Informacije

Staphylococcus aureus - Biologija

Staphylococcus aureus - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Staphylococcus aureus

Naučnici otkrivaju da se antimikrobni lijekovi na bazi srebra mogu koristiti kao antibiotski adjuvansi u borbi protiv Staphylococcus aureus otpornog na antibiotike

Istraživački tim predvođen profesorom Hongzhe SUN-om, Norman & Cecilia Yip profesorom bioanorganske hemije i profesorom na katedri za Istraživački odjel za hemiju i Odsjeka za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta, u saradnji sa dr Richardom Yi-Ysun KAO, vanrednim profesorom s Odsjeka za Mikrobiologija, Medicinski fakultet Li Ka Shing i dr Aixin YAN, vanredni profesor na Fakultetu bioloških nauka, Univerziteta u Hong Kongu (HKU), otkrivaju da se antimikrobni proizvodi na bazi srebra (Ag) mogu efikasno boriti protiv rezistencije na antibiotike Staphylococcus aureus ciljajući više bioloških puteva putem funkcionalnog poremećaja ključnih proteina i mogu se dalje iskoristiti za povećanje učinkovitosti konvencionalnih antibiotika, kao i za ponovnu promjenu osjetljivosti na meticilin Staphylococcus aureus (MRSA) na antibiotike.

Studija rješava dugogodišnje pitanje molekularnih meta srebra u Staphylococcus aureus i nudi uvid u održivu bakterijsku osjetljivost srebra, pružajući novi pristup u borbi protiv otpornosti na antimikrobne tvari. Revolucionarni nalazi su sada objavljeni u vodećem multidisciplinarnom naučnom časopisu, Nature Communications.

Antibiotici su lijekovi dizajnirani za ubijanje bakterija i liječenje bakterijskih infekcija. Otpornost na antibiotike nastaje kada se bakterije prilagode kao odgovor na pogrešnu ili prekomjernu upotrebu ovih lijekova, i to je postao jedan od najvećih izazova javnog zdravlja u ovoj eri. Najmanje 2,8 miliona ljudi godišnje dobije infekciju otpornu na antibiotike u SAD-u, a više od 35.000 ljudi umre od nje.

Staphylococcus aureus, gram-pozitivna bakterija okruglog oblika, opasan je i svestran patogen za ljude i procjenjuje se da je približno 30% ljudske populacije asimptomatski nazalni i dugotrajni nosioci. Staphylococcus Uzročnik je raznih bolesti, poput infekcije kože, trovanja hranom, infekcije kostiju/zglobova i bakteremije, u rasponu od subakutne površinske infekcije kože do septicemije opasne po život. Porast incidencije je praćen porastom sojeva otpornih na antibiotike, posebno MRSA. Štaviše, izbijanje pandemije bolesti korona virusa 2019 (COVID-19) može dodatno povećati otpornost na antibiotike zbog teške upotrebe antibiotika za liječenje pacijenata zaraženih teškim akutnim respiratornim sindromom Coronavirus 2 (SARS-COV-2). S obzirom na brzu pojavu rezistencije na lijekove Staphylococcus aureus ali nedostatak cjevovoda za razvoj antibiotika, hitno su potrebne alternativne strategije za borbu protiv rezistencije na antibiotike Staphylococcus aureus.

Ključni nalazi

Metalni joni su se kroz istoriju koristili kao antimikrobni agensi zbog svojih inherentnih antimikrobnih svojstava širokog spektra i manje šanse za otpornost. Postoji sve veći interes za revitalizaciju spojeva na bazi metala kao obećavajuće alternative za rješavanje krize rezistencije na antimikrobne tvari. Srebrni joni (Ag+) i nanočestice srebra (AgNP) vekovima se koriste kao antimikrobni agensi i još uvek se široko koriste u zdravstvenoj i prehrambenoj industriji. Prethodno je tim izgradio tehničku platformu pod nazivom LC-GE-ICP-MS za sistematsku identifikaciju Ag+-proteoma u Escherichia coli i razvili strategiju pod nazivom reprogramiranje metaboloma za poboljšanje učinkovitosti antibakterijskih metal-lijekova (PLoS Biol., 2019, 17, e3000292 Chem. Sci., 2019, 10, 7193-7199 Chem. Sci., 2020, 11, 11714-11719).

U ovoj studiji, koristeći prilagođeni pristup LC-GE-ICP-MS, tim je uspješno odvojio i identificirao 38 autentičnih proteina koji vežu Ag+(Ag+-protem) Staphylococcus aureus na ljestvici cijelih ćelija. U kombinaciji s bioinformatičkom analizom i sistematskom biohemijskom karakterizacijom, oni pokazuju da Ag+ iskorištava akciju sačmarice ciljajući više proteina, ometajući na taj način višestruke puteve, uključujući glikolizu, put oksidativnog pentoza fosfata (oxPPP) i sistem odbrane od stresa od reaktivnih vrsta kisika (ROS). , kako bi pokazao svoj baktericidni učinak protiv Staphylococcus aureus. Daljnje studije su otkrile da oxPPP služi kao vitalni put na meti Ag+ in Staphylococcus aureus, pri čemu je 6PGDH identificiran kao ključni enzim uključen u inhibitorne efekte Ag+ protiv Staphylococcus aureus. Oni su riješili prve kristalne strukture 6PGDH iz Staphylococcus aureus i u supstratu i u obliku vezanom za Ag i otkrili su da je Ag+ ukinuo enzimsku aktivnost 6PGDH ciljajući Histidin 185 na aktivno mjesto i mijenjajući njegov katalitički džep. Ova studija rješava dugotrajno pitanje o molekularnim ciljevima i načinu djelovanja srebra na njih Staphylococcus aureus. Takav jedinstveni način djelovanja srebra putem ciljanja na više puteva daje nemogućnost odabira otpornosti na srebro Staphylococcus aureus i daje mu održivu efikasnost protiv Staphylococcus aureus.

Na osnovu otkrivenog molekularnog mehanizma, oni dalje pokazuju da Ag+/AgNP može pojačati efikasnost širokog spektra antibiotika, preosjetiti MRSA na antibiotike i usporiti razvoj rezistencije na antibiotike u Staphylococcus aureus. Stoga bi kombinacija antibiotika sa srebrom ili drugim spojevima na bazi metala ili nanomaterijalima mogla poslužiti kao obećavajuća strategija za suzbijanje selekcijskih učinaka antibiotika, čime se sprječava pojava primarne rezistencije na antibiotike i produžuje životni vijek konvencionalnih antibiotika za ublažavanje trenutne krize rezistencije na antibiotike.


Pozadina

Otporan na meticilin Staphylococcus aureus (MRSA) je identificiran kao jedan od glavnih rizičnih patogena povezanih s razvojem antimikrobne rezistencije (AMR). Pojava AMR -a u S. aureus dobro je dokumentirano, a vrsta se pokazala posebno spretnom u razvijanju rezistencije pred novim izazovima antibiotika. Uvođenje penicilina 1940 -ih najavilo je revoluciju u liječenju zaraznih bolesti. Međutim, u isto vrijeme kada je njegova upotreba postajala sve raširenija nakon napretka u povećanju proizvodnje, dokazi o rezistenciji na peniciline u S. aureus je već bio otkriven [1].

