Informacije

12.5: BCL-2 - Biologija

12.5: BCL-2 - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

BCL-2 je humani protoonkogen koji se nalazi na 18. kromosomu. Njegov proizvod je integralni membranski protein (zvan Bcl-2) koji se nalazi u membranama endoplazmatskog retikuluma (ER), nuklearnoj ovojnici i u vanjskim membranama mitohondrija. Gen je otkriven kao translocirani lokus u a B-cell leukemija (otuda i naziv). Ova translokacija se također nalazi u nekim B-ćelijskim limfomima.

U kancerogenim B ćelijama, dio hromozoma 18 koji sadrži BCL-2 lokus je prošao recipročnu translokaciju s dijelom hromozoma 14 koji sadrži lokus teškog lanca antitijela. Ova t(14;18) translokacija postavlja BCL-2 gen blizu pojačivača gena teškog lanca. Ovaj pojačivač je vrlo aktivan u B stanicama (čiji je zadatak sintetizirati velike količine antitijela). Stoga ne čudi otkriće da se protein Bcl-2 eksprimira na visokim nivoima u tim t (14; 18) ćelijama.

Šta čini BCL-2 protoonkogen?

B ćelije, kao i svi aktivirani limfociti, umiru nekoliko dana nakon što su imali priliku da obave svoj posao. Time se osigurava da se neće zadržati nakon što se riješi prijetnja i okrenu svoj napad na samokomponente. Starenje B ćelija se ubija apoptoza. Međutim, visoki nivoi proteina Bcl-2 štite ćelije od rane smrti apoptozom. Bcl-2 protein potiskuje apoptozu sprečavanjem aktivacije kaspaza koje provode proces. Stoga se geni koji kodiraju inhibitore apoptoze moraju dodati na listu gena koji mogu djelovati kao onkogeni. U ovom slučaju učinak se ne postiže povećanjem brzine ćelijske proliferacije, već smanjenjem brzine ćelijske smrti.

Iako se t(14:18) translokacija nalazi u limfomima B-ćelija i leukemijama, nešto drugo mora doprinijeti stvaranju raka jer preko 50% nas ima mali broj B-ćelija s tom translokacijom koje nikada ne napreduju u rak. Lokusi gena antitijela su opasna mjesta za nastanjivanje protoonkogena. Translokacija protoonkogena c-myc blizu pojačivača gena teškog lanca antitijela također proizvodi kancerogene B stanice koje rezultiraju Burkittovim limfomom. Translokacija BCL-2 locus je samo jedna od mnogih mutacija koje mogu uzrokovati maligni klon B stanica. Sve nastale leukemije su označene hronična limfocitna leukemija ili CLL.


Origano pokazuje izrazite supresorske učinke na modelu karcinoma dojke

svrha: Postojao je značajan interes za identifikaciju prirodne biljne hrane za razvoj učinkovitih sredstava protiv raka. Tako su procijenjeni antitumorski učinci origana u in vivo i in vitro modelu raka dojke.

Metode: Liofilizirani origano (ORE) davan je u dvije koncentracije od 0,3 i 3 % putem prehrane. Eksperiment je prekinut 14 sedmica nakon primjene kancerogena. Na obdukciji su tumori dojke uklonjeni i pripremljeni za histopatološku i imunohistokemijsku analizu. Štaviše, izvršena je in vitro evaluacija u ćelijama MCF-7.

Rezultati: Niska doza ORE potisnula je učestalost tumora za 55,5 %, učestalost tumora za 44 %i volumen tumora za 44,5 %u usporedbi s kontrolnim životinjama. Analiza tumorskih stanica štakora pokazala je smanjenje ekspresije Ki67, VEGFR-2, CD24 i EpCAM i povećanje ekspresije kaspaze-3 nakon liječenja niskim dozama ORE. Visoka doza ORE je produžila latenciju tumora za 12,5 dana, osim toga, uočeno je smanjenje ekspresije Bcl-2, VEGFR-2, CD24 i EpCAM i povećanje ekspresije kaspaze-3 u ćelijama karcinoma. Histopatološka analiza pokazala je smanjenje omjera karcinoma visokog i niskog stepena u obje liječene grupe. In vitro studije pokazale su da ORE smanjuje preživljavanje i proliferaciju stanica MCF-7. U ORE-tretiranim MCF-7 ćelijama, povećanje ćelija koje eksprimiraju sub-G 0/G 1 Uočen je sadržaj DNA i povećanje postotka aneksin V/PI pozitivnih MCF-7 stanica. In vitro su pronađeni i apopatski putevi ovisni o kaspazi i mogući neovisni o kaspazi. Deaktivacija anti-apoptotičke aktivnosti Bcl-2, smanjenje potencijala mitohondrijske membrane i aktivacija puta mitohondrijske apoptoze primijećeni su u ćelijama MCF-7 tretiranim ORE-om.

Zaključci: Naši rezultati po prvi put pokazuju izrazit tumor-supresivni učinak origana u modelu raka dojke.

Ključne riječi: Angiogeneza Apoptoza Matične ćelije raka ćelija Proliferacija stanica MCF-7 Mancerna karcinogeneza Origano Štakor.


