Informacije

Kako mogu prebrojati svoje kolonije E. coli?

Kako mogu prebrojati svoje kolonije E. coli?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Uradio sam test koji je uključivao uzgoj e. coli na Petrijevoj zdjelici. Nisam razrijedio uzorak, a to je rezultiralo rastom stotina malih kolonija koje se preklapaju. Međutim, još uvijek se mogu prebrojati, ali to je bio zamoran posao. Ima li neko trikove za prebrojavanje malih kolonija? Takođe sam čitao da će ljudi samo napisati> 300 ako im je broj kolonija prevelik. Da li su ovi podaci dovoljni? Moram uporediti broj kolonija za nekoliko petrijevih zdjela i sve imaju dosta. Ako samo napišem "> 300" za 80% svojih podataka, to neće biti baš dobro poređenje. Može li mi neko pomoći ovdje?


Podijelite ploču na jednake sektore. Brojite jedan sektor što tačnije možete, a zatim taj broj pomnožite sa brojem sektora. Ovo pretpostavlja da su kolonije približno jednako raspoređene.


Kolonije E. coli nisu odrasle u tekućoj kulturi. -POMOĆ- - (29. januar 2009.)

Imao sam problema s kloniranjem više od 9 mjeseci - moj projekt nije napredovao zbog ovih problema s kloniranjem. Međutim, mogao sam pronaći kolonije u koje su umetnute gen od interesa (provjerio sam ih PCR-om kolonija) nakon transformacije, one nisu rasle u tečnoj kulturi. Koristio sam nekoliko vrsta kompetentnih ćelija, vektora, medija i promijenio uvjete kulture, ali nisu uspjeli. Sada pokušavam uzgajati kolonije u LB medijima (kompetentni stanični soj je DH5a). Veličina umetka je oko 600bp, a vektor je 5000bp. To do sada nije uspjelo. Skoro sam lud .
Veoma sam vam zahvalan ako biste mi mogli dati neke savjete!!!

Kao provjeru, da li ste koristili prajmere koji su se pojačavali preko spoja između vašeg 600bp inserta i 5kb vektora? PCR kolonije je dovoljno osjetljiv da pojača zaostalu DNK iz ligacije koja sjedi na vašoj LB ploči. Dakle, ako ste koristili prajmere koji su pojačali samo umetak, lako možete dobiti lažno pozitivan signal iz zaostale DNK koja sjedi na ploči.

Ako to nije problem, valja napomenuti da DH10a raste sporo. Dakle, obično je potrebno malo duže nego inače da kultura dostigne zasićenje. Pokušajte duže.

Međutim, s obzirom na vašu priču, zabrinut sam. Pokušajte uzgajati svoju koloniju na LB ploči kako biste bili sigurni da je zaista otporna na antibiotike. Je li vaš gen kojim slučajem izražen? I ako jeste, da li je genski proizvod toksičan za e coli?

Hvala vam puno na vašim komentarima! Koristio sam prajmere koji su pojačali insert i pojačali cijeli MCS u vektoru. Koristio sam ove prajmere kao dvostruku provjeru.
Naseljao sam kolonije koje sam dobio nakon transformacije na drugu LB ploču, ona je narasla.
Takođe sam pokušao inkubirati više od 2 dana u tekućoj kulturi, ali nije uspjelo.

rintaron dana 29. januara 2009., 01ᛎ PM je rekao:

Naseljao sam kolonije koje sam dobio nakon transformacije na drugu LB ploču, ona je narasla.
Također sam pokušao inkubirati više od 2 dana u tečnoj kulturi, ali nije uspjelo.

u vezi s medijima koje ste koristili: Jesu li ploče i tekući mediji iz iste LB serije? Je li moguće da postoji neka kontaminacija u tekućim medijima koja ometa rast. Možda biste to mogli testirati tako da napravite "normalnu" kulturu preko noći sa E.coli (bez ikakvih plazmida). Ako E.coli ne raste onda nešto nije u redu s medijima.

Hvala vam puno na savjetu. Ali isti mediji rade i za druga kloniranja. Pretpostavljam da je teško razmišljati o problemu u ovim medijima. Koristio sam nekoliko vrsta medija i kultivirao normalno vrijeme, ali nije uspjelo.

ovo bi moglo uvrijediti vašu inteligenciju, ali provjerite da li plazmid koji koristite daje odgovarajuću otpornost na antibiotike. drugim riječima, uvjerite se da ne stavljate bakterije otporne na tet u ampicilinske podloge. također, ako vaše kolonije rastu na pločama samo za LB (bez antibiotika), pokušajte uzgajati te ćelije u podlozi samo za LB, na taj način eliminirate mogućnost da u vašem inkubatoru postoje neki zagađivači koji sprječavaju rast.

sve u svemu, čini se da vam nedostaje pozitivna kontrola, izvršite transformaciju sa plazmidom za koji znate da će rasti i napravite tečni medij rame uz rame s njim. To će uvelike pomoći u utvrđivanju gdje je problem.

još jedna potencijalna uvreda. jeste li već pravili tečne kulture?

u slučaju da niste, pokušavate li iz jedne kolonije uzgojiti veliku količinu?

ne biste trebali cijepiti više od 10 ml s jednom kolonijom. uzgojite to i tada cijepite veći volumen.

Hvala vam puno na komentarima, sada mi trebaju bilo kakvi savjeti, hvala na pažnji.
Imam iskustva u uzgoju velikog obima iz jedne kolonije. Proverio sam pravu otpornost na antibiotike. ali nisam provjeravao bakterije otporne na tet. Jednom sam pokušao odrasti bez antibiotika, ali oni nisu odrasli kao obično.

