>5&prime egzonukleaza Stopa greške (x 10 -6 ) 5&prime&ndash>3&prime egzonukleaza Strand Displacement Nick Translation Extend RNA Primer Produžetak od Nicka dU Tolerancija Resulting Ends Dostupni popularni formati Aplikacije
Ventiliraj ® DNK polimerazu ++ br + br br Da br Blunt Ventiliraj ® DNK polimerazu
Vent ® (exo&ndash) DNK polimeraza _ br +++ br br Da br 3'A Ventil ® (exo&ndash) DNK polimeraza
Deep Vent ® DNK polimeraza +++ br ++ br br Da br Blunt Deep Vent ® DNK polimeraza
Deep Vent ® (exo&ndash) DNK polimeraza _ br +++ br br Da br 3'A Deep Vent ® (exo&ndash) DNK polimeraza

Deep Vent ® i Therminator&trade su zaštitni znakovi New England Biolabs, Inc.
Q5 ® , Q5U ® , LongAmp ® , OneTaq ® , Vent ® su registrovani zaštitni znaci kompanije New England Biolabs, Inc.

* Obavijest za kupce:
Phusion ® DNK polimerazu razvio je Finnzymes Oy, sada dio Thermo Fisher Scientific-a. Ovaj proizvod proizvodi New England Biolabs, Inc. prema dogovoru sa Thermo Fisher Scientificom i prema specifikacijama performansi.
Phusion ® je registrovani zaštitni znak i vlasništvo Thermo Fisher Scientific.


Priznanja

Ovaj rad je delimično podržan sredstvima Ministarstva nauke i tehnologije Kine (br. 2015CB553402 i br. 2016YFC0206300 do TFZ br. 2017YFA0505200 do LL), Nacionalne fondacije za prirodne nauke Kine (br. 314705915, br. 314705932, 104 i br. 31711530153 za TFZ br. 21532004 za LL), program Peking Nova (br. Z171100001117011 do TFZ), program naučnoistraživačke inicijative Univerziteta Tsinghua (br. 20161080152 za ​​Univerzitetski centar za život Univerziteta Tsinghua), Centar za život univerziteta Tsinghua (CLS) i Pekinški centar za napredne inovacije za strukturnu biologiju.


Lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije (RT-PCR)

U RT-PCR, populacija RNK se konvertuje u cDNK reverznom transkripcijom (RT), a zatim se cDNK amplificira lančanom reakcijom polimeraze (PCR) (Slika 1). Korak cDNK amplifikacije pruža mogućnosti za dalje proučavanje originalnih RNK ​​vrsta, čak i kada su one ograničene u količini ili izražene u malom obilju. Uobičajene primjene RT-PCR-a uključuju detekciju eksprimiranih gena, ispitivanje varijanti transkripta i stvaranje cDNK šablona za kloniranje i sekvenciranje.

Pošto reverzna transkripcija obezbeđuje cDNK šablone za PCR amplifikaciju i nizvodne eksperimente, to je jedan od najkritičnijih koraka za uspeh eksperimenta. Odabrana reverzna transkriptaza treba da ponudi najveću efikasnost čak i sa izazovnim uzorcima RNK, kao što su oni koji su degradirani, imaju inhibitore prenosa ili imaju visok stepen sekundarne strukture. (Bijeli papir:Projektovana reverzna transkriptaza)

U izvođenju RT-PCR, metode u jednom i dva koraka su dva uobičajena pristupa, svaki sa svojim prednostima i nedostacima (Slika 2). Kao što ime govori, RT-PCR u jednom koraku kombinuje sintezu prvog lanca cDNA (RT) i naknadnu PCR u jednoj reakcijskoj epruveti. Ova postavka reakcije pojednostavljuje radni tok, smanjuje varijacije i minimizira moguću kontaminaciju. RT-PCR u jednom koraku omogućava lakšu obradu velikog broja uzoraka, što ga čini pogodnim za aplikacije velike propusnosti. Međutim, RT-PCR u jednom koraku koristi gen-specifične prajmere za amplifikaciju, ograničavajući analizu na nekoliko gena po uzorku RNA. Budući da je reakcija kompromis između uslova reverzne transkripcije i amplifikacije, RT-PCR u jednom koraku može biti manje osjetljiv i manje efikasan u nekim scenarijima. Ipak, upotreba gen-specifičnog prajmera u RT-PCR-u može pomoći da se maksimizira prinos ciljne cDNK i minimizira pozadinsko pojačanje. (Bijeli papir:Poboljšani RT-PCR sistem u jednom koraku)