Uloga aktivacije autofagije u ublažavanju neurotoksičnosti alkohola

Bcl-2 Porodični protein

Proteini porodice Bcl-2 su poznati mete izloženosti alkoholu u mozgu (Heaton et al., 2015). Poznati su po regulaciji stanične smrti/preživljavanja. Nedavne studije pokazuju da proteini porodice Bcl-2 igraju dvostruku ulogu u regulaciji autofagije pored svoje uloge u preživljavanju ćelija (Decuypere et al, 2012 Hardwick i Soane, 2013). Antiapoptotični proteini iz porodice Bcl-2, poput Bcl-2, Bcl-xL i Mcl-1, mogu potisnuti autofagiju direktnim vezivanjem za Beclin1. Čini se da samo Bcl-2 protein koji se nalazi u ER-u potiskuje autofagiju (Pattingre et al., 2005. Chang et al., 2010.). Osim vezanja s Beclin1, Bcl-2 i Bcl-xL mogu također negativno regulirati autofagni odgovor kontroliranjem homeostaze kalcija ER koja igra važnu ulogu u pokretanju autofagije (Brady et al., 2007 Høyer-Hansen et al. , 2007.). Za razliku od antiapoptotičnih proteina porodice Bcl-2, proapoptotični proteini samo za BH3, poput Bnip3, Bnip3L/Nix, Bad, Bik, Noxa, Puma i Bim, općenito induciraju autofagiju vezanjem za Bcl-2 i naknadnim istiskivanjem inhibitorni Bcl-2 iz kompleksa Beclin1. Međutim, uloga proapoptotičkih proteina Bax i Bak u autofagiji je kontroverzna. Zabilježeni su pozitivna i negativna regulacija autofagije od strane Baxa i Baka (Ding et al., 2011).

Pokazano je da etanol modulira protein porodice Bcl-2 u neuronima in vitro i in vivo (Ge et al., 2004 Liu et al., 2009 Heaton et al., 2011, 2015 Ali Shah et al., 2013). Općenito, alkohol smanjuje ekspresiju antiapoptotičkih proteina Bcl-2 porodice, ali povećava ekspresiju antiapoptotičkih proteina, što može aktivirati autofagiju.


Rezultati

Rekombinantni Bcl-2 protein sa C-terminalnom transmembranskom (TM) sekvencom zamijenjenom His6-oznaka (njegova6-Bcl-2ΔTM) je pripremljen. Liposom je napravljen sa lipidima karakterističnim za MOM i analogom lipida koji kelira Ni 2+ koji se vezuje za His6-oznaku na C-terminusu rekombinantnog Bcl-2, čime se stvara Bcl-2 vezan za membranu koji oponaša nativni Bcl-2 vezan za MOM. Liposom je također napunjen fluorescentnom bojom, Cascade Blue (CB, Mr 𢏀,5 kDa) ili CB-označenim dekstranima (Mr 𢏃 ili 10 kDa). Formiranje pora Bcl-2 oslobodilo bi fluorescentne molekule iz liposoma, koji bi bili vezani anti-CB antitijelom izvan liposoma uzrokujući smanjenje (gašenje) CB fluorescencije. Stepen i kinetika gašenja fluorescencije ukazuje na stepen i kinetiku oslobađanja boje iz liposoma, što je u direktnoj korelaciji sa obimom i kinetikom formiranja Bcl-2 pora u membrani.

Direktna korelacija između koncentracije i veličine pora Bcl-2

Koristeći gornji pristup, ispitali smo opseg oslobađanja tri fluorescentne molekule različite veličine različitim koncentracijama Bcl-2 nakon interakcije sa tBid. Kao što je prikazano na slici 1A, značajno oslobađanje 0,5-kDa CB počelo je pri nižoj koncentraciji Bcl-2 (25 nM) od one za 3-kDa CB-dekstrana (50 nM). Oslobađanje 10-kDa CB-dekstrana nije otkriveno čak ni pri najvećoj koncentraciji Bcl-2 (100 nM). Ako pore Bcl-2 tvore samo monomeri, te pore trebaju imati ujednačenu veličinu koja će biti neovisna o koncentraciji Bcl-2. Budući da rezultati pokazuju da veličina pora Bcl-2 pozitivno ovisi o koncentraciji Bcl-2, to sugerira da je oligomerizacija Bcl-2 uključena u formiranje pora, barem onih velikih.

A, stepen oslobađanja 0,5-kDa CB boja (crna traka), 3 (rastegnuta traka) ili 10-kDa (bijela traka) CB-dekstrana iz 12,5 μM Ni 2+ -kelatnog liposoma različitim koncentracijama Hisa6-Bcl-2ΔTM protein u prisustvu ili odsustvu 10 nM tBid određen je obimom gašenja fluorescencije (Bcl-2 ΔTM/㥏Triton) nakon 3 sata inkubacije na pH 7,4. Prikazani podaci su prosjeci iz tri nezavisna eksperimenta sa standardnom devijacijom (SD, traka greške). B, kinetika oslobađanja CB boje i CB -dekstrana iz 12,5 μM Ni 2+ -liposoma za 100 nM His6-Bcl-2 ΔTM i 10 nM tBid pri pH 7,4 mjereni su kontinuiranim praćenjem opsega gašenja fluorescencije tokom 3 sata. Prikazani podaci su prosjeci iz tri nezavisna eksperimenta sa S.D. (trake grešaka). (□) 0,5-kDa CB (●) 3-kDa CB-dekstran (○) 10-kDa CB-dekstran (■) negativna kontrola, 0,5-kDa CB napunjen liposomskim puferom inkubiran .