Meticilin (Celbenin), polusintetički β-laktam, predstavljen je u Velikoj Britaniji 1959. kako bi se zaobišla rastuća rezistencija na penicilin u S. aureus, povezan sa akvizicijom enzima β-laktamaze, blaZ [2]. Kao β-laktamski antibiotik druge generacije, meticilin je bio neosjetljiv na razgradnju BlaZ-a. Nakon uvođenja meticilina u kliničku praksu u Velikoj Britaniji, Referentna laboratorija za stafilokoke u Colindaleu (London, Engleska) izvršila je skrining S. aureus izolata za dokaz rezistencije na ovaj antibiotik [3]. Više od 5000 S. aureus sojevi su procijenjeni u razdoblju od listopada 1959. do studenog 1960., a u listopadu 1960. identificirana su tri izolata koji pokazuju povećanu minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC) za novi lijek, meticilin. Izolati potječu iz iste bolnice i dijele zajednički tip faga i profil otpornosti (penicilin, streptomicin i tetraciklin), što sugerira da su povezani. U opisu ovih izolata navedeno je da je meticilin ranije korišćen samo jednom u ovoj bolnici, te da niko od osoba kod kojih je MRSA izolovan nije bio izložen lijeku. U roku od 2 godine MRSA je otkrivena drugdje u Europi, a invazivne infekcije su identificirane u Danskoj [4]. Ovi izolati MRSA iz Velike Britanije i Danske početkom 1960 -ih čine prvi epidemijski klon MRSA.

Genetska osnova rezistencije na meticilin u S. aureus povezan je s nošenjem mobilne kasete gena poznate kao stafilokokni kasetni hromozom mec (SCCmec) [5]. Unutar ove kasete je mecA gen koji je odgovoran za otpornost na β-laktame uključujući meticilin. Proizvod od mecA je enzim za sintezu peptidoglikana, protein koji veže penicilin (PBP) 2a, koji sudjeluje u umrežavanju peptidoglikana u staničnoj stijenci bakterije [6, 7]. PBP2a ima manji afinitet vezivanja za β-laktamske antibiotike od nativnih PBP proteina kodiranih u jezgru gena S. aureus. Posljednja kombinacija smanjenog afiniteta vezivanja za penicilin i povećane proizvodnje PBP2a objašnjava uočenu rezistenciju na β-laktamske antibiotike.

Genetske analize prve MRSA tipizacijom sekvence sa više lokusa (MLST) pokazale su da je riječ o tipu sekvence (ST) 250, lozi koja pripada klonalnom kompleksu (CC) 8 i nosila je tip I SCCmec element [8, 9]. Nakon što se pojavio u Velikoj Britaniji, ovaj prvi epidemijski klon MRSA (ST250-MRSA-I) proširio se Evropom tokom 1960-ih i 70-ih, ali je do kraja 1980-ih postao manje rasprostranjen i sada se rijetko prijavljuje [9,10,11]. Jedinstvena lokusna varijanta i bliski srodnik ST250-MRSA-I, ST247-MRSA-I je prvi put otkrivena u Danskoj 1964. [8] i bila je uspješnija, šireći se globalno i opstojeći kao izvor izbijanja u Evropi do kasnih 1990-ih. [10, 11], ali su i to zamijenili uspješniji savremeni klonovi [10]. Pet decenija nakon pojave prve MRSA, pojavile su se više MRSA loze koje su dobile različite varijante SCC.mec elementi.

Epidemiološki dokazi su uvijek upućivali da je MRSA nastala kao posljedica uvođenja meticilina u kliničku praksu. Ovdje smo koristili sekvenciranje cijelog genoma iz zbirke od 209 najranijih izolata MRSA pronađenih u Evropi između 1960. i 1989. godine kako bismo rekonstruirali evolucijsku historiju rezistencije na meticilin. Koristeći Bayesovu filogenetsku rekonstrukciju identifikovali smo vjerovatno vrijeme u kojem je nastala ta rana loza i predvidjeli vrijeme oko kojeg će SCCmec je stečeno.


STAFILOKOKUS AUREUS

Staphylococcus aureusje gram-pozitivan, koagulaza-pozitivan, katalaza-pozitivan, nepokretni kok pronađen u rodu Staphylococcus i porodicu Staphylococcaceae. Oni su fakultativni anaerobni organizmi i uzrokuju hemolizu na krvnom agaru. Staphylococcus vrste su obično raspoređene u grupe, u parove, kao i u tetrade. Mogu se pojaviti i pojedinačno ili kao pojedinačne ćelije. S. aureus obično se pod mikroskopom pojavljuju kao grozdovi. Po prirodi su asporogene ili nesporalne. Asporogene bakterije su organizmi koji ne proizvode spore. S. aureus se uobičajeno nalaze u nosu ljudi, ali se mogu redovno nalaziti na većini drugih anatomskih mjesta u tijelu kao što su respiratorni trakt, sluzokože, GIT i koža. Mogu se naći i na fomitima uključujući stolove, materijale za odjeću i posteljinu. Od svih vrsta stafilokok, samo Staphylococcus epidermidis (normalna flora ljudske kože) i S. aureus klinički su važniji za ljude. S. aureus normalno postoje ili kao rezidentni ili prolazni mikroorganizmi na ljudskoj koži.

KLIKNITE OVDJE DA KUPITE UDŽBENIK ZA BAKTERIOLOGIJU

U mikrobiološkoj laboratoriji, S. aureus može se lako izolirati uzimanjem uzoraka iz nosa i kože dobrovoljaca i uzgojem istih na podlozi za rast/bakteriološke kulture koja podržava njihov rast. Važno je napomenuti da dobar postotak zdravih osoba nosi S. aureus u nosu, a te osobe mogu biti zarazne na osjetljive domaćine prenošenjem mikroba rukama (nakon branja nosa) ili tjelesnim kontaktima. S. aureus uzrokuju gastroenteritis, a mogu i kolonizirati žensku vaginu, posebno tijekom menstruacije, da izazovu infekciju. Dakle, većina infekcija od S. aureus nastaju zbog loše lične higijene i higijene okoliša. S. aureus uzrokuje razne infekcije/bolesti kod ljudi, uključujući apscese, infekcije rana, gastroenteritis, bolest toksina toksičnog sindroma toksičnog šoka (TSST), upalu pluća, opekline i septikemiju. S. aureus proizvodi niz enzima i toksina koji pomažu u njegovoj patogenosti ili toku bolesti. S. aureus uglavnom je uključen u ljudske piogene infekcije poput čireva, prištića, impetiga i pustula.

PATOGENEZA OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS INFEKCIJA

S. aureus je ozloglašen po tome što uzrokuje razne invazivne i mješovite infekcije kod ljudi, uključujući infekcije koje stvaraju gnoj, trovanje hranom (gastroenteritis) koje karakterizira povraćanje, infekcije kože i bolesti povezane s krvlju. Infekcije urinarnog trakta (UTI), pneumonija, mastitis, endokarditis, meningitis i osteomijelitis su neke od ozbiljnih infekcija ili bolesti kod kojih S. aureus upleten je kao uzročnik. S. aureus također je među uzročnicima uključenim u većinu bolničkih infekcija, posebno u postoperativne infekcije rana. Otporan na meticilin stečen u zajednici S. aureus (CA-MRSA) i otporan na bolnički meticilin S. aureus (HA-MRSA) su druge važne infekcije uzrokovane otpornim sojevima patogena S. aureus.Zanimljivo je da su samo patogeni S. aureus sojevi su invazivne prirode, kao i organizmi koji proizvode hemolitiku i koagulazu. Oni su u velikoj mjeri odgovorni za mnoštvo infekcija uzrokovanih Staphylococcus vrste.

Nepatogeno Staphylococcus vrste kao npr S. epidermidis su neinvazivne, nehemolitičke i ne proizvode enzime koagulaze. Invazivnost S. aureus, kao i njihova virulentnost i patogenost zasniva se na sposobnosti patogena da proizvodi razne toksine i ekstracelularne enzime koji određuju tok infekcije. Ovi toksini i enzimi koje proizvodi mikrob pomažu u povećanju težine infekcije tijekom S. aureus invazija. Općenito, virulentnost i/ili patogenost patogena S. aureus uvelike ovise o invazivnosti invazivnog soja i zajedničkom ili kooperativnom djelovanju toksina i izvanstaničnih enzima koje proizvode. Dakle, patogeneza S. aureus će se ovdje proširiti na osnovu faktora virulencije (tj. enzima i toksina) koje oni proizvode. Toksini koje proizvodi S. aureus su takođe razjašnjeni u ovom odeljku.