RT-PCR u dva koraka uključuje dvije odvojene reakcije, počevši od sinteze prvog lanca cDNK (RT), nakon čega slijedi amplifikacija dijela rezultirajuće cDNK pomoću PCR-a u posebnoj epruveti. Stoga je RT-PCR u dva koraka koristan za otkrivanje više gena u jednom uzorku RNK. Razdvajanje RT i PCR reakcija omogućava optimizaciju reakcionih uslova za svaki korak, kao i fleksibilnost sa prajmerom reverzne transkripcije (oligo(dT) prajmeri, nasumični heksameri ili gen-specifični prajmeri) i PCR podešavanjem (npr. izbor DNK polimeraze i PCR komponente). U poređenju sa RT-PCR u jednom koraku, nedostaci RT-PCR-a u dva koraka uključuju višestruke korake za produženi radni tok, dodatno rukovanje i obradu uzorka, te povećanje šanse za kontaminaciju i varijacije u rezultatima.

Tabela 1. Poređenje jednostepene i dvostepene RT-PCR

RT-PCR u jednom korakuRT-PCR u dva koraka
PostavitiKombinovana reakcija pod uslovima koji podržavaju i reverznu transkripciju i PCROdvojene optimizirane reakcije za reverznu transkripciju i PCR
Temeljni premaziGene-specifični prajmeriIzbor oligo(dT), nasumičnih heksamera ili gen-specifičnih prajmera
Idealna upotrebaAnaliza jednog ili dva gena visokopropusnih platformiAnaliza više gena
PrednostPogodan, visoke propusnostiFleksibilno

RT-PCR u 1 i 2 koraka

Saznajte više o razlikama između jednostepenog i dvostepenog RT-PCR-a i kako da odaberete između njih za svoje aplikacije.

Kako postići visoko specifične rezultate RT-PCR u jednom koraku

Saznajte više o mehanizmu RT-PCR u jednom koraku, njegovim izazovima i kako ih prevazići.

Nauči više

Srodni proizvodi


6.5: Lančana reakcija polimeraze (PCR) - Biologija

Za pregled ovog sadržaja potrebna je pretplata na J o VE. Moći ćete vidjeti samo prvih 20 sekundi.

JoVE video plejer je kompatibilan sa HTML5 i Adobe Flashom. Stariji preglednici koji ne podržavaju HTML5 i video kodek H.264 i dalje će koristiti video player zasnovan na Flash-u. Preporučujemo preuzimanje najnovije verzije Flasha ovdje, ali podržavamo sve verzije 10 i novije.

Ako to ne pomogne, obavijestite nas.

Cilj PCR-a, lančane reakcije polimeraze je da se pojača genetska sekvenca. U ovom primjeru, gen od interesa će biti amplificiran iz pročišćene DNK. Da bi se izvršila amplifikacija, potrebna je polimeraza za sintetizaciju nove DNK.

Potreban je i prajmer, kratki komad jednolančane DNK koji dijeli homologiju sa genom od interesa. Konačno, pojedinačni nukleotidi koji se nazivaju deoksinukleozid trifosfati ili dNTP se koriste za stvaranje novog lanca. Prvi korak u PCR-u je zagrijavanje smjese koja denaturira DNK.

Zatim se reakcija hladi i prajmeri će se žariti u svoj homologni region. Jednom vezana reakcija se zagrijava do optimalne temperature za polimerazu. Polimeraza tada prepoznaje kompleks DNK prajmera i započinje sintezu novog lanca koristeći dNTP u otopini.

Reakcija se zatim zagrijava i nastavlja kako je opisano u dodatnim ciklusima. Nakon trećeg ciklusa, postoji ukupno osam kopija gena. Nakon četvrtog ciklusa 16 primjeraka.

I peti ciklus, 32 primjerka. Broj ciklusa će nastaviti da raste eksponencijalno. Nakon 30 ciklusa, postoji nešto više od milijardu primjeraka.

15.14: PCR

Pregled

Lančana reakcija polimeraze, ili PCR, je široko korištena tehnika za kopiranje segmenata DNK. Zbog eksponencijalne amplifikacije, PCR može proizvesti milione ili milijarde kopija DNK u roku od samo nekoliko sati.U PCR reakciji, enzim DNK polimeraze otporan na toplinu umnožava originalnu DNK kroz niz temperaturnih promjena unutar automatizirane mašine zvane termocikler.