Inverzna korelacija između kinetike oslobađanja boje od strane Bcl-2 i veličine boje

Da bi se dalje testirao model za formiranje pora Bcl-2, ispitana je kinetika oslobađanja boja različitih veličina. Kao što je prikazano na slici 1B, iako su i 0,5-kDa CB i 3-kDa CB-dekstran otpušteni iz liposoma za 100 nM Bcl-2 nakon interakcije sa tBid, mala boja se oslobađala većom brzinom od velike. Vrijeme za polovinu maksimalnog oslobađanja (t1/2) za CB i CB-dekstran je 𢏃 i 30 min, respektivno. 10-kDa CB-dekstran nije oslobođen čak ni nakon sati inkubacije, što isključuje mogućnost da produženo izlaganje liposoma Bcl-2 i tBid može uzrokovati nespecifično oštećenje membrane. Ako pore Bcl-2 tvore samo monomeri, boje različitih veličina trebaju se otpustiti iz liposoma istom brzinom koja je određena brzinom pretvorbe Bcl-2 iz membranski vezane konformacije u konformaciju pora, a konstantna pri datoj koncentraciji proteina. Nasuprot tome, ako je oligomerizacija uključena u stvaranje pora, brzina oslobađanja male boje trebala bi biti veća od one velike boje jer bi brzina stvaranja malih oligomernih pora trebala biti veća od one velikih oligomernih pora. Stoga gornji kinetički podaci pružaju dodatnu podršku modelu da proteini Bcl-2 tvore pore oligomerizacijom.

Poboljšanje formiranja pora oligomerizacijom Bcl-2

Da bismo utvrdili učinak oligomerizacije Bcl-2 na formiranje pora, koristili smo proteine ​​Bcl-2 u različitim oligomernim stanjima ili različitim oligomerizacijskim potencijama. Tokom čišćenja Njegovog6-Bcl-2ΔTM proteina, uočili smo da je protein eluiran iz Superdex 200 gel filtracijske kolone uglavnom u monomernim i oligomernim frakcijama, što se procjenjuje po njihovoj koeluciji sa standardom proteina od 25 i 200 kDa, respektivno (Slika 2A ). Protein u obje frakcije je �% čist prema SDS-PAGE analizi nakon čega slijedi bojanje Coomassie Blue (slika 2B). Identitet proteina potvrđen je imunoblotingom pomoću antitijela specifičnog za Bcl-2 (slika 2C). Prosječna molarna masa monomernog proteina je 24,540 ± 982 g/mol kako je utvrđeno analizom raspršenja svjetlosti u više uglova (slika 2D), zatvoreno za izračunatu vrijednost za monomerni His6-Bcl-2 ΔTM, 24.795 g/mol, što potvrđuje da je monomerni protein monomerni Bcl-2. Vjerojatno je oligomerni protein Bcl-2 oligomer budući da je eluiran ranije od monomernog proteina iz gel filtracijske kolone. Pročišćeni Bcl-2 monomer i oligomer su prilično stabilni jer su eluirani u odgovarajućoj frakciji nakon druge gel filtracione hromatografije (slika 2E). Ovo nam je pružilo priliku da testiramo koji oblik Bcl-2 proteina je efikasniji u formiranju pora. Kao što je prikazano na slici 2F, i monomerni i oligomerni Bcl-2 proteini su oslobodili istu količinu 3-kDa CB-dekstrana iz liposoma nakon 3-satne inkubacije. Međutim, kinetika oslobađanja boje od strane dva oblika Bcl- je različita. Brzina oslobađanja inducirana oligomernim Bcl-2 mnogo je veća od one monomernog jer t1/2 za prvu je 𢏃.3 min, a drugu � min. Ovi rezultati pokazuju da, iako su i oligomer Bcl-2 i monomer kompetentni za formiranje pora, oligomer je mnogo efikasniji u formiranju pora od monomera, što ukazuje da je oligomerizacija Bcl-2 međukorak tokom stvaranja pora. formiranje reakcije.

A, oligomerizacija His6-Bcl-2ΔTM je ispitan gel filtracionom hromatografijom. A280 je praćen za svaku eluiranu frakciju i iscrtan. Položaji elucije za proteinske standarde označeni su na vrhu grafikona sa odgovarajućim Mr. B, čistoća i monomernih (traka 1) i oligomernih (traka 2) His6Proteini -Bcl-2 ΔTM eluirani iz gornje kolone za gel filtraciju analizirani su pomoću SDS-PAGE i Coomassie bojenja. Mr proteinskih standarda naveden je s lijeve strane gela. C, identitet monomernog (traka 1) i oligomernog (traka 2) His6-Bcl-2 ΔTM proteini su određeni imunoblotingom koristeći Bcl-2-specifična antitijela. D, masa prosječne molarne mase His6-Bcl-2ΔTM monomer eluiran iz kolone za gel filtraciju određen je analizom raspršenja svjetlosti u više uglova. E, stabilnost divljeg tipa His6-Bcl-2 ΔTM oligomer (gornja ploha, ●) i monomer (donja ploha, ■), ili G154A/G155A mutantni monomer (donja ploha, ○) u otopini je testiran ubrizgavanjem odgovarajućih frakcija iz prvu kolonu za gel filtraciju u drugu hromatografiju. F, kinetika oslobađanja 3-kDa CB-dekstrana iz 12,5 μM Ni 2+ -liposoma za 100 nM His6-Bcl-2 ΔTM monomer ili oligomer i 10 nM tBid na pH 7,4 su nadzirani kao gore. Prikazani podaci su prosjeci sa S.D. (trake grešaka) iz tri nezavisna eksperimenta koji su koristili Bcl-2 oligomer (▲), monomer (○) ili proteinski pufer (●).