  • EXFOLIATIN: Eksfolijatin ili eksfolijativni toksini (ET) su proteinski toksini koje proizvodi Staphylococcus aureus sojeva koji uzrokuju sindrom stafilokokne opečene kože (SSSS) kod ljudi. Poznate su dvije serološke vrste eksfolijativnih toksina, a to su ETA (hromozomski posredovani toksin) i ETB (plazmidno posredovani toksin). ETA je stabilan na toplinu, dok je ETB toplotno labilan toksin i oba toksina pokazuju aktivnost esteraze i proteaze koje utječu na integritet kože. SSSS je stafilokokna bolest uzrokovana plazmidom posredovanim toksinom (ETB) koji proizvodi S. aureus a klinički se doživljava kao deskvamacija gornjeg sloja kože. Kod SSSS obično dolazi do velikog gubitka epiderme (stanje poznato kao epidermoliza), a to otkriva crveno područje ispod površine kože. SSSS se obično javlja kod novorođenčadi i male djece mlađe od 5 godina, a bolest se može pojaviti i kod majmuna i miševa, ali ne i kod štakora. Eksfoliatinski toksini su superantigeni, a poznati su i kao epidermolitički toksini zbog svoje sposobnosti da uzrokuju opsežno ljuštenje ljudske kože (tj. Gubitak epidermisa kože). Ovi toksini su također uključeni u izazivanje stafilokokne impetigo bolesti kod ljudi.
  • SINDROM TOKSIČNOG UDARA TOKSIN-1 (TSST-1): Sindrom toksičnog šoka toksin-1 (TSST-1) je druga klasa superantigena koju proizvodi S. aureusi uzrokuje bolest sindroma toksičnog šoka kod ljudi. U bolest sindroma toksičnog šoka, dolazi do dubokog oslobađanja stafilokoknih superantigena u krvotok inficiranih pojedinaca, što dovodi do toksemije. Toksemija je zdravstveno stanje u kojem postoji velika količina toksina u krvi. Pacijenti koji pate od sindroma toksičnog šoka obično imaju deskvamaciju kože (Slika 1), a to može napredovati po cijelom tijelu baš kao u slučajevima SSSS. Bolest sindroma toksičnog šoka je smrtonosna i teška bolest koju klinički karakteriziraju rašireni deskvamirani osip na koži, povraćanje, bolovi u mišićima, visoka temperatura i proljev, kao i ozljeda bubrega i jetre u nekim kompliciranim slučajevima. Mala djeca i žene koje koriste određene vrste tampona tijekom menstruacije uglavnom su pogođene ovom bolešću. Bolest sindroma toksičnog šoka može se pojaviti i kod žena koje nemaju menstruaciju i muškaraca koji mogu imati druge infekcije, poput infekcija rana. Konkretno, TSST-1 stimulira masovnu proizvodnju citokina (npr. Interleukina, faktora tumorske nekroze i interferona) bez dostupnosti bilo kojeg prerađenog antigena za napad, a to rezultira toksičnim šokom zbog toksemije. Ljudi bez odgovarajućeg neutralizirajućeg antitijela protiv TSST-1 imaju recidiv sindroma toksičnog šoka zbog masivne proizvodnje citokina koji zapaljuje TSST-1 kod inficiranih osoba.
Slika 1. Deskvamacija dlana i palca (strelice) zbog sindroma toksičnog šoka toksin-1 (TSST-1) stafilokokne bolesti. CDC
  • ENTEROTOKSINI: Enterotoksini su superantigeni koje proizvode patogeni S. aureus sojeva koji uzrokuju toksikoze, vrsta trovanja hranom kod ljudi. Enterotoksini iz S. aureus su označeni kao proteini A, B, C, D i E. Ove klase toksina su poznate po tome što stimulišu masivnu proizvodnju citokina koji uzrokuju stafilokokno trovanje hranom kod ljudi koji konzumiraju S. aureus kontaminirana hrana. Proizvedeni ili preformirani u hrani, stafilokokni enterotoksini su posredovani plazmidima i kromosomno posredovani, a neki se prenose putem faga (npr. Enterotoksin A). Stafilokokni enterotoksini također se mogu stvarati patogenim S. aureus u crevnom traktu zaraženih ljudi. Enterotoksini patogeni S. aureus su genetski povezani sa TSST-1, i oba dijele mnoge karakteristike zajedno. Međutim, enterotoksini su stabilniji na toplinu i otporniji su na enzime u probavnom traktu oboljelih ljudi od TSST-1. Stafilokokno trovanje hranom obično karakterizira nekrvna proljev, grčevi u trbuhu i povraćanje (klinički poznato i kao emesis). Enterotoksini poput TSST-1 stimuliraju masivnu proizvodnju citokina koji aktiviraju centar za povraćanje u mozgu, a to uzrokuje gastroenteritis.
  • STAFILOKOKALNI ALFA (α) TOKSIN: Stafilokokni alfa (α) toksini su citolitički toksini koje proizvode patogeni S. aureus, i koji ima ubijajući učinak na stanične membrane eukariotskih stanica. Oni su najsnažniji hemolizini koji oštećuju membrane koje proizvode S. aureus. Ovi toksini u osnovi djeluju na širok spektar staničnih membrana gdje uzrokuju hemolizu i nekrozu. Alfa toksini uzrokuju lizu stvaranjem malih pora ili rupa u staničnim membranama stanica (na primjer, eritrociti), što dovodi do masovnog gubitka ćelijskog materijala iz oštećenih stanica.
  • STAFILOKOKNI BETA (β) TOKSINI: Stafilokokni beta (β) toksini manje su citotoksični od α toksina, ali također napadaju eritrocitne ćelije i neke živčane stanice (npr. Sfingomijelin). Beta toksini imaju visok afinitet za ćelije bogate lipidima gdje uzrokuju hemolizu.
  • STAFILOKOKALNA GAMA (γ) TOKSIN: Oboje proizvode stafilokokne gama (γ) toksine S. aureus i S. epidermidis. Gama toksini narušavaju integritet staničnih membrana poput ostalih hemolizina koje proizvode S. aureus.
  • LEUKOCIDIN: Leukocidin je toksin koji oštećuje ćelijsku membranu i proizvode ga patogeni sojevi S. aureus. Oni specifično ubijaju leukocite stvaranjem malih pora ili rupa koje povećavaju gubitak materijala iz oštećene ćelije, čime inhibiraju proces fagocitoze u inficiranom ljudskom domaćinu. Panton-valentinski (P-V) leukocidin, kako ih često nazivaju, hemolitičke je prirode i uglavnom je uključen u većinu rezistentnih Staphylococcus aureus infekcije (npr. otporne na meticilin) Staphylococcus aureus, MRSA).