Jeste li probali samo prazan vektor i vidite raste li? Možda ste ovo rekli na forumu, ali samo želim biti siguran da znate da je plazmid zaista PRAZAN vektor.

Ako rast s praznim vektorom, ali nema rasta s novim konstruktom

onda to može značiti da gen radi nešto loše prema vama E.coli.

Ako želite pripremiti plazmide. Mogli biste zapravo preskočiti tekuću kulturu. Samo resuspendirajte sa same agar ploče i nastavite s tipičnom metodom ekstrakcije plazmida, bilo da se radi o kompletu ili konvencionalnom. to bi trebalo da uradi

rintaron 30. januara 2009, 01 ᚪ PM rekao je:


Imam iskustva u rastu velike količine iz jedne kolonije.

Samo zato što vam je ovo funkcioniralo u prošlosti ne znači da je to u redu. Jeste li prvo pokušali stvoriti početnu kulturu? Ako ne, što imate izgubiti osim 8 sati ili više?


Donose se politike i grade objekti uz nepotpuno razumijevanje opasnosti

Važne odluke o javnom zdravlju i inženjeringu često se donose s nejasnom predodžbom o opasnostima.

Postoji tendencija pooštravanja politike i nadogradnje objekata sve dok broj koliformnih oblika na 100 ml u nekom trenutku procesa ne bude nula. Ako stvarni osjećaj opasnosti nije u fokusu, razumljivo je traženje jednostavnog jamstva nulte očitavanja.

Međutim, ovo je loš vodič za dizajn u poređenju sa stvarnim razumijevanjem. Uzmite u obzir:

  • Postrojenje za prečišćavanje otpadnih voda koje uklanja indikatorske bakterije ne smije ukloniti viruse testirat će se sigurno, ali u stvarnosti neće biti sigurno.
  • Zajednica na plaži sa septicima u Santa Barbari pod pritiskom je da se priključi na kanalizaciju, jer je studija otkrila oko 80 ljudskih fekalnih koliforma na 100 ml u vodi lagune. Zvuči užasno, šta god to značilo. Ali ono što to znači je da je u oko 30.000 galona lagune bilo pola kašičice ljudskog izmeta. Sav izmet za vrijeme trajanja studije mogao je doći iz jedne jednokratne pelene, a ne iz septike uopće. Milijuni dolara mogli bi se potrošiti na kanalizacijske priključke bez ikakve koristi.
  • Studija koja je pokazala 84.000 fekalnih koliformnih bakterija na 100 ml vode u sudoperu nije uzela u obzir mogućnost da se indikatori množe i da zapravo nije bilo toliko izmeta (ili patogena) u vodi. Ako su shvatili da je to otprilike jedna čajna žličica dnevno izmeta u sudoperu, možda bi zastali da razmisle da li se ovoliko izmeta zaista baca u sudoper. Ali na osnovu ove studije, zakon nije dopuštao sisteme sive vode u kuhinjskim sudoperama, ali u stvarnosti bi to moglo biti u redu.

Promega Connections

Naša eksperimentalna postavka: plišani mikrobi, Lego DNK, ploče, iPhone i improvizirani stalak, spremni za upotrebu. Naša osnovna škola je prije nekoliko sedmica održala godišnji sajam nauke. Zahvaljujući većem broju učenika nego što je uobičajeno među roditeljima, dvorane ovog događaja bile su obložene stolovima na kojima su bili roditelji, pokazujući čuda nauke, tehnologije, a posebno biotehnologije. Postojale su najmanje tri postaje posvećene različitim aspektima istraživanja matičnih ćelija, a na stolu do nas djeca su izvodila jednostavne ekstrakcije nukleinskih kiselina iz pšeničnih klica koristeći deterdžent i alkohol. Moj sin je to volio dok je izvlačio žilavu goop s q-tipkom na kraju procesa.

Moja supruga i ja doprinijeli smo proslavi sastavivši prezentaciju o transformaciji bakterija. Upravo sam završio s radom na iPhone® aplikaciji brojač kolonija za Promegu, pa sam zaključio zašto to ne bih isprobao na terenu: Odštampajte šarene ersatz bakterijske ploče, neka djeca prebroje kolonije pomoću aplikacije (joj, ekrani osjetljivi na dodir) !) i možda ih usput naučiti nešto o genetskom inženjeringu.

Pokazalo se da je naše postavljanje bilo jako zabavno za pokretanje i prilično popularno za pokretanje. Otprilike je to išlo otprilike ovako:

Korak 1: Plišane i lego kockice. Davno kada je moja žena završavala diplomu bakteriologije, kupio sam joj set nevjerovatno slatkih plišanih igračaka od mikroba (tzv. plišane). Pa smo ih izvukli iz naših dječjih spavaćih soba i postavili na sto: kvasac, Staphylococcus, an E. coli, i rinovirus (nisam mogao pronaći Epstein-Barr virus na vrijeme za festival). Djeca koja su prolazila odmah su primijetila, i nikada nisu propustila pitati šta je to. Ovo bi bio moj znak – Prvo bih pitao djecu šta misle da su plišani i šta misle da je DNK, i uhvatio bih se za svaki dio njihovog objašnjenja koji ima bilo kakvog smisla (“Vi ste potpuno DNK vam govori koju boju kose imate!”) Zatim pratim i upozoravam djecu da peru ruke nakon što pomaze virus prehlade.