U prethodnoj studiji generirali smo mutant Bcl-2 u kojem su dva glicinska ostatka na položajima 154 i 155 promijenjena u alanin. Ovaj mutant je pokazao veću aktivnost formiranja pora u liposomima (14). Mjerenjem povećanja anizotropije triptofana ovisno o koncentraciji otkrili smo da mutantni protein ima 6,5 ​​puta veći homo-asocijacijski afinitet od proteina divljeg tipa (Slika 3A). U poređenju sa monomernim proteinom divljeg tipa, monomerni protein mutant (slika 3B) imao je mnogo veći stepen stvaranja pora koje oslobađaju 3-kDa boju nakon 3-satne inkubacije. Osim toga, kinetika formiranja pora bila je mnogo brža sa mutantom, sa t1/2 od � min, što je 3 puta kraće od t1/2 za divlji tip (slika 3B). Ovi podaci dalje podržavaju model da oligomerizacija Bcl-2 proteina olakšava formiranje pora.

A, homo-asocijacija divljeg tipa His6-Bcl-2 ΔTM ili mutant G154A/G155A ispitivan je mjerenjem anizotropije fluorescencije nakon titriranja odgovarajućeg proteina u pufer D. Prikazani podaci su prosjeci tri nezavisne titracije sa S.D. (trake grešaka), i (■) za divlji tip i (●) za mutanta. Kd za vezivanje divljeg tipa ili mutanta je 196 ± 43 ili 30 ± 5 nM, respektivno. B, kinetika oslobađanja 3-kDa CB-dekstrana iz 12,5 μM Ni 2+ -lipozoma je praćena u prisustvu 100 nM monomernog divljeg tipa His6-Bcl-2 ΔTM ili G154A/G155A mutant i 10 nM tBid pri pH 7,4 kao gore. Prikazani podaci su prosjeci sa S.D. (trake grešaka) iz tri nezavisna eksperimenta koristeći divlji tip (○), mutant (●) ili proteinski pufer (□).

Oligomerizacija Bcl-2 u membrani detektirana hemijskim umrežavanjem i gel filtracijskom hromatografijom

Da bi se utvrdilo dolazi li do oligomerizacije Bcl-2 u liposomalnoj membrani, korišten je homobifunkcionalni sulfhidril-reaktivni cross-linker BMH. The His6-Bcl-2ΔTM protein sadrži samo jedan cistein na poziciji 158. Stoga se može stvoriti samo dimer adukt (slika 4A), iako je dio Bcl-2 u oligomernom obliku kao što je prikazano hromatografijom za gel filtraciju (sl. 2A ). Specifičnost BMH reakcije je demonstrirana činjenicom da nije uočen adukt dimera čak ni u prisustvu BMH kada je korišćen cistein-null Bcl-2 mutant (slika 4A).

A, njegovo homo-udruženje6-Bcl-2ΔTM u rastvoru (pH 7,4) detektovan je umrežavanjem sa BMH. Prikazani podaci su reprezentativni Coomassie obojeni SDS-PAGE gel iz tri nezavisna eksperimenta. (●), strelica monomera Bcl-2, umreženi dimer Bcl-2. B, njegovo homo-udruženje6-Bcl-2 ΔTM u liposomskoj membrani je nadziran BMH umrežavanjem nakon što je protein inkubiran s liposomom pri pH 5.0, a protein vezan za membranu pročišćen je centrifugiranjem sa saharozom. Prikazani podaci reprezentativni su iz dva nezavisna eksperimenta. C, oligomerizacija 50 ili 800 nM His6-Bcl-2ΔTM u membrani određen je gel filtracionom hromatografijom nakon inkubacije proteina na pH 7,4 sa 12,5 μM Ni 2+ -lipozoma u odsustvu ili prisustvu 5 nM tBid. Proteini u eluiranim frakcijama analizirani su pomoću SDS-PAGE i imunoblotinga sa Bcl-2-specifičnim antitelom. Položaji elucije standarda proteina označeni su na vrhu grafikona sa Mr. D, oligomerizacija 200 nM Bax u membrani u odsutnosti ili prisutnosti 20 nM tBid određena je na sličan način, osim što je u imunoblotingu korišteno Bax-specifično antitijelo.

Protein Bcl-2 inkubiran je s liposomom na pH 5 tijekom 3 sata, za stanje za koje se znalo da potiče stvaranje pora (14). Nakon float-up centrifugiranja gustoće saharoze, sakupljena je gornja frakcija koja sadrži lipozome i podvrgnuta BMH unakrsnom povezivanju. Adukt ovisan o BMH otkriven je kod Mr � kDa, predviđeni Mr dimera His6-Bcl-2 ΔTM (slika 4B). Budući da BMH sadrži dvije maleimidne grupe razmaknute 16 Å linkerom, a molekula Bcl-2 ima dimenzije 50흅휵 (Å) prema NMR strukturi(3), najvjerovatnije je da je produkt umrežavanja tvore dvije molekule Bcl-2 koje su međusobno vezane u membrani. Podaci stoga pokazuju da barem neki Bcl-2 proteini formiraju dimer u membrani pod uvjetom stvaranja pora.