VANSTANIČNI ENZIMI KOJE PROIZVODI S. AUREUS

    Povećava preživljavanje patogena u fagocitima kroz proizvodnju enzima, katalaze. Proizvodnja katalaze koristi se za biokemijsku identifikaciju S. aureus u laboratoriji, a pretvara vodikov peroksid (H2O2) vodi i kisiku čime se ziduje ili štiti zaraženo tijelo od fagocitnih stanica.
  1. proteaze: Proteaze ili proteinaze su izvanćelijski enzimi koje proizvode patogeni S. aureus, i koji pomažu patogenu u razgradnji molekula proteina.
  2. Nukleaza: Nukleaza je enzim koji proizvodi patogen S. aureus, i koji razbija nukleinske kiseline inficiranih ćelija u ljudskom domaćinu. Enzimi DNaze proizvedeni patogenim S. aureus obavljaju sličnu funkciju s nukleazama po tome što uništavaju DNK stanice domaćina.
  3. Beta-laktamaza: Beta laktamaza je enzim koji proizvodi patogen S. aureusi klinički su značajni po tome što ova klasa enzima daje patogenu sposobnost razvijanja rezistencije na niz sintetičkih antibiotika i drugih antimikrobnih sredstava. Patogene enzime beta laktamaze S. aureus degradiraju beta-laktamske antibiotike kao što su penicilini.
  4. Lipaza: Lipaze su enzimi koji uništavaju masti ili lipide koje proizvodi patogen S. aureus. Proizvodnja ovog enzima je patogena S. aureus sojevi inhibiraju proces fagocitoze u zahvaćenim stanicama domaćina. Enzimi koagulaze pretvaraju fibrinogen u fibrinski ugrušak koji okružuje i štiti zaražena mjesta od djelovanja fagocita. Proizvodnja koagulaze (faktora zgrušavanja krvi) koristi se za identifikaciju patogena S. aureus u kliničkoj mikrobiološkoj laboratoriji.
  5. Stafilokinaza: Stafilokinaza je ekstracelularni enzim koji proizvodi patogen S. aureusi aktivator je plazminogena (tj. enzim stimulira proteolitičku aktivnost sličnu plazminu koja lizira fibrin). Streptokinaza može pomoći u širenju patogena unutar domaćina zbog svoje sposobnosti da razgradi fibrinske ugruške.
  6. hijaluronidaza: Hijaluronidaza je enzim koji razgrađuje hijaluronsku kiselinu koja čini vezivno tkivo domaćina. Hijaluronska kiselina definira se kao tkivni cement. Sposobnost patogena S. aureus za proizvodnju hijaluronidaze potiče širenje patogena u tkivima domaćina.
  7. Protein A: Protein A se nalazi u ćelijskom zidu većine S. aureus sojeva, te sprječavaju aktivaciju komplementa u ćeliji domaćinu. Protein A je antifagocitne prirode i veže se na kristalizirajući fragment (Fc dio) molekula antitijela (npr., IgG) i na taj način sprječava fagocitozu i opsonizaciju. Na ovaj način, protein A (poznat i kao površinski stafilokokni protein) doprinosi virulenciji patogena S. aureus.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA STAFILOKOKUS AUREUS INFEKCIJA Laboratorijska dijagnoza stafilokokne bolesti zasniva se uglavnom na izolaciji i identifikaciji invazivnog patogena mikroskopom i kultivacijom. Serološki i biokemijski testovi (npr. Testovi katalaze, DNaze i koagulaze) također se koriste za tipiziranje soja S. aureus umiješan u proces bolesti – od S. aureus je također član normalne flore ljudskog tijela. Krv, cerebrospinalna tekućina, ispljuvak, dušnički aspirat, gnoj i površinski uzorci brisa sa zaraženih mjesta (npr. Rana i opekotina) primjeri su kliničkih uzoraka prikupljenih za laboratorijska ispitivanja. Bojanje po Gramu otkriva gram-pozitivne koke grožđa u grozdovima, tetradama ili parovima pod mikroskopom. Manitolni solni agar (MSA) je selektivni medij (koji sadrži NaCl koji inhibira drugu normalnu floru i nestafilokokne organizme) koji se koristi za provjeru S. aureus i oporaviti patogen iz kliničkih uzoraka koji su rezultat miješane bakterijske/mikrobne infekcije. S. aureus proizvodi nekoliko vrsta hemolize, uključujući beta-hemolizu, alfa-hemolizu i gama-hemolizu na krvnom agaru (Slika 2). S. aureus također se može uzgajati i uspješno izolirati na krvnom agaru – gdje proizvodi bijele ili blijede hemolitičke kolonije (Slika 3). Raste i na čokoladnom agaru i MacConkey agaru. S. aureus rastu aerobno na 35-37 o C.

Slika 2. Pločica za uzgoj krvi prikazuje različite vrste hemolize proizvedene patogenom S. aureus na pločicama za kulturu obogaćene krvlju.Fotografija ljubaznošću: https://www.microbiologyclass.com Slika 3. Colonies of S. aureus (strelice) na ploči s krvnim agarom. S. aureus proizvodi male blijede kolonije na krvnom agaru. Fotografija ljubaznošću: https://www.microbiologyclass.com

IMUNITET NA STAFILOKOKUS AUREUS INFEKCIJA

Odbrana domaćina od stafilokoknih bolesti ili infekcija temelji se na djelovanju fagocitnih stanica protiv napadajućih patogena. Iako fagocitoza igra aktivnu ulogu u inhibiranju progresije infekcije, patogena S. aureus genijalan je u proizvodnji toksina i izvanstaničnih enzima koji remete tijek djelovanja fagocita. Kod domaćina se ne razvija aktivni imunitet protiv futurističke stafilokokne infekcije nakon prethodnih patogenih infekcija S. aureus.

TRETMAN OF STAFILOKOKUS AUREUS INFEKCIJA

Terapija stafilokokne bolesti temelji se na primjeni određene klase antibiotika na koje je patogen podložan. Sve izolovano Staphylococcus vrste treba podvrgnuti testiranju osjetljivosti na antimikrobne lijekove kako bi se odredilo liječenje. Iako patogena S. aureus otporan je na neke poznate snažne antibiotike, cefalosporini, vankomicin, meticilin, oksacilin i penicilini su neki od lijekova izbora koji se koriste za liječenje stafilokokne bolesti ili infekcija. Ipak, sojevi S. aureus otporni na meticilin, penicilin i vankomicin sada postoje i u zajednici iu bolničkom okruženju. Drenaža tečnosti ili gnoja u apscesu uzrokovanom S. aureus mogu se koristiti u liječenju gnojnih infekcija posredovanih uzročnikom. Stafilokokno trovanje hranom treba liječiti zamjenom tekućine i elektrolita primjenom odgovarajuće količine otopine soli-šećera (SSS) oboljelim pacijentima jer bolest obično dovodi do značajnog gubitka tekućine iz tijela.

SPREČAVANJE I KONTROLA STAFILOKOKUS AUREUS INFEKCIJA

Staphylococcus vrste su uobičajeni stanovnici ljudskog tijela, posebno nosa ili nosa i kože gdje se nalaze kao normalna mikroflora. Većina pojedinaca koji nose patogene S. aureus su asimptomatski i prenose patogen na osjetljive domaćine oko sebe. Kontrola i prevencija stafilokoknih infekcija u bolničkom okruženju treba se temeljiti na praksi odgovarajućih mjera kontrole bolničke infekcije. Trenutno ne postoji vakcina za prevenciju stafilokoknih bolesti ili infekcija, tako da je od vitalnog značaja za pojedince i bolničke ustanove da održavaju i upijaju lične higijenske prakse i prakse životne sredine kao što su pranje ruku i pravilna dezinfekcija površina. Doktori, medicinske sestre i drugo zdravstveno osoblje treba da održavaju aseptičnu tehniku ​​dok obavljaju svoj posao, posebno oko odjeljenja za novorođenčad i operacionih sala kako bi se izbjeglo širenje infekcija uzrokovanih patogenim S, aureus u bolničkom okruženju. Rane i opekotine također treba pravilno obući i dezinficirati antisepticima. Uklanjanje superupijajućih tampona iz opće cirkulacije pomoglo je u smanjenju incidencije sindroma toksičnog šoka kod žena s menstruacijom. Kontaminiranu hranu treba izbjegavati, a osobe koje rukuju hranom uvijek trebaju poštivati ​​odgovarajuću higijenu pri rukovanju, preradi, pripremi i distribuciji hrane kako bi se izbjeglo izbijanje trovanja hranom zbog Staphylococcus aureus.