Sljedeći je bio dio transformacije. Držeći se duha mikroba kao pliša, kooptirali smo lego koji predstavlja DNK: Dvoslojni žuti lego za (vrlo, vrlo shematski) bakterijsku plazmidnu DNK, mali sivi skup blokova kao umetak-naš gen od interesa . Konačno, crveni par blokova zamijenio je ko-umetak otporan na antibiotike.

Korak 2: Objašnjenje problema bakterijske transformacije. Zatim pitam djecu: da li stavljanje ovih lego kockica u plišane izgleda lako? (Evo, pokušao sam ubaciti lego kockice, a-la Monty Python gumby skicu) Ne! Deca bi se tome smejala. Pa, nastavio sam, ispostavlja se da je stavljanje DNK unutar bakterija gotovo jednako izazovno. Ali imamo trikove da to uradimo: objasnio sam elektroporaciju, u kojoj se bakterijska ćelija podvrgava blagom električnom udaru kako bi se omogućilo da njena membrana postane donekle propusna. Ali čak i tada, kako znamo da smo unijeli DNK?

Korak 3: Genetski trik otporan na antibiotike! Većina molekularne biologije je zbirka zaista đavolskih trikova (iako ja nisam molekularni biolog, volim čitati o ovoj oblasti iz ovog preciznog razloga). Prije nego što pokušamo ubaciti naš gen od interesa u bakteriju, prvo mu dodamo DRUGI gen, ovaj koji pruža otpornost na određeni antibiotik. Zatim transformiramo bakterije plazmidima koji zajedno sadrže oba ova gena. Dakle, ili bakterije nemaju NITI gen, ili OBA gena zajedno.

Ovisno o dobi djece, kažem "#8220antibiotik"#8221 ili jednostavno "#8220 otrov"#8221. Bilo je učenika 4. razreda koji razumiju šta su antibiotici (sigurno sam ih prvo zamolio da mi to objasne – ništa kao dopuštanje učeniku 4. razreda da pokaže svoje znanje), a bilo je i vrtića koji… stvarno nisu. I dalje su uživali gledajući me kako jašem okolo sa plišima i lego kockama.

Korak 4: Stavite naše transformirane bakterije na Petrijeve zdjelice. Evo, zamahnuo bih mutnom dlakom E. coli plišane na tanjuru, nasmijavajući djecu ponovo. (Volim ovaj posao!) I na kraju, oponašajte sipanje antibiotika/otrova. Bakterije koje nemaju ni gena u sebi, objasnio sam, “don ’t ne rade tako dobro ” (tužno E. coli pliš). Dok oni kojima je ubačen DNK dobro se snalaze i prave više kopija sebe. Ove tvore kolonije koje rastu, rastu i rastu, toliko da ih nakon nekog vremena možete vidjeti kao male mrlje na pločama.

Zatim se uključim i pokažem djeci naše lažne bakterijske ploče (dok uvjeravam roditelje da su to samo papirni ispisi zalijepljeni na dno tanjira, a ne prave bakterije – iako Bog zna da ih ima dovoljno na svim učenici osnovnih škola’ ruke). Ideja je da fleke potiču od pojedinačnih bakterija koje su cvetale uprkos otrovu (antibiotik, za stepen 3 i više) koji smo stavili na tanjire. Dakle, oni moraju imati gen otporan na antibiotike, pa samim tim i naš gen koji nas zanima (znam da sam to već rekao, ali ponavljanje je dobro u ovom poslu). Sada samo trebamo izbrojati koliko ovih mjesta postoji i možemo zaključiti koliko smo uspjeli u transformaciji.

Korak 5: Brojanje. Kao što sam ranije spomenuo, upravo sam završavao jednostavan brojač kolonija za iPhone kao radni projekt (sada se prodaje#8217 u trgovini aplikacija) pa sam učitao nekoliko primjera toga za osnovnu školu beta test, da vidite šta su učenici mislili o tome. Da bi sve bilo jednostavnije, sagradio sam jednostavan stalak od poster ploče i papira koji je štitio ploču koja se broji od izravnog svjetla (a time i odsjaja) istovremeno osiguravajući da se iPhone nalazi na pravoj visini od ploče . Djeca su slikala ploče s iPhoneom smještenim na vrhu njegovog postolja, neka automatsko brojanje napravi prvu aproksimaciju (nije loše, ali bi mu nedostajalo nekoliko kolonija tu i tamo), a zatim se zabavite dodavanjem propuštenih kolonija automatskim prebrojavanjem dodirom na njih.

Tokom jutra, oko 25 djece je došlo do našeg stola i pokušalo prebrojati kolonije na našim lažnim tablicama. Osim nekoliko značajnih odstupanja, konačni broj je bio unutar 7% prave vrijednosti. Činilo se da se klinci zabavljaju ručnim podešavanjima, a kao dodatni bonus uočio sam grešku na ekranu u aplikaciji koju smo imali priliku popraviti prije objavljivanja široj javnosti.

Prava je korist, međutim, bila ta što se činilo da su djeca iskreno zainteresirana za koncepte. Mogu se samo nadati da će zadržati nejasno sjećanje na plišane bakterije, lego DNK, električne šokove i iPhonee kada stvarno nauče principe genetskog inženjeringa, i možda će im to pomoći da ih uvjere da to zaista i nije tako magično , i može se razumjeti uz malo truda.


E.coli ne raste u tečnom LB, ali dobro raste na agar pločama - (21.11.2005.)

Imam mali, ali čudan problem sa svojim klonovima E.coli. U njima je označen vektor označen zastavicom, koji izražava moj protein, markerom za selekciju ampicilina/neomicina. Ove bakterije dobro rastu na pločama sa agarom dopunjenim ampicilinom, ali kada pokušam inokulirati 1 koloniju sa ovih ploča u LB medij (tečnost) sa dodatkom ampicilina, ne uspijevaju rasti?