Da bismo odredili oligomerno stanje membranski vezanog Bcl-2 nakon interakcije s tBid, drugog uvjeta pod kojim Bcl-2 formira pore (slika 1), prvo smo izolirali liposome nakon inkubacije s Bcl-2 i/ili tBid pomoću CL- 2B gel filtracijska hromatografija. Proteini vezani za membranu solubilizirani su CHAPS-om, cwitter-jonskim deterdžentom koji ne mijenja oligomerno stanje proteina porodice Bcl-2 (25, 26), a zatim su podvrgnuti Superdex 200 gel filtracionoj hromatografiji. Kao što je prikazano na slici 4C, membranski vezan Bcl-2 je lako detektovan nakon inkubacije sa liposomima u prisustvu tBid. Glavni oblik Bcl-2 je dimer i trimer prema njihovoj koeluciji sa proteinskim standardima od 43 i 67 kDa, respektivno. U nedostatku tBid, samo rezidualni Bcl-2 proteini su otkriveni u ovim frakcijama, što sugerira da je mali dio membranski vezanog Bcl-2 proteina u stanjima dimera i trimera čak iu odsustvu tBid. Interakcija tBid značajno povećava količinu membranski vezanih, dimernih i trimernih Bcl-2 proteina. Zanimljivo veći Bcl-2 oligomeri sa očiglednim Mr više od 67 kDa otkriveno je kada je korištena veća koncentracija Bcl-2. Budući da je veličina pora Bcl-2 izravno povezana s njegovom koncentracijom (slika 1A), ovaj rezultat sugerira da veći oligomeri Bcl-2 tvore veće pore Bcl-2.

U našoj prethodnoj studiji, Bax je također formirao pore u liposomskoj membrani nakon interakcije s tBidom (14). Bax pora veća je od pore Bcl-2, oslobađajući 10-kDa CB-dekstrana. Vjerovatno je pore Bax formiran od većeg oligomera. Zaista, veliki Bax oligomeri su otkriveni u frakcijama membrane korištenjem testa gel filtracije istog kao i za Bcl-2. U prisustvu tBid, Bax oligomeri sa Mr otkriveno je od 67 do 200 kDa i više (slika 4D, donja karta). Za usporedbu, svi Bcl-2 oligomeri su manji od 200 kDa čak i pri koncentraciji 4 puta većoj od Bax (slika 4C). Nije bilo detektovanog Bax -a u membranskoj frakciji u odsustvu tBid (slika 4D, gornja tabela), što je u skladu sa činjenicom da je Bax rastvorljiv protein pre interakcije sa tBid. Uzeti zajedno, ovi rezultati su pokazali da i Bcl-2 i Bax formiraju oligomere u membrani nakon interakcije s tBid, ali je veličina Bcl-2 oligomera manja od Bax oligomera, što je direktno u korelaciji s veličinom njihovih pora.


Porodična biologija BCL-2

Suštinski apoptotički put reguliše porodica BCL-2 i sastoji se od 2 velike grupe proteina: (1) proteini za preživljavanje sa svojim osnivačkim članom BCL-2, 3,4 MCL-1, 9 BCL-xL, 15 B- ćelijski limfom-w (BCL-w), 19 i gen srodan BCL-2 eksprimiran u fetalnoj jetri-1 (BFL-1), 20 od kojih svi inhibiraju smrt stanice i (2) proapoptotičke proteine, koji se mogu dalje podijeliti u (a) proteine ​​samo za BH3: BCL-2–interagirajući medijator ćelijske smrti (BIM), 21 p53-regulirani modulator apoptoze (PUMA BBC2), 22,23 NOXA (protein induciran s forbol-12 miristatom-13-acetatom 1 PMAIP1), 24 BCL-2-povezani promotor smrti (BAD), BH3-interakciona domena (BID), 25 BCL-2-interagirajući ubica (BIK), 26 BCL-2-modificirajući faktor (BMF), 27 Harakiri (HRK ) 28 i (b) BCL-2-povezani X protein (BAX) 29 /BCL-2 homologni antagonist ubica (BOK) 30-slični proteini (uključujući BCL-2-srodni ubica jajnika [BOK]). 31 Svi proteini BCL-2 porodice imaju zajedničke domene BCL-2 homologije (BH) na osnovu sličnosti sekvenci. 32 Proteini slični Prosurvivalu i BAX/BAK-u sadrže 4, odnosno 3 BH domene, dok proteini samo BH3 dijele samo BH3 domenu sa širom porodicom (Slika 1).

Članovi porodice BCL-2 i njihova aktivacija. Porodica proteina BCL-2 sadrži funkcionalno očuvane BH domene i može se podijeliti na prosurvivalne, proapoptotične proteine ​​samo sa BH3 i proapoptotične efektorske proteine. TM, transmembranski.

Članovi porodice BCL-2 i njihova aktivacija. Porodica proteina BCL-2 sadrži funkcionalno očuvane BH domene i može se podijeliti na prosurvivalne, proapoptotične proteine ​​samo sa BH3 i proapoptotične efektorske proteine. TM, transmembranska.