PCR je svestrana metoda koja je revolucionirala molekularnu biologiju

Kary Mullis je 1983. razvio PCR, za koji je 1993. dobio Nobelovu nagradu za hemiju. Budući da je relativno brz, jeftin i precizan način kopiranja sekvence DNK, PCR je postao neprocjenjiv alat za brojne primjene, uključujući molekularno kloniranje, gensku mutagenezu, detekciju patogena, analizu genske ekspresije, kvantitaciju i sekvenciranje DNK i dijagnozu genetskih bolesti.

Ciklus PCR reakcije

PCR oponaša prirodni proces replikacije DNK koji se događa u stanicama. Reakciona smjesa uključuje šablonsku DNK sekvencu koju treba kopirati, par kratkih molekula DNK zvanih prajmeri, slobodne građevne blokove DNK zvane deoksinukleotid trifosfati (dNTP) i specijalizirani enzim DNK polimeraze.

PCR uključuje niz koraka na visokim temperaturama, koji zahtijevaju enzim DNK polimeraze koji je funkcionalan na takvim temperaturama. Najčešće korištena DNK polimeraza je Taq polimeraza, nazvana po Thermus aquaticus, bakterija iz koje je polimeraza prvobitno izolirana. DNK polimeraza nije u stanju sintetizirati molekulu DNK ispočetka ili de novo. Umjesto toga, DNK polimeraza se dodaje kratkim molekulima DNK, zvanim prajmeri, koji se vezuju za DNK šablon kroz komplementarno uparivanje baza. Prajmeri daju slobodnu 3&rsquo hidroksilnu grupu na koju DNK polimeraza može pričvrstiti nove dNTP. Postoje četiri tipa dNTP-a u PCR-u, po jedan za svaki nukleotid u molekulu DNK: dATP, dCTP, dGTP i dTTP.

Svaki PCR ciklus sastoji se od tri koraka: denaturacije, žarenja i DNK sinteze.

  1. Denaturacija. PCR ciklus se pokreće zagrijavanjem reakcione smjese na visoku temperaturu, što uzrokuje razdvajanje dvostruke spirale DNK u dva lanca. Ovaj proces &ldquomolting&rdquo se obično odvija na temperaturi od 90°C­­&ndash100°C.
  2. Žarenje. Reakciona smeša se brzo hladi (obično na 50°C&ndash65°C), dozvoljavajući da se dva prajmera vežu za svoje komplementarne sekvence na lancima DNK šablona.
  3. Sinteza DNK (primer ekstenzija). Reakciona smeša se ponovo zagreva, ovaj put do temperature (obično 60°C&ndash75°C) koja omogućava DNK polimerazi da proširi prajmere dodavanjem dNTP-a koji se uparuju sa bazama u lancu šablona.

Tipičan PCR uključuje 20-40 ponovljenih ciklusa ova tri koraka, koji se odvijaju u termocikleru. Pošto se broj molekula DNK udvostručuje u svakom ciklusu, DNK se eksponencijalno pojačava.

Ograničenja PCR-a

Ako naučnik želi da pojača određeni deo genoma, naučnik mora da poznaje barem deo ciljne DNK sekvence da bi dizajnirao odgovarajuće prajmere. Drugi potencijalni problem je nespecifično žarenje prajmera na djelomično slične sekvence DNK, što dovodi do amplifikacije neciljne DNK. Ovaj problem se može kontrolisati optimizacijom reakcionih uslova. Budući da je vrlo osjetljiva metoda detekcije, PCR je također osjetljiv na kontaminaciju, pa čak i količine u tragovima kontaminirajuće DNK mogu uzrokovati pogrešne rezultate. DNK polimeraze koje se koriste u PCR-u mogu biti sklone greškama. Ako se mutacija dogodi u prvih nekoliko ciklusa, većina amplificirane DNK će nositi mutaciju.

Garibyan, Lilit i Nidhi Avashia. &ldquo Jednostavne istraživačke tehnike: lančana reakcija polimeraze (PCR).&rdquo Časopis za istraživačku dermatologiju 133, br. 3 (mart 2013): e6. [Izvor]

Pray, Leslie A. &ldquoBiotehnološka revolucija: PCR i upotreba reverzne transkriptaze za kloniranje eksprimiranih gena.&rdquo Obrazovanje o prirodi 1, br. 1 (2008): 94. [Izvor]