Siguran sam da ne hvatam agar samo umjesto bakterija kada pokušavam inokulirati novi LB medij. Pokušao sam ovo dvaput i moje bakterije nisu rasle u LB.

Neki prijedlozi bi bili veoma počastvovani i cijenjeni.

Možete li ponovo potvrditi da li ste dodali Amp ili neki drugi antibiotik za odabir. Uzeti sveže i proveriti.

[quote name = 'Jak ' date = 'Nov 21 2005, 20:17 ' post = � ']

Znam, to je ampicilin 100 mg/ml osnovni rastvor od kojeg koristim razrjeđenje 1: 1000 u svom LB -u. to se obično preporučuje.

zdravo
odabir bušotine se takođe može obaviti razblaživanjem osnovnog rastvora 1: 2000
Pokušajte vidjeti hoće li vam coli narasti.

Ako je vaš protein toksičan za ćelije, to se često događa. Ampicilin ne traje dugo u tekućim medijima (10 minuta je naš laboratorijski folklor). Umjesto toga koristite karbaciilin jer je otporniji na beta-laktamazu i trajat će u tekućoj kulturi.

Trenutno imam isti problem.

Transformirana E. coli dobro raste na Amp pločama, ali kada se prenese u 4ml LB + Amp 1:1000 ne želi rasti.

Znam da bi ovo moglo zvučati kao glupa misao, ali pretpostavljam da je medij još uvijek bio previše vruć kada ste dodali AMP (pojačalo je prilično osjetljivo na temperaturu) tako da dobijate loš izbor sa medijskim pločama, a kolonije koje vidite su nije stvarno otporan. stoga kukaju kada ih dodate u juhu s AMP -om

samo misao. također, da biste izbjegli širenje satelitskih kolonija koje su izbacile vaš plazmid, morate subkultirati iz svježeg rasta na LB-AMP-u i ne dopustiti da ploče predugo sjede u inkubatoru, pa čak ni na sobnoj temperaturi

Imao sam isto iskustvo s nekim plazmidima gdje je umetak iz nekog razloga toksičan za e coli. Prema mojim iskustvima, možete dobro uzgajati male količine (npr. Miniprepe), međutim, kada isprobate maxiprep, bakterije se same liječe od plazmida. Vrlo male količine rastu i ja sam povratio vrlo malu količinu plazmida. Da bih ovo zaobišao, odrastao sam nekoliko mini priprema i kombinovao DNK dok nisam imao dovoljno za rad. Možda prvo isprobajte mini pripreme i provjerite možete li to uspjeti. Ako mislite da imate problema sa sistemom (npr. Odabir pojačala), možete koristiti kontrolni plazmid s pojačalom. Siguran sam da ćete ga pronaći u svojoj laboratoriji.

Da li je neko od vas pročitao moj post iznad?

Provjerite je li koncentracija pojačala isto u LB. Nakon koliko sati imate kolonije na agar ploči? Pokušajte koristiti 2X LB. Provjerite dobivate li kolonije ako imate niz#33


Morfologija kolonija nekih uobičajenih bakterija na MacConkey agaru


Svijetlo ružičasta, male kolonije S. aureus (gore) i tamno ružičastocrvene, sitne kolonije Enterococcus (ispod) na MacConkey agaru bez žučnih soli i kristal ljubičice.

Bilješka: Gram-pozitivni organizmi inhibirani su u MacConkey agaru sa žučnim solima i kristalno ljubičastom bojom, međutim, u drugačijoj formulaciji gdje žučna sol i kristalna ljubičica nisu inkorporirane, gram-pozitivni organizmi pojavljuju se i kao fermentatori laktoze, ali su manje veličine od gram-negativnih one.


Ekscizija stranih gena od strane E.coli - sumnja na napad (04. februar 2007.)

Imao sam problema sa kloniranjem jednog od mojih gena i sumnjam da ga moja E. coli napada. Pitam se da li je veća vjerojatnost da će E. coli izrezati određene strane gene od drugih. Koje vrste mašina za eksciziju ili čak rekombinaciju E. coli ima i da li moderni sojevi sprečavaju da se to dogodi?

Erm. kako E.coli može napasti gen? Možda imaju gen koji kodira DNK? ili čak neki RE.

da li je vaš soj ekspresije RecA + ili -?

je li vaš proizvod pretjerano proizveden i otrovan za e coli?

i koji dio vam stvara poteškoće? dio za spajanje gena ili dio ekspresije?

je li vaš izraz izražavanja RecA + ili -?

je li vaš proizvod previše proizveden i toksičan za e coli?

i koji dio vam stvara poteškoće? dio za spajanje gena ili ekspresijski dio?

Moj soj je RecA1- i gen je uključen u glutamatne receptore i uključen je u trgovinu/transport glutamata tako da nisam siguran, ali ne mislim da je toksičan. Ne znam šta postavljate u trećem pitanju, ali kloniram kodirajuću sekvencu gena ako to odgovara.