Aktivacija apoptotskog puta

Apoptoza se sastoji od 3 različite faze: (1) inicijacija, (2) predanost i (3) izvršenje. Ovaj proces je induciran stresnim podražajima poput nedostatka hranjivih tvari ili oštećenja DNA (slika 2). Proteini samo BH3 aktiviraju se kao stimulans smrti na vremenski i specifičan za ćelijski tip način, te zamjenjuju/aktiviraju proteine ​​slične BAX/BAK u početnom koraku. 33 Tijekom faze obvezivanja, BAX i BAK tvore homodimere i heterodimere, koji se dalje spajaju na strukture slične porama u vanjskoj membrani mitohondrija i uzrokuju permeabilizaciju vanjske membrane mitohondrija (MOMP). 34-38 To kasnije dovodi do gubitka mitohondrijskog transmembranskog potencijala i oksidativne fosforilacije, te do oslobađanja citokroma C iz mitohondrijskog intermembranskog prostora u citoplazmu. 39 U koraku izvršenja, citokrom C zajedno s APAF-1 i prokaspazom-9 tvore apoptosom, koji posreduje cijepanje prokaspaze-9 do aktivnog oblika kaspaze-9 i posljedično potiče aktivaciju efektorskih kaspaza-3, 6 i 7 , koji induciraju DNaze da cijepaju DNK na fragmente. Važno je napomenuti da se „tačka bez povratka“ generalno javlja na nivou BAX/BAK aktivacije, 37 u kom trenutku ćelija se obavezuje da će proći kroz programiranu ćelijsku smrt. Zbog strukturnih razlika, proteini samo za BH3 imaju različite afinitete za određene proteze koji preživljavaju (slika 3). 40 Neki proteini samo za BH3, kao što su BIM i PUMA, promiskuitetno se vezuju za sve proteine ​​za preživljavanje. 41,42 Ostali proteini samo za BH3 vežu se selektivnije, poput BAD-a, koji veže BCL-2, BCL-xL i BCL-W, i NOXA, koji se veže uglavnom za MCL-1. 40

Suštinski apoptotički put.

Suštinski apoptotički put.

Profil vezivanja proapoptotičnih proteina koji sadrže samo BH3 i efektorske proteine ​​na proteine ​​za preživljavanje i kako su proteini proteina ciljani inhibitorima proteina porodice BCL-2.

Profil vezivanja proapoptotičnih proteina koji sadrže samo BH3 i efektorske proteine ​​na proteine ​​za preživljavanje i kako su proteini proteina ciljani inhibitorima proteina porodice BCL-2.

Predložena su dva glavna oblika indukcije apoptoze. (1) U modelu direktne aktivacije, proteini samo BH3 djeluju ili kao aktivatori (npr. BIM, Bid/tBid, PUMA) ili kao senzibilizatori (npr. BAD, NOXA). Aktivatori se vežu za protere preživljavanja i proteine ​​slične BAX/BAK, što dovodi do integracije u vanjsku membranu mitohondrija. Proteini koji preživljavaju, poput BCL-xL, mogu sekvestrirati proteine ​​samo za BH3 i tako spriječiti aktivaciju BAX-a. Senzibilizatori se direktno vezuju za prosurvival protein i posreduju u oslobađanju aktivatora. (2) Indirektni (pomak) model pretpostavlja da su BAX i BAK konstitutivno aktivni, ali su vezani za proteine ​​preživljavanja kako bi spriječili apoptozu. Proteini koji sadrže samo BH3 istiskuju BAX i BAK nakon stimulusa smrti. Budući da proteini samo za BH3 imaju različite afinitete vezanja za svaki protein koji preživljava, za početak apoptoze potrebna je aktivacija nekoliko proteina samo za BH3 kako bi se zamijenila dovoljna količina BAX i BAK da izazove MOMP. Tijekom posljednjeg desetljeća postalo je očito da ova dva modela vjerojatno koegzistiraju i djeluju na specifičan način, što je dovelo do jedinstvenog modela u kojem proteini za preživljavanje sekvestriraju i proteine ​​samo za BH3, a također aktiviraju BAX i BAK (slika 2). 38 Činjenica da proteini samo za BH3 imaju različite modalitete vezivanja za svaki prosurvivalni protein pruža mogućnost ciljanja proteina za preživljavanje pomoću farmakološki selektivnih inhibitora s velikim terapijskim potencijalom u hematološkim malignitetima. 40


Sadržaj

Utišavanje RNA opisuje nekoliko mehanički povezanih puteva koji su uključeni u kontrolu i regulaciju ekspresije gena. [4] [5] [6] Putevi utišavanja RNA povezani su s regulatornom aktivnošću malih nekodirajućih RNA (dužine otprilike 20-30 nukleotida) koje funkcionišu kao faktori uključeni u inaktivaciju homolognih sekvenci, promovišući aktivnost endonukleaze, translacijsko zaustavljanje, i/ili kromatske ili DNK modifikacije. [7] [8] [9] U kontekstu u kojem je pojava prvi put proučavana, otkriveno je da mala RNK igra važnu ulogu u obrani biljaka od virusa. Na primjer, ove studije su pokazale da enzimi otkrivaju dvolančanu RNK (dsRNA) koji se inače ne nalaze u ćelijama i probavljaju ga u male komadiće koji nisu u stanju da izazovu bolest. [10] [11] [12] [13] [2]