DRUGE VRSTE OF STAPHYLOCOCCI

  • S. saprophyticus čest je uzrok infekcije urinarnog trakta stečene u zajednici. Vodeći je uzročnik cistitisa kod mladih žena i odmah je iza njega E. coli kao najčešći uzročnik nekomplikovane UTI kod žena. Nalazi se kao normalna flora u ženskom genitalnom traktu i perineumu. S. saprophyticus nalazi se i u povrću i okolišu, kao i u gastrointestinalnom traktu životinja.
  • S. epidermidis dio je ljudske normalne flore, a u izobilju se nalazi na koži. Nije patogene prirode, ali može uzrokovati infekciju kod imunokompromitiranih pacijenata. S. epidermidis je oportunistička bakterija koja zahtijeva kršenje urođene obrane domaćina da izazove infekciju.
  • S. saccharolyticus uzrokuje infektivni endokarditis i poznato je da kontaminira uzorke trombocita uzete od ljudi.
  • S. lugdunensis čest je uzrok infekcija kože i mekih tkiva u zajednici. Javlja se kao normalna flora na ljudskoj koži, ali je zabilježena kao uzrok ozbiljnih ljudskih infekcija uključujući osteomijelitis, artritis, septikemiju, infekcije rana i agresivni endokarditis.
  • S. warneri nalazi se na koži ljudi i životinja kao normalna flora. Rijetko uzrokuje bolesti kod ljudi, ali povremeno može uzrokovati infekciju kod pacijenata čiji je imunološki sustav oslabljen.
  • S. intermedius izolovan je iz prednjih nosnih vrata golubova, pasa, minka i konja. Dio je normalne flore u usnoj šupljini, gornjim respiratornim traktima, urogenitalnom traktu žena i gastrointestinalnom traktu, a može se naći i u ljudskim oblicima. S. intermedius je oportunistički organizam koji može izazvati infekciju kod ugroženih ljudskih domaćina.
  • S. capitis je koagulazno negativna vrsta Staphylococcus. Dio je normalne flore kože ljudskog vlasišta, lica, vrata i ušiju i povezan je s endokarditisom protetskih zalistaka.
  • S. caprae je uključen u infekcije krvotoka, urinarnog trakta, kostiju i zglobova. Prvobitno je izoliran od koza, ali je također izoliran i iz ljudskih uzoraka.
  • S. haemolyticus je oportunistički organizam koji se obilno nalazi u aksilama, perineumu i ingvinalnim regijama kao normalna flora, a također naseljava primate i druge domaće životinje.

Dalje čitanje

Brooks G.F., Butel J.S i Morse S.A (2004). Medicinska mikrobiologija, 23. izdanje. McGraw Hill Publishers. SAD.

Gilligan P.H, Shapiro D.S i Miller M.B (2014). Slučajevi u medicinskoj mikrobiologiji i zaraznim bolestima. Treće izdanje. Američko društvo za mikrobiološku štampu, SAD.

Madigan M.T., Martinko J.M., Dunlap P.V i Clark D.P (2009). Brock Biology of Microorganisms, 12. izdanje. Pearson Benjamin Cummings Inc, SAD.

Mahon C. R, Lehman DC i Manuselis G (2011). Udžbenik dijagnostičke mikrobiologije. Četvrto izdanje. Saunders Publishers, SAD.

Patrick R. Murray, Ellen Jo Baron, James H. Jorgensen, Marie Louise Landry, Michael A. Pfaller (2007). Priručnik za kliničku mikrobiologiju, 9. izd .: Američko društvo za mikrobiologiju.

Wilson B.A, Salyers A.A, Whitt D.D i Winkler M.E (2011). Bakterijska patogeneza: molekularni pristup. Treće izdanje. Američko društvo za mikrobiološku štampu, SAD.

Woods GL i Washington JA (1995). Kliničar i mikrobiološka laboratorija. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (ur.): Principi i praksa infektivnih bolesti. 4th ed. Churchill Livingstone, New York.


Staphylococcus aureus - Biologija

Označene riječi: Staphylococcus aureus, Staphylococcus, staph, staphylococcal, S. aureus, MRSA, CA-MRSA, superbug, stafilokokna infekcija, infekcija rane, trovanje hranom, sindrom toksičnog šoka, rezistencija na antibiotike, staph epidermidis, normalna flora, kožne bakterije, bakteriologija , mikrobiologija

Staphylococcus aureus

Kraljevstvo: Bakterije
Tip: Čvrsti
Klasa: Bacili
Redoslijed: Bacillales
Porodica: Staphylococcaceae
Rod: Staphylococcus
Vrsta: S. aureus


Uobičajene reference: Staphylococcus, Staph, MRSA, Superbug

Patogeneza of S. aureus infekcije

Staphylococcus aureus uzrokuje razne gnojne (gnojne) infekcije i toksinoze kod ljudi. Uzrokuje površinske lezije kože kao što su proključa, styes i furuncules ozbiljnije infekcije kao npr upala pluća, mastitis, flebitis, meningitis, i infekcije urinarnog trakta i duboko ukorijenjene infekcije, kao što su osteomijelitis i endokarditis. S. aureus je glavni uzrok bolnička (nozokomijalna) infekcija kirurških rana i infekcija povezanih s medicinskim sredstvima u kojima se nalaze. S. aureus uzroci trovanje hranom oslobađanjem enterotoksina u hranu, i sindrom toksičnog šoka oslobađanjem superantigena u krvotok.

Iako Staph aureus otporan na meticilin (MRSA) koji su ukorijenjeni u bolničkim okruženjima nekoliko decenija, sojevi MRSA nedavno su se pojavili izvan bolnice i postali poznati kao povezan sa zajednicom- MRSA( (CA-MRSA) ili superbug sojeva organizma, koji sada čine većinu stafilokoknih infekcija viđenih u hitnoj pomoći ili klinici.

S. aureus izražava veliki potencijal faktori virulencije: (1) površinski proteini koji potiču kolonizaciju tkiva domaćina (2) invazivi koji potiču širenje bakterija u tkivima (leukocidin, kinaze, hijaluronidaza) (3) površinski faktori koji inhibiraju fagocitni zahvat (kapsula, Protein A) (4) biokemijska svojstva koja povećavaju njihov opstanak u fagocitima (karotenoidi, katalaza proizvodnja) (5) imunološke maske (Protein A, koagulaza) (6) toksini koji oštećuju membrane i koji liziraju eukariotske ćelijske membrane (hemolizini, leukotoksin, leukocidin (7) egzotoksini koji oštećuju tkiva domaćina ili na drugi način izazivaju simptome bolesti (SEA-G, TSST, ET) i (8) inherentno i stečeno otpornost na antimikrobna sredstva.

SLIKA 2. Determinante virulencije za Staphylococcus aureus

Za većinu bolesti uzrokovanih S. aureus, patogeneza je višefaktorska, pa je teško precizno odrediti ulogu bilo kojeg danog faktora. Međutim, postoje korelacije između sojeva izoliranih iz određenih bolesti i izraženosti određenih determinanti virulencije, što upućuje na njihovu ulogu u određenoj bolesti. Primjena molekularne biologije dovela je do napretka u otkrivanju patogeneze stafilokoknih bolesti. Geni koji kodiraju potencijalne faktore virulencije su klonirani i sekvencionirani, a mnogi proteini toksini su pročišćeni. Uz neke stafilokokne toksine, simptomi humane bolesti mogu se reproducirati kod životinja s pročišćenim proteinskim toksinima, dajući razumijevanje njihovog mehanizma djelovanja.

Ljudske stafilokokne infekcije su česte, ali obično ostaju lokalizirane na ulazu putem normalne odbrane domaćina. Portal može biti folikul dlake, ali obično je to lom kože koji može biti minutni ubod iglom ili kirurška rana. Strana tijela, uključujući šavove, lako se koloniziraju stafilokokom, što može otežati kontrolu nad infekcijama. Drugi ulazni portal je respiratorni trakt. Stafilokokna pneumonija česta je komplikacija gripe. The localized host response to staphylococcal infection is inflammation, characterized by an elevated temperature at the site, swelling, the accumulation of pus, and necrosis of tissue. Around the inflamed area, a fibrin clot may form, walling off the bacteria and leukocytes as a characteristic pus-filled boil or abscess. More serious infections of the skin may occur, such as furuncles or impetigo. Localized infection of the bone is called osteomyelitis. Serious consequences of staphylococcal infections occur when the bacteria invade the blood stream. A resulting septicemia may be rapidly fatal a bacteremia may result in seeding other internal abscesses, other skin lesions, or infections in the lung, kidney, heart, skeletal muscle or meninges.