U redu, ovo je moje razumijevanje stvari -
E. coli, budući da je prokariotski, ponekad posebno dobro ne podnosi karakteristike eukariotske DNK. Sekundarne strukture poput terminalnih ponavljanja, invertiranih ponavljanja i drugih struktura često se izrezuju i uklanjaju proteinima E. coli. Postoji ćelijska linija koja se zove SURE/SURE2 i koja je dizajnirana da spriječi da se to dogodi, i ja sam imao izvjestan uspjeh sa zaštitom terminalnih ponavljanja na virusnim vektorskim plazmidima.
Takođe, uobičajeno je da se dobije curenje ekspresije iz plazmida, čak i ako nisu dizajnirani za ekspresiju E. coli - mislim da vektori ekspresije sisara mogu biti problematični ako imaju CMV promotor, koji može raditi u E. coli. Dakle, ako E. coli ne voli vaš genski proizvod, nećete dobiti kolonije, očito su geni helikaze i replikaze često otrovni za bakterije.
Imao sam nekih problema sa onim što sam od milja nazvao konstruktom iz pakla, jedine ćelije u koje bi se mali **** transformisao (nakon ligacije) bila je druga Stratagene ćelijska linija pod nazivom ABLE, koja je dizajnirana za toksične konstrukte, smanjuje broj kopija plazmida . No, skupi su za kupnju, pa bi to bio skup način da saznate rade li.
Koji plazmid koristite?

Hvala na odgovoru. Zaista imamo SIGURNE ćelije na zalihama pa ću ih probati. Nisam siguran da li imamo CMV promotor u našem plazmidu, iskreno rečeno, ne znamo mnogo o plazmidu. To je plazmid s velikim brojem kopija, tako da bih također mogao tražiti soj otporan na toksičnost poput onog koji spominjete samo u slučaju da je moj gen toksičan, iako mislim da nije. Uključuje se u glutamatne receptore.


Living With

Koliko dugo traje E. coli preživjeti izvan tijela?

E. coli može preživjeti izvan tijela satima do mjesecima. U zemljištu može da živi oko 130 dana. E. coli preživljava u riječnoj vodi 27 dana, a u goveđi 10 dana. Na nerđajućem čeliku, E. coli pokazalo se da preživljava više od 60 dana. Opstaje najmanje 12 sati na drvenim daskama za rezanje.

Mnogi faktori utiču na to koliko dugo E. coli mogu živjeti izvan tijela uključujući temperaturu, prisustvo vode, dostupnost hranjivih tvari, pH i sunčevo zračenje.

Kako E. coli izazvati infekciju urinarnog trakta?

Urinarne infekcije ponekad nastaju kada E. coli iz gastrointestinalnog trakta uđu u urinarni trakt. To se može lakše dogoditi kod žena jer se anus (gdje kaka izlazi iz vašeg tijela) nalazi blizu uretre (cijevi iz koje urin izlazi iz tijela). E. coli bakterije mogu putovati uz mokraćnu cijev do mokraćne bešike, pa čak i do uretera i bubrega. Možda vam je rečeno – ako ste žena – da uvijek “brišete od naprijed prema nazad”. Ovo je da se slučajno ne proširite E. coli bakterija iz anusa do uretre.

Najčešće infekcije urinarnog trakta uzrokovane E. coli su infekcija mokraćne bešike (cistitis), infekcija uretre (uretritis) i infekcija bubrega.

Postoje li bolji izbori hrane koje mogu napraviti nakon što se osjećam bolje nakon E. coli infekcija?

Pijte bistre tečnosti, poput čorbi, bistrih gaziranih pića i vode. Držite se blage hrane s malo vlakana poput tosta, riže, običnih krekera i umaka od jabuka. Klonite se hrane bogate vlaknima, masne hrane i mliječnih proizvoda.

Kada se mogu vratiti na posao ili u školu ako sam zaražen E. coli?

Proverite kod svog lekara. Ako je vaša infekcija bila dio lokalne epidemije, vaš lokalni državni odjel za zdravstvo mogao bi imati posebna uputstva o tome kada je sigurno biti u blizini grupa ljudi.

Bilješka klinike Cleveland

Najbolji i najlakši način da izbjegnete dobivanje E. coli infekcija je često pranje ruku sapunom i vodom. Operite ruke prije i nakon rukovanja hranom (uključujući pripremu, kuhanje i posluživanje hrane), nakon korištenja kupaonice, nakon dodirivanja životinja (posebno životinja na farmi ili u zoološkom vrtu), nakon mijenjanja pelena i nakon rukovanja ili dodirivanja od strane drugih (nikad se ne zna šta njihove ruke su se dodirnule). Pranje ruku ne samo da može spriječiti zarazu E. coli, ali i mnoge druge zarazne bolesti koje se šire od osobe do osobe. Učinite često pranje ruku novom navikom.

Imajte na umu da većina sojeva E. coli su bezopasne. Čak i ako dođete do soja STEC O157, vaši simptomi će se sami povući u roku od pet do sedam dana. Pijte puno tekućine kako biste ostali hidrirani i dobili dovoljno odmora.

Nazovite svog ljekara ako imate proljev (a posebno krvavi proljev) duže od tri dana, imate problema sa zadržavanjem tekućine i imate stalne napade povraćanja i imate povišenu temperaturu. Ovi simptomi mogu značiti da razvijate ozbiljne komplikacije koje mogu dovesti do zatajenja bubrega.

Posljednji put pregledao medicinski radnik klinike Cleveland 21.9.2020.