Dok su neke funkcije utišavanja RNK i njene mašinerije shvaćene, mnoge nisu. Na primjer, pokazalo se da je utišavanje RNK važno u regulaciji razvoja i u kontroli događaja transpozicije. [14] Pokazalo se da utišavanje RNK igra ulogu u antivirusnoj zaštiti kod biljaka, kao i kod insekata. [15] Također u kvascu, pokazano je da utišavanje RNA održava heterohromatinsku strukturu. [16] Međutim, raznolika i nijansirana uloga utišavanja RNK u regulaciji ekspresije gena ostaje kontinuirano naučno istraživanje. Predložen je niz različitih funkcija za sve veći broj karakteriziranih malih RNK ​​sekvenci – na primjer, regulacija razvoja, sudbina neuronskih stanica, ćelijska smrt, proliferacija, skladištenje masti, sudbina hematopoetskih stanica, lučenje inzulina. [17]

Funkcije utišavanja RNA potiskivanjem translacije ili cijepanjem RNK glasnika (mRNA), ovisno o količini komplementarnosti osnovnog uparivanja. RNA je u velikoj mjeri istražena u okviru svoje uloge posrednika u prevođenju gena u proteine. [18] Međutim, istraživači su se aktivnijim regulatornim funkcijama počeli baviti tek krajem 1990-ih. [19] Značajna studija koja pruža razumijevanje prvog identificiranog mehanizma objavljena je 1998. od strane Fire et al., [1] pokazujući da dvolančana RNK može djelovati kao okidač za utišavanje gena. [19] Od tada su identifikovane i okarakterisane različite druge klase utišavanja RNK. [4] Trenutno se istražuje terapeutski potencijal ovih otkrića, na primjer, u kontekstu ciljane genske terapije. [20] [21]

Dok je utišavanje RNK klasa mehanizama u razvoju, zajednička tema je temeljni odnos između malih RNK ​​i ekspresije gena. [8] Također je primijećeno da glavni identificirani putevi utišavanja RNK trenutno imaju mehanizme djelovanja koji mogu uključivati ​​i post-transkripcijsko utišavanje gena (PTGS) [22], kao i puteve utišavanja gena zavisnih od kromatina (CDGS). [4] CDGS uključuje sklapanje malih RNA kompleksa na novonastalim transkriptima i smatra se obuhvatnim mehanizmima djelovanja koji impliciraju događaje utišavanja transkripcijskog gena (TGS) i ko-transkripcijskog utišavanja gena (CTGS). [23] Ovo je značajno barem zato što dokazi sugeriraju da male RNK igraju ulogu u modulaciji strukture kromatina i TGS-a. [24] [25]

Uprkos ranom fokusu u literaturi na interferenciji RNK (RNAi) kao jezgroviti mehanizam koji se javlja na nivou prenošenja RNK glasnika, drugi su od tada identifikovani u široj porodici očuvanih puteva utišavanja RNK koji djeluju na nivou DNK i hromatina. [26] Utišavanje RNA odnosi se na aktivnost prigušivanja niza malih RNK ​​i općenito se smatra širom kategorijom od RNAi. Iako se termini ponekad koriste naizmjenično u literaturi, RNAi se općenito smatra granom utišavanja RNK. U mjeri u kojoj je korisno napraviti razliku između ovih povezanih koncepata, utišavanje RNA može se smatrati kao da se odnosi na širu shemu malih kontrola povezanih s RNK uključenih u ekspresiju gena i zaštitu genoma od pokretnih ponavljajućih sekvenci DNK, retroelemenata, i transpozone u mjeri u kojoj oni mogu izazvati mutacije. [27] Molekularni mehanizmi za utišavanje RNK su u početku proučavani u biljkama [12], ali su se od tada proširili na različite subjekte, od gljiva do sisavaca, pružajući snažne dokaze da su ti putevi visoko očuvani. [28]

Najmanje tri primarne klase male RNK su trenutno identificirane, odnosno: mala interferirajuća RNK (siRNA), mikroRNA (miRNA), i RNA u interakciji s piwi (piRNA).

Mala interferirajuća RNA (siRNA) Edit

siRNA djeluju u jezgru i citoplazmi i uključene su u RNAi kao i u CDGS. [4] siRNA potiču od dugih prekursora dsRNA izvedenih iz različitih prekursora jednolančane RNK (ssRNA), poput osjetnih i antisensnih RNK. siRNA takođe dolaze iz RNA ukosnica izvedenih transkripcijom obrnutih regiona ponavljanja. siRNA takođe mogu enzimski nastati iz nekodiranih prekursora RNK. [29] Obim literature o siRNA u okviru RNAi je veliki.

MikroRNA (miRNA) Uredi

The majority of miRNAs act in the cytoplasm and mediate mRNA degradation or translational arrest. [30] However, some plant miRNAs have been shown to act directly to promote DNA methylation. [31] miRNAs come from hairpin precursors generated by the RNaseIII enzymes Drosha and Dicer. [32] Both miRNA and siRNA form either the RNA-induced silencing complex (RISC) or the nuclear form of RISC known as RNA-induced transcriptional silencing complex (RITS). [33] The volume of literature on miRNA within the framework of RNAi is extensive.