FIGURE 3. Sites of infection and diseases caused by Staphylococcus aureus


Materijali i metode

Cell types used

Fig. 1a (luciferase) Cell type: HEK293T
Fig. 1b (NNGRR(T/V)) Cell type: HEK293
Fig. 1c (SaCas9 vs SpCas9) Cell type: HEK293FT
Fig. 1d (top) (gRNA length — VEGFA) Cell type: HEK293
Fig. 1d (mid) (gRNA length — GFP) Cell type: HEK293-GFP
Fig. 1d (bottom) (gRNA length — CCR5) Cell type: HEK293
Fig. 2b–d (nickases) Cell type: HEK293FT
Fig. 3a–c (AAV transduction) Cell type: HEK293
Fig. 3d–f (AAV transduction) Cell type: HEK293FT
Fig. 4a, b (GUIDE-seq) Cell type: U-2 OS

Cell culture

HEK293, HEK293FT (Life Technologies, catalog #R700-07), HEK293-GFP (GenTarget, catalog #SC001), and U2-OS (ATCC #HTB-96) cells were maintained in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM Life Technologies) supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS), 5 % penicillin/streptomycin, and 2 mM Glutamax. Cells were kept at 37 °C in a 5 % CO2 inkubator.

Plasmid and gRNA construction

The pCMVSau plasmid expressing a human codon optimized SaCas9 and a customizable U6-driven gRNA scaffold have been previously described [18]. Cognate luciferase indicator constructs were generated as previously described [14]. Maps of these plasmids and all other SaCas9 plasmids are shown in Figure S1 in Additional file 1.

gRNA used in Fig. 1a was generated by cloning annealed oligos containing the target sequence into pCMVSau. gRNAs used for data shown in Figs. 1b–d and 2d were generated by PCR and transfected as amplicons containing U6 promoter, spacer sequence, and TRACR scaffold. gRNAs used for data shown in Figs. 2b, c and 4a, b were generated by ligating either one or two of these into a pUC19 backbone vector via Gibson Assembly (New England Biolabs).

AAV vectors used in Fig. 3a–c were constructed by Gibson Assembly of one or two gRNA cassettes into SaCas9-containing AAV backbone pSS3. Vectors used in Fig. 3d–f were constructed by subcloning gRNA cassette pairs from vectors pAF089, pAF091, pAF092 into pSS60. Inverted terminal repeats (ITRs) were confirmed by XmaI digest of the vectors.

Transfections

Cells were seeded at a density of 100,000 cells/well in 24-well plates. After 24 hours, cells were transfected with 250 ng of gRNA plasmid or amplicon and 750 ng of either wild-type Cas9 plasmid, Cas9-D10A nickase plasmid, or Cas9-N580A nickase plasmid. All transfections were performed in duplicate using either Lipofectamine 3000 (Life Technologies) or MirusTransIT-293 reagent (Mirus Bio).

Luciferase analysis

293T cells were seeded at 1.25 × 10 5 cells per well in 12-well plates. Cells were transfected using the calcium phosphate method with 1 μg of the SaCas9/gRNA expression vector, 250 ng of a cognate gRNA firefly luciferase indicator plasmid, and 10 ng of a renilla luciferase internal control plasmid. Transfected cells were harvested 72 hours post-tranfection and lysed in Passive Lysis Buffer (Promega) and then assayed for luciferase activity using a Dual Luciferase Assay Kit (Promega).

GFP analysis

At 3.5 days post-transfection, cells had their media removed and were washed with 500 μl of phosphate-buffered saline (PBS). Next, 200 μl of trypsin was added to the cells and they were incubated at 37 °C with 5 % CO2 for 5 min. Trypsinization was halted by adding 500 μl of complete media to each well. Cells were collected from each well and transferred to eppendorf tubes, spun down at 3000 rpm for 7 min, washed with 1 ml fluorescence-activated cell sorting (FACS) buffer (PBS with 3 % FBS) and spun down again, and finally resuspended in 200 μl FACS buffer. Cells were then analyzed with a BD Accuri C6 flow cytometer.

DNA analysis

DNA was harvested 72 hours post-transfection or post-infection using an Agencourt DNAdvance genomic DNA isolation kit (Beckman) with a 4 hour lysing period, according to the manufacturer’s directions. Genomic DNA was then purified using Agencourt AMPure XP beads (Beckman) as per the manufacturer’s protocol.

For T7E1 assays, locus PCRs were performed to amplify regions of VEGF A, CCR5, i B2M. All reactions were performed with Phusion high-fidelity DNA polymerase (New England Biolabs) with resulting products purified by Agencourt AMPure XP beads (Beckman) according to the manufacturer’s instructions. T7E1 digestion was then performed in NEB Buffer 2 according to manufacturer’s instructions and resulting cleavage products were analyzed on a Qiagen QIAxcel Advanced System (Qiagen).

PCR conditions (Table S3 in Additional file 1).

Locus: VEGF(1) Primers: OME6/OME8 Annealing Temp: 67.5 °C
Locus: VEGF(2) Primers: AF116/AF117 Annealing Temp: 64 °C
Locus: CCR5(1) Primers: AF205/AF208 Annealing Temp: 64 °C
Locus: CCR5(2) Primers: AF209/AF211 Annealing Temp: 64 °C
Locus: B2M Primers: GWED67/68 Annealing Temp: 65 °C

For nickase assays, amplified VEGF A locus fragments were cloned into pCR4-TOPO vector using ZeroBlunt TOPO Cloning Kit (Life Technologies). TOPO reaction products were then transformed in One Shot Top10 chemically competent Escherichia coli ćelije. Cells were plated on carbenicillin LB agar plates and incubated overnight at 37 °C. Plasmid DNA was sequenced by Macrogen Corp. and Genewiz, Inc. using an M13 forward primer.

Viral vector production and titration

HEK293 cells were maintained in DMEM supplemented with 10 % FBS, 100 U/ml penicillin, and 100 U/ml streptomycin on 150-mm petri dishes in 5 % CO2 at 37 °C incubation. HEK293 cells were split 1:3 at 18 hours prior to transfection. AAV2 vectors were packaged with the “triple transfection” method using three plasmids: (1) 60 μg of pHelper (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA, USA) expressing E2A, E4, and VA from adenovirus (2) 50 μg of pRC2 expressing Rep2 i Cap2 from AAV2 (Cell Biolabs, Inc.) and (3) 30 μg of pSS/pAF plasmids with ITRs from wild-type AAV2 and CRISPR components. Mirus TransIT-293 reagent (420 μl Mirus Bio LLC, Madison, WI, USA) was mixed with 14 ml of OptiMEM and incubated at room temperature for 10 min before being added to the mixture of three packaging plasmids. After another 10-min incubation, the transfection mix was evenly distributed to five plates of HEK293 cells. At 70 hours post-transfection, supernatants and HEK293 production cells were collected by pelleting and centrifugation. Cell pellets underwent sonication, CsCl ultracentrifugation, and dialysis with 1× PBS to yield recombinant AAV2 viral particles.

To titrate AAV2 preparations, 10 μl of dialyzed viral vector was incubated in 90 μl of DNaseI solution at 37 °C for 1 hour, followed by serial dilution with ddH2O. Droplets were generated with Bio-Rad QX200 using 70 μl of droplet generation oil and 20 μl of samples including probe, saCas9-1-Probe (5′-6FAM-catcgggattacaagcgtggggtatggg-MGB-NFQ-3′), and primers, OliSS67 (5′-gaactacattctggggctgg-3′) and OliSS68 (5′-acgttggcctccttgaacag-3′). PCR reactions were carried out with 40 μl of droplet mix on a regular thermocycler. Droplets were read with Bio-Rad QX200 system to quantify positive and negative droplets. Viral vector titers were obtained by multiplying ddPCR readouts and dilution factors.