Reference

  • Centri za kontrolu i prevenciju bolesti. E.coli (Escherichia coli). Pristupljeno 14.9.2020.
  • Američko ministarstvo zdravlja i ljudske usluge. E. coli. Pristupljeno 14.9.2020.
  • Američka akademija porodičnih ljekara. Infekcija E. coli. Pristupljeno 14.9.2020.
  • Shepherd E. Zbirka uzoraka 3: Uzimanje fekalnog uzorka od pacijenta s dijarejom. Sestrinska vremena 2017113 (8): 27-29. Pristupljeno 14.9.2020.
  • Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Država. Tabela sigurne minimalne unutrašnje temperature. Pristupljeno 14.9.2020.
  • Nacionalni institut za alergije i zarazne bolesti. E. coli. Pristupljeno 14.9.2020.
  • Maule A. Preživljavanje verocitotoksigene Escherichia coli O157 u tlu, vodi i na površinama. Symp Ser Soc Appl Microbiol. 2000 (29): 71S-78S. Pristupljeno 14.9.2020.

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koja nije Cleveland. Policy

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koja nije Cleveland. Policy

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koji nisu u Clevelandu. Politika

Povezani instituti i usluge

Community Care

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koja nije Cleveland. Politika

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koja nije Cleveland. Politika

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koji nisu u Clevelandu. Politika

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koja nije Cleveland. Politika

Klinika Cleveland je neprofitni akademski medicinski centar. Oglašavanje na našoj web stranici podržava našu misiju. Ne podržavamo proizvode ili usluge klinike koja nije Cleveland. Politika


Rast E. Coli u M9 minimalnim medijima

Hej momci, pa pokušavam uzgajati bakterije otporne na klor, kan i klor/kan u minimalnim medijima M9 i iz nekog razloga izgleda da ne može doći do rasta mojih medija dopunjenih antibioticima. Ja sam prepolovio koncentraciju antibiotika zbog manje prijateljske prirode medija, moji plazmidi su velike kopije, a ploče su potpuno nove. Ima li ideja? Hvala!

Koji soj? Da li ste potvrdili da su bakterije uspješno transformirane plazmidima otpornosti na antibiotike koji sadrže gen?

One su prvih 10 ćelija i da, uzgajao sam ih na odgovarajućim pločama.

Da budem iskren, u mom pospanom stanju, u ovom slučaju, nisam pokušao da rastem bez antibiotika. Radio sam to ranije i postigao sam rast.

Koliko dugo ih puštate da rastu? Koliko se sećam, ćelije sporije rastu na M9 medijumu, a kada dodate antibiotike (čak i kada ih prepolovite), dodajete veliki stres E. coli.

Pa za sada su inkubirali

Jeste li sigurni da je M9 dobre kvalitete? (Jeste li ga kupili ili napravili sami?) Da li ste pogrešno pomiješali medij ili aminokiseline? Pokušajte prošarati neke ćelije u nedostatku antibiotika, samo da provjerite njihov rast u vašem M9.

M9 soli su dobre, sam sam ih napravio. Koncentracije biotina i tiamina - mogle bi biti isključene, ali mislim da nije.

Takođe, ovo je tečna kultura. Ja sam svoje kolonije uzgajao na LB pločama i brao ih za rast u tekućem M9.

Stalno uzgajam E. coli u M9 kako bih izotopski označio proteine ​​za NMR. Vreme udvostručavanja mojih BL21 (DE3) je samo oko 1 sat u M9, dok jeste

24 minuta u LB koristeći potpuno istu koncentraciju kanamicina, potpuno isti glicerinski zalogaj bakterija i isti šejker. Dakle, da, oni će rasti sporije. Objavite svoj M9 recept ako ga sami pravite i možda ću moći uočiti greške koje možda pravite.

U suprotnom, uradite test kulturu u LB kao što je sirhelix rekao, čak i 10 ml bi trebalo biti u redu i možete to učiniti preko noći kako biste bili sigurni da vaš plazmid nije toksičan.

Uzgajate li ih u minimalnim medijima iz određenog razloga?

28 sati, ali ako vrijeme udvostručenja skoči na sat, mogao sam vidjeti kako se to zbraja. Moj M9 recept je:

Na2HPO4 x 7H2O: 60 g KH2PO4: 30 g NaCl: 5 g NH4Cl: 10 g

1X M9 minimalni medij. Sterilna voda: 900 ml M9 soli 10X osnovna otopina: 100 ml Autoklavirano 1 M MgSO4: 1 ml Autoklavirano 1 M CaCl2: 0,1 ml

Dodaci minimalnim medijima M9. Glukoza: 0,4% Tiamin: 1 μg/mL Biotin: 1 μg/mL

A ovo su iz LB ploča, pa znam da rastu. Također sam izgradio, pročistio i sekvencirao sve plazmide iz rasta LB, tako da to ne bi trebao biti problem.

Dizajniram sistem koji uključuje GFP ekspresiju, pa želim da izvršim merenja fluorescencije u čitaču ploča. Budući da LB ima problema s pozadinskom fluorescencijom, M9 bi bio poželjniji.


Laboratorija 6: Boj po Gramu i Boj kapsule

Bojenje po Gramu je najrasprostranjeniji postupak bojenja u bakteriologiji. Zove se a diferencijalna mrlja budući da razlikuje gram-pozitivne i gram-negativne bakterije. Bakterije koje mrlje ljubičasta sa postupkom bojenja po Gramu se nazivaju Gram-pozitivan oni koji mrlje roze se kaže da jesu Gram-negativan. Izrazi pozitivan i negativan nemaju nikakve veze s električnim nabojem, već jednostavno označavaju dvije različite morfološke grupe bakterija.

Gram-pozitivne i gram-negativne bakterije različito se boje zbog fundamentalnih razlika u strukturi njihovih staničnih stijenki. Bakterijska stanična stijenka služi za davanje organizmu njegove veličine i oblika, kao i za sprječavanje osmotske lize. Materijal u zidu bakterijske ćelije koji daje krutost je peptidoglikan.