Vector transduction and western blotting

HEK293 cells were plated at a density of 100,000 cells/well in a 24-well plate and transduced with AAV2 vectors packaging U6-driven gRNA and EFS-driven SaCas9 at a multiplicity of infection (MOI) of 10,000 viral genome (vg)/cell. Growth medium was aspirated off the 24-well plate 72 hours post-transduction and cells were lysed with lysis buffer from the Agencourt DNAdvance kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) followed by genomic DNA (gDNA) extraction, locus PCR (VEGF and CCR5 loci), and T7E1 assay to quantify genomic modification.

For western blotting, cells were lysed with 1× RIPA buffer with 1× cOmplete ULTRA protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA) and 1× PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, SUA) at 72 hours post-transduction. Cells were lysed at 4 °C for 15 min and lysates were spun down at 13.3 krpm for 15 min at 4 °C. Supernatants were collected and protein concentrations were quantified using Pierce BCA protein assay kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Total protein (41.7 μg) was subjected to 4–12 % NuPAGE Bis-Tris gel electrophoresis at 150 V for 75 min. Gel transfer was performed using High Molecular Weight program on the Trans-Blot Turbo Transfer System (BioRad, Hercules, CA, USA). After blotting with 5 % milk in 1× PBS-T, western blots were incubated separately with corresponding primary antibodies overnight: (1) mouse-anti-Flag (clone m2, F3165, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) at 1:1000 dilution in 5 % milk in PBS-T, and (2) mouse-anti-alpha tubulin (clone B7, sc-5286, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) at 1:200 dilution in 5 % milk in PBS-T. Blots were washed with PBS-T three times prior to incubation with secondary antibody, goat-anti-mouse IgG-HRP (sc-2005, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), at 1:5000 dilution in 5 % milk in TBS-T at room temperature for 1 hour. After four washes with 1× PBS-T, western blots were developed with Western Lightning Plus-ECL (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) and imaged.

Guide-seq

U-2 OS cells were maintained in DMEM (Life Technologies) supplemented with 10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin. Cells were kept at 37 °C in a 5 % CO2 inkubator. Cells were nucleofected at a density of 200,000/well with 250 ng of gRNA plasmid (pAF015), 500 ng SaCas9 plasmid (pAF003), and 100 pmol dsODN [19] using SE Cell line nucleofection solution and the DN-100 program on a Lonza 4D- nulceofector (V02.16). The nucleofected cells were seeded in 1 ml media in a 24-well plate and media was changed 12 hours post-nucleofection. Cells were grown for 72 hours post-nucleofection and gDNA was harvested using an Agencourt DNAdvance gDNA extraction kit. dsODN integration at the target site was confirmed by restriction fragment length polymorphism assay with NdeI.

gDNA was quantified with the qubit high sensitivity dsDNA assay kit. Roughly 400 ng of gDNA from SpCas9-treated cells and 180 ng of gDNA from SaCas9-treated cells were sheared acoustically via the Covaris m220 instrument to an average length of 500 bp in a total volume of 130 μl 1× TE. The sheared product was concentrated by AMPure (1× ratio) according to the manufacturer's protocol and eluted in 15 μl of 1× TE. One microliter of the product was run on the Agilent Tapestation system using the D1000 tape to confirm appropriate sizing. The remaining 14 μl of the sheared DNA was end-repaired, A-tailed, and adapter ligated. Adapter-ligated product was cleaned via AMPure (0.9×), eluted in 10 μl 1× TE, and split into sense and anti-sense PCR reactions. Post-PCR products were cleaned via AMPure (1.2×) and eluted in 15 μl of 1× TE. A second round of PCR was then conducted to incorporate the P7 illumina adapter and capture bi-directionality of off-target sites based on dsODN incorporated at each site. The final PCR product was cleaned via AMPure (0.7×) and eluted in 30 μl 1× TE. One microliter of each reaction was analyzed via Agilent Tapestation system using the D1000 screen tape and quantified using the qubit high sensitivity dsDNA assay kit. Finally, each reaction was normalized into one library pool and sequenced on the Illumina Miseq according to the manufacturer's protocols.

We analyzed GUIDE-seq data following the method described in Tsai et al. [19]. Reads were aligned to the UCSC hg19 genome assembly using bowtie2 (PMID:22388286). We selected regions passing the bidirectional filter [19] or with reads originating at the presumptive cutting site (three bases away from the PAM).

Supporting data

MiSeq sequence data gathered for the GUIDE-seq experiment (Fig. 4) were deposited in the Sequence Read Archive (SRA) at NCBI with BioProject number PRJNA298919. The SpCas9 sense, antisense, and barcode data can be accessed via accession numbers SRX1341497, SRX1341608, and SRX1341607, respectively. The SaCas9 sense, antisense, and barcode data can be accessed via accession numbers SRX1341609, SRX1341611, and SRX1341610, respectively.


Opcije pristupa

Dobijte puni pristup časopisu za 1 godinu

Sve cijene su NETO cijene.
PDV će biti dodat kasnije pri naplati.
Obračun poreza bit će finaliziran prilikom plaćanja.

Dobijte vremenski ograničen ili potpun pristup članku na ReadCube-u.

Sve cijene su NETO cijene.


The history of MRSA infection goes back to 1961 when it was first described. Since then, the incidence and prevalence of MRSA infection have been increasing dramatically across the United States. Recently, some population studies have hintedਊt reducing HA-MRSA incidences in the United States but at the expense of a growing prevalence of CA-MRSA. The reported incidence of  MRSA infection ranges from 7% to 60%[4][5][6].

The commonly associated risk factors for MRSA infection are prolonged hospitalization, intensive care admission, recent hospitalization, recent antibiotic use, MRSA colonization, invasive procedures, HIV infection, admission to nursing homes, open wounds, hemodialysis, and discharge with long-term central venous access or long-term indwelling urinary catheter. A higher incidence of MRSA infection is also seen among healthcare workers who come in direct contact with patients infected with this organism.

Although advancing age by itself is not consideredਊ risk factor for MRSA infection, age more than 65 years is a significant risk factor for hospitalization. Hence, advancing age is indirectly linked to MRSA acquisition. Living in an area with a high prevalence of CA-MRSA or admission to a hospital withਊ high prevalence of HA-MRSA also is considered a significant risk factor for MRSA colonization[7].


6 CLINICAL IMPLICATIONS AND TREATMENT

6.1 Risk factors for and impact of S. aureus in CF lung disease

Methicillin sensitive S. aureus is one of the earliest bacteria occurring in the first year of life. Due to its ubiquitous nature, and nasal colonization in up to 30% of healthy people, search for risk factors is very difficult. For infants, birth by C-section is one reported factor associated with higher S. aureus kočija. This has not been studied specifically for CF. A study comparing naso-pharyngeal microbiome in CF and non-CF infants during the first 6 months of life, showed differences in microbiome emerge within the first few months, where S. aureus was one of the taxa more dominant in CF. 81 Potential explanations could be the CF specific environment, that is, increased mucus, hypoxia, and inflammation occurring already in early life. More studies have examined risk factors for MRSA using CF Patient Registry data. A summary is provided in Table 2.

Patient related Environment related and other
Pancreatic insufficiency 82 Winter season 53
CF-related diabetes 2 Southern latitude 83, 84
Younger age/higher FEV1 82 PM2.5 concentration in the year prior to birth 85
F508 del homozygote 82 MRSA exposure at work or home 86
Co-infection with P aeruginosa* * Also associated with risk to develop chronic infection.
82, 87
CF center with high MRSA prevalence* * Also associated with risk to develop chronic infection.
87
Increased hospitalizations/year* * Also associated with risk to develop chronic infection.
82, 87, 88
More CF clinic visits 84
Low Socioeconomic status* * Also associated with risk to develop chronic infection.
82, 87
More frequent cultures taken per year* * Also associated with risk to develop chronic infection.
87
  • PM2.5, particulate matter of 2.5 μm.
  • * Also associated with risk to develop chronic infection.

Studies in pediatric CF patients showed increased airway inflammation with MSSA or MRSA 89-91 and lower lung function than those without S. aureus. 92 Therefore S. aureus prophylaxis is recommended in the first few years of life for all children with CF in several countries (eg, Australia, UK, Germany) and treatment of incident S. aureus is recommended whenever recovered. 93 This contrasts with the US guidelines of treating S. aureus (MSSA) only during exacerbations. 94 Although no specific guidelines exist for MRSA, many physicians treat MRSA aggressively.

Although in vitro studies on virulence factors do not necessarily explain the differences in clinical outcomes with MSSA versus MRSA infection, several epidemiologic studies showed worse outcomes with MRSA compared to MSSA, 95, 96 and reviewed by Zemanick and Hoffman. 91 The causative role of MRSA, that is, does lung function decline after acquisition of MRSA, showed different results depending on study population and the definitions of MRSA infection that were used. Sawicki et al found that subjects with subsequent acquisition of MRSA had faster FEV1 decline before and after incident MRSA than subjects who remained MRSA free. 88 This study included any incident MRSA case and excluded FEV1 obtained 90 days before and after the incident culture. In contrast, Dasenbrook et al using only persistent MRSA (≥3 positive cultures) found a faster rate of FEV1 decline after incident MRSA compared to before MRSA or those remaining MRSA free. 82 Such findings suggest that outcomes differ between chronic compared to intermittent MRSA infection.

6.2 Eradication of MRSA in people with CF

Attempts to eradicate MRSA early in the course of infection may be warranted to avoid or delay chronic infection. Several CF centers have reported successful eradication of MRSA using a variety of regimens yet only two randomized controlled trials have been conducted one in the United States 97 and one in Italy. 98 Both trials used nasal mupirocin for 5 days and trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMX) in combination with rifampin. Differences between the trials were duration of oral antibiotics of 14 days in the United States compared to 21 days in the Italian trial and additional skin and surface decontamination in the US trial. The US trial showed significantly lower MRSA positivity in the treated compared to the observational arm at day 28 (primary endpoint): 26% versus 82%, P & lt 0,001. In contrast the Italian study, examining chronic MRSA negativity, that is, three negative cultures after 6 months, showed trends toward lower MRSA positivity with treatment however, this did not reach significance. Jointly these data indicate that early MRSA eradication is possible but duration and exact treatment regimen need to be defined.

The most frequently used antibiotics in non-randomized trials include fusidic acid (not licensed in the United States) and TMP-SMX mostly in combination with rifampin. More aggressive approaches using either a step-wise protocol to include an IV antibiotic if oral fusidic acid failed 99 or an a priori course of 3-week IV antibiotics followed by 6 weeks dual oral antibiotics based on susceptibility and inhaled vancomycin 100 have also been reported.

Two case series also reported eradication success of chronic MRSA infection using a 6 month therapy with fusidic acid and rifampin. 101, 102 A more recent trial in the United States compared dual oral antibiotics (rifampin with either TMP-SMX or minocycline) with versus without addition of inhaled vancomycin for 28 days [ClinicalTrials.gov NCT01594827]. Twenty-nine subjects were enrolled and results are pending publication.

A novel, dry powder formulation of inhaled vancomycin is being developed for chronic MRSA infections in CF. The phase 2 trial showed a significant reduction in CFU/g sputum, that is, the primary endpoint. A placebo controlled phase 3 study evaluating FEV1 and exacerbation frequency in subjects >6 years is under way [ClinicalTrials.gov NCT03181932].


Staphylococcus: From Harmless Skin Bacteria to Deadly Pathogen

An international research team, led by scientists from Tübingen and the German Center for Infection Research (DZIF) discovers additional component in staphylococcal cell wall that turns the bacterium potentially deadly.

Bakterija Staphylococcus epidermidisis primarily a harmless microbe found on the skin and in the noses of humans. Yet some strains of this species can cause infections – in catheters, artificial joints, heart valves, and in the bloodstream – which are difficult to treat. These bacteria are often resistant to a particularly effective antibiotic, methicillin, and are among the most feared germs in hospitals. How these usually harmless skin microbes become deadly pathogens has been unclear up to now.

An international research team has now discovered what distinguishes peaceful S. epidermidis microorganisms from the many dangerous invaders. The scientists have identified a new gene cluster that enables the more aggressive bacteria to produce additional structures in their cell walls. This morphological alteration allows the staphylococci to attach more easily to human cells forming the blood vessels, a process via which they can persist in the bloodstream to become pathogens. These new cell wall structures may also allow the spread of methicillin resistance, by transferring it, for example, from Staphylococcus epidermidis to its more dangerous relative Staphylococcus aureus.

The study was carried out under the direction of researchers of the Cluster of Excellence “Controlling Microbes to Fight Infections” (CMFI) of the University of Tübingen and the German Center for Infection Research (DZIF) in cooperation with universities in Copenhagen, Hamburg, Shanghai and Hanover as well as the German Center for Lung Research (DZL) in Borstel. The results are being published in the journal Nature Microbiology.

Set apart by structure

A considerable portion of the cell walls of Staphylococci – like other gram-positive bacteria – is made up of teichoic acids. Chain-like, these polymers cover the bacterial surface. Their chemical structures vary according to species.

“During our examination we determined that many pathogenic strains of S. epidermidis have an additional gene cluster that contains information for the synthesis of wall teichoic acids that are actually typical of S. aureus,” says researcher Dr. Xin Du of the Cluster of Excellence of the CMFI and DZIF. She adds that experiments have shown S. epidermidis bacteria with only species-specific teichoic acids in their walls are not very invasive, colonizing the surfaces of the skin and mucous membranes. If the wall teichoic acids for S. aureus are also present, Xin Du explains, they are unable to attach effectively to those surfaces. Instead, they are more successful in penetrating the tissues of their human host.

“At some point, a few S. epidermidis clones took on the corresponding genes from S. aureus and became threatening pathogens as a result,” says Professor Andreas Peschel of the Cluster of Excellence CMFI and of the DZIF.

It’s long been known that bacteria can share genetic material through gene transfer. Bacteriophages – viruses that infect bacteria – carry out the transfer. Mostly, this takes place within one species and requires similar surface structures to which the bacteriophages bind.

“Differing cell wall structures normally prevent gene transfer between S. epidermidis i S. aureus. Ali u S. epidermidis strains that can also produce the wall teichoic acids of S. aureus, that type of gene transfer suddenly becomes possible between different species,” explains Peschel. That would explain, he continues, how S. epidermidis could transfer methicillin resistance to even more threatening – and then methicillin-resistant – S. aureus, adding that more investigation is still needed.

The new findings are an important step, says Peschel, towards developing better treatments or vaccinations against dangerous pathogens such as S. epidermidis ST 23, which has been known for fifteen years and belongs to the group of HA-MRSE (healthcare-associated methicillin-resistant S. epidermidis).

Reference: “Staphylococcus epidermidis clones express Staphylococcus aureus-type wall teichoic acid to shift from a commensal to pathogen lifestyle” by Xin Du, Jesper Larsen, Min Li, Axel Walter, Christoph Slavetinsky, Anna Both, Patricia M. Sanchez Carballo, Marc Stegger, Esther Lehmann, Yao Liu, Junlan Liu, Jessica Slavetinsky, Katarzyna A. Duda, Bernhard Krismer, Simon Heilbronner, Christopher Weidenmaier, Christoph Mayer, Holger Rohde, Volker Winstel and Andreas Peschel, 24 May 2021, Nature Microbiology.
DOI: 10.1038/s41564-021-00913-z