Na elektronskim mikro snimcima, Gram-pozitivna stanična stijenka izgleda kao široka, gusta stijenka debljine 20-80 nm koja se sastoji od brojnih međusobno povezanih slojeva peptidoglikana (Slike 1A i 1B). Hemijski, 60 do 90% gram-pozitivnih ćelijskih zidova je peptidoglikan. U ćelijskom zidu Gram-pozitivnih su utkane teihoične kiseline. Teihoične kiseline, koje se protežu kroz i izvan ostatka stanične stjenke, sastoje se od polimera glicerola, fosfata i šećernog alkohola ribitola. Neki imaju vezan lipid (lipoteihoična kiselina). Vanjska površina peptidoglikana posuta je proteinima koji se razlikuju ovisno o soju i vrsti bakterije.

The Gram-negativni ćelijski zid, s druge strane, sadrži samo 2-3 sloja peptidoglikana i okružena je vanjskom membranom sastavljenom od fosfolipida, lipopolisaharida, lipoproteina i proteina (slike 2A i 2B). Samo 10-20% gram-negativnog ćelijskog zida čini peptidoglikan. Fosfolipidi se nalaze uglavnom u unutrašnjem sloju vanjske membrane, kao i lipoproteini koji povezuju vanjsku membranu sa peptidoglikanom. Lipopolisaharidi, smješteni u vanjskom sloju vanjske membrane, sastoje se od lipidnog dijela zvanog lipid A koji je ugrađen u membranu i polisaharidnog dijela koji se proteže prema van s bakterijske površine. Vanjska membrana također sadrži brojne proteine ​​koji se razlikuju ovisno o soju i vrsti bakterije.

Za dodatne informacije o gram-negativnoj i gram-pozitivnoj ćelijskoj stjenci pogledajte sljedeće predmete učenja u svom vodiču za predavanja:

Postupak bojenja po Gramu uključuje četiri osnovna koraka:

1. Bakterije se prvo boje osnovnom bojom kristalno ljubičasta. I Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije postaju direktno obojene i izgledaju ljubičaste nakon ovog koraka.

2. Zatim se bakterija tretira Gramov rastvor joda. To omogućava bolje zadržavanje mrlje formiranjem nerastvorljivog kristalno-ljubičasto-jodnog kompleksa. I gram-pozitivne i gram-negativne bakterije ostaju ljubičaste nakon ovog koraka.

3. Gramov obezbojivač, mješavina etil alkohol i aceton, zatim se dodaje. Ovo je diferencijalni korak. Gram-pozitivne bakterije zadržavaju kristal-ljubičasto-jodni kompleks, dok se gram-negativne obezboje.

4. Konačno, kontra mrlja safranin (također osnovna boja). Budući da su Gram-pozitivne bakterije već obojene u ljubičastu boju, na njih ne utječe protuboja. Gram-negativne bakterije, koje su sada bezbojne, postaju direktno obojene safraninom. Dakle, Gram-pozitivni izgledaju ljubičasto, a Gram-negativni ružičasti.

S trenutnom teorijom koja se temelji na bojenju po Gramu, smatra se da se u gram-pozitivnim bakterijama kristalna ljubičica i jod spajaju i tvore veću molekulu koja se taloži u ćeliji. The alcohol/acetone mixture then causes dehydration of the multilayered peptidoglycan, thus decreasing the space between the molecules and causing the cell wall to trap the crystal violet-iodine complex within the cell. In the case of Gram-negative bacteria, the alcohol/acetone mixture, being a lipid solvent, dissolves the outer membrane of the cell wall and may also damage the cytoplasmic membrane to which the peptidoglycan is attached. The few layers of peptidoglycan are unable to retain the crystal violet-iodine complex and the cell is decolorized.

It is important to note that Gram-positivity (the ability to retain the purple crystal violet-iodine complex) is not an all-or-nothing phenomenon but a matter of degree. Oni su several factors that could result in a Gram-positive organism staining Gram-negatively:

1. The method and techniques used. Overheating during heat fixation, over decolorization with alcohol, and even too much washing with water between steps may result in Gram-positive bacteria losing the crystal violet-iodine complex.

2. The age of the culture. Cultures more than 24 hours old may lose their ability to retain the crystal violet-iodine complex.

3. The organism itself. Some Gram-positive bacteria are more able to retain the crystal violet-iodine complex than others.

Therefore, one must use very precise techniques in Gram staining and interpret the results with discretion.

Trypticase Soy agar plate cultures of Escherichia coli (a small, Gram-negative bacillus) and Staphylococcus epidermidis (a Gram-positive coccus with a staphylococcus arrangement).

POSTUPAK (to be done individually)

1. Escherichia coli

a. Heat-fix a smear of Escherichia coli kao što slijedi:

1. Using the dropper bottle of deionized water found in your staining rack, place 1/2 of a normal sized drop of water on a clean slide by touching the dropper to the slide (Figure 1). Altenately, use your sterilized inoculating loop to place a drop of deionized water on the slide.

2. Using your sterile inoculating loop, aseptically remove a small amount of the culture from the agar surface and gently touch it 2 - 3 times to the drop of water until the water becomes visibly cloudy (Slika 2). A good smear with the correct amount of bacteria is essential to Gram staining.

  • Too many bacteria on the slide could result in under-decolorization too few could lead to over-decolorization.

3. Incinerate the remaining bacteria on the inoculating loop. If too much culture is added to the water, you will not see stained individual bacteria and you may not have a reliable Gram stain.

4 . After the inoculating loop cools, spread the suspension over approximately half of the slide to form a thin film. A correctly prepared smear with the right amount of bacteria should look similar to Fig. 3.

5. Allow this thin suspension to completely air dry (Figure 4). The smear must be completely dry before the slide is heat fixed!

6 . To heat-fix the bacteria to the slide,pick up the air-dried slide with coverslip forceps and hold the bottom of the slide opposite the smear near the opening of the microincinerator for 10 seconds (Figure 5) as demonstrated by your instructor. If the slide is not heated enough, all of the bacteria will wash off. If it is overheated, the bacteria structural integrity can be damaged.

b . Stain with Hucker's kristalno ljubičasta for jedan minut (Slika 6). Gently oprati with water (Slika 7). Shake off the excess water but do not blot dry between steps.

c . Stain with Gram's iodine solution for jedan minut (Figure 8) and nježno oprati with water.

d . Decolorize by picking up the slide and letting the Gram's decolorizer run down the slide until the purple just stops flowing at the bottom of the slide (Slika 9).

  • Make sure the entire smear is evenly decolorized and that you are not under-decolorizing or over-decolorizing.
  • Wash immediately with water.

e . Stain with safranin for jedan minut (Slika 10). When you wash off the excess safranin, be very careful to wash gently and briefly as it is possible to wash out some of the sarfanin in the bacterium.

f. Blot dry (Figure 11) and observe using oil immersion microscopy.

2 . Staphylococcus epidermidis

a. Heat-fix a smear of Staphylococcus epidermidis kao što slijedi:

1. Using the dropper bottle of deionized water found in your staining rack, place 1/2 of a normal sized drop of water on a clean slide by touching the dropper to the slide (Figure 1). Altenately, use your sterilized inoculating loop to place a drop of deionized water on the slide.

2. Using your sterile inoculating loop, aseptically remove a small amount of the culture from the agar surface and gently touch it 2 - 3 times to the drop of water until the water becomes visibly cloudy (Slika 2).

  • Too many bacteria on the slide could result in under-decolorization too few could lead to over-decolorization.

3. Incinerate the remaining bacteria on the inoculating loop. If too much culture is added to the water, you will not see stained individual bacteria and you may not have a reliable Gram stain.

4 . After the inoculating loop cools, spread the suspension over approximately half of the slide to form a thin film (Figure 3).

5. Allow this thin suspension to completely air dry (Figure 4). The smear must be completely dry before the slide is heat fixed!

6 . To heat-fix the bacteria to the slide,pick up the air-dried slide with coverslip forceps and hold the bottom of the slide opposite the smear near the opening of the microincinerator for 10 seconds (Figure 5) as demonstrated by your instructor. If the slide is not heated enough, all of the bacteria will wash off. If it is overheated, the bacteria structural integrity can be damaged.

b . Stain with Hucker's kristalno ljubičasta for jedan minut (Slika 6). Gently oprati with water (Slika 7). Shake off the excess water but do not blot dry between steps.

c . Stain with Gram's iodine solution for jedan minut (Figure 8) and nježno oprati with water.

d . Decolorize by picking up the slide and letting the Gram's decolorizer run down the slide until the purple just stops flowing at the bottom of the slide (Slika 9).

  • Make sure the entire smear is evenly decolorized and that you are not under-decolorizing or over-decolorizing.
  • Wash immediately with water.

e . Stain with safranin for jedan minut (Slika 10). When you wash off the excess safranin, be very careful to wash gently and briefly as it is possible to wash out some of the sarfanin in the bacterium.

f. Blot dry and observe using oil immersion microscopy.

3. Make sure you carefully pour the used dye in your staining tray into the waste dye collection container, ne down the sink.

B. THE CAPSULE STAIN

Many bacteria secrete a slimy, viscous covering called a capsule or glycocalyx . This is usually composed of polysaccharide, polypeptide, or both.

The ability to produce a capsule is an inherited property of the organism, but the capsule is not an absolutely essential cellular component. Capsules are often produced only under specific growth conditions. Even though not essential for life, capsules p robably help bacteria to survive in nature. Capsules help many pathogenic and normal flora bacteria to initially resist phagocytosis by the host's phagocytic cells. In soil and water, capsules help prevent bacteria from being engulfed by protozoans. Capsules also help many bacteria to adhere to surfaces and thus resist flushing. It also enables many bacteria to form biofilms. A biofilm consists layers of bacterial populations adhering to host cells and embedded in a common capsular mass.

For further information on the bacterial capsules, see the following Learning Objects in your Lecture Guide:

Skim Milk broth culture of Enterobacter aerogenes. The skim milk supplies essential nutrients for capsule production and also provides a slightly stainable background.

POSTUPAK (to be done individually)

1. Stir up the Skim Milk broth culture with your loop and place 2-3 loops of Enterobacter aerogenes on a microscope slide.

2. Using your inoculating loop, spread the sample out to cover about one inch of the slide.

3. Let it completely air dry. Do not heat fix. Capsules stick well to glass, and heat may destroy the capsule.

4. Stain with kristalno ljubičasta for jedan minut.

5. Wash off the excess dye with 20% copper sulfate solution.

6. Shake off the excess copper sulfate solution and immediately blot dry.

7. Observe using oil immersion microscopy. The organism and the milk dried on the slide will pick up the purple dye while the capsule will remain colorless.

8 . Make sure you carefully pour the used dye in your staining tray into the waste dye collection container, ne down the sink.

9. Observe the demonstration capsule stain of Streptococcus lactis , an encapsulated bacterium that is normal flora in milk.


Pogledajte video: E. coli and the hazards to human health (Oktobar 2022).