Three prime untranslated regions and microRNAs Edit

Three prime untranslated regions (3'UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often contain regulatory sequences that post-transcriptionally cause RNA interference. Such 3'-UTRs often contain both binding sites for microRNAs (miRNAs) as well as for regulatory proteins. By binding to specific sites within the 3'-UTR, miRNAs can decrease gene expression of various mRNAs by either inhibiting translation or directly causing degradation of the transcript. The 3'-UTR also may have silencer regions that bind repressor proteins that inhibit the expression of a mRNA.

The 3'-UTR often contains microRNA response elements (MREs). MREs are sequences to which miRNAs bind. These are prevalent motifs within 3'-UTRs. Among all regulatory motifs within the 3'-UTRs (e.g. including silencer regions), MREs make up about half of the motifs.

As of 2014, the miRBase web site, [34] an archive of miRNA sequences and annotations, listed 28,645 entries in 233 biologic species. Of these, 1,881 miRNAs were in annotated human miRNA loci. miRNAs were predicted to have an average of about four hundred target mRNAs (affecting expression of several hundred genes). [35] Freidman et al. [35] estimate that >45,000 miRNA target sites within human mRNA 3'UTRs are conserved above background levels, and >60% of human protein-coding genes have been under selective pressure to maintain pairing to miRNAs.

Direct experiments show that a single miRNA can reduce the stability of hundreds of unique mRNAs. [36] Other experiments show that a single miRNA may repress the production of hundreds of proteins, but that this repression often is relatively mild (less than 2-fold). [37] [38]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression seem to be important in cancer. [39] For instance, in gastrointestinal cancers, nine miRNAs have been identified as epigenetically altered and effective in down regulating DNA repair enzymes. [40]

The effects of miRNA dysregulation of gene expression also seem to be important in neuropsychiatric disorders, such as schizophrenia, bipolar disorder, major depression, Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorders. [41] [42] [43]

Piwi-interacting RNA (piRNA) Edit

piRNAs represent the largest class of small non-coding RNA molecules expressed in animal cells, deriving from a large variety of sources, including repetitive DNA and transposons. [44] However, the biogenesis of piRNAs is also the least well understood. [45] piRNAs appear to act both at the post-transcriptional and chromatin levels. They are distinct from miRNA due to at least an increase in terms of size and complexity. Repeat associated small interfering RNA (rasiRNAs) are considered to be a subspecies of piRNA. [3]

The most basic mechanistic flow for RNA Silencing is as follows: (For a more detailed explanation of the mechanism, refer to the RNAi:Cellular mechanism article.)

1: RNA with inverted repeats hairpin/panhandle constructs --> 2: dsRNA --> 3: miRNAs/siRNAs --> 4: RISC --> 5: Destruction of target mRNA

  1. It has been discovered that the best precursor to good RNA silencing is to have single stranded antisense RNA with inverted repeats which, in turn, build small hairpin RNA and panhandle constructs. [6] The hairpin or panhandle constructs exist so that the RNA can remain independent and not anneal with other RNA strands.
  2. These small hairpin RNAs and/or panhandles then get transported from the nucleus to the cytosol through the nuclear export receptor called exportin-5, and then get transformed into a dsRNA, a double stranded RNA, which, like DNA, is a double stranded series of nucleotides. If the mechanism didn't use dsRNAs, but only single strands, there would be a higher chance for it to hybridize to other "good" mRNAs. As a double strand, it can be kept on call for when it is needed.
  3. The dsRNA then gets cut up by a Dicer into small (21-28 nt = nucleotides long) strands of miRNAs (microRNAs) or siRNAs (short interfering RNAs.) A Dicer is an endoribonucleaseRNase, which is a complex of a protein mixed with strand(s) of RNA.
  4. Lastly, the double stranded miRNAs/siRNAs separate into single strands the antisense RNA strand of the two will combine with another endoribonuclease enzyme complex called RISC (RNA-induced silencing complex), which includes the catalytic component Argonaute, and will guide the RISC to break up the "perfectly complementary" target mRNA or viral genomic RNA so that it can be destroyed. [2][6]
  5. It means that based on a short sequence specific area, a corresponding mRNA will be cut. To make sure, it will be cut in many other places as well. (If the mechanism only worked with a long stretch, then there would be higher chance that it would not have time to match to its complementary long mRNA.) It has also been shown that the repeated-associated short interference RNAs (rasiRNA) have a role in guiding chromatin modification. [2]

For an animated explanation of the mechanism of RNAi by Nature Reviews, see the External Links section below.

Immunity against viruses or transposons Edit

RNA silencing is the mechanism that our cells (and cells from all kingdoms) use to fight RNA viruses and transposons (which originate from our own cells as well as from other vehicles). [2] In the case of RNA viruses, these get destroyed immediately by the mechanism cited above. In the case of transposons, it's a little more indirect. Since transposons are located in different parts of the genome, the different transcriptions from the different promoters produce complementary mRNAs that can hybridize with each other. When this happens, the RNAi machinery goes into action, debilitating the mRNAs of the proteins that would be required to move the transposons themselves. [46]

Down-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the down-regulation of genes, see RNAi:downregulation of genes

Up-regulation of genes Edit

For a detailed explanation of the up-regulation of genes, see RNAi:upregulation of genes

RNA silencing also gets regulated Edit

The same way that RNA silencing regulates downstream target mRNAs, RNA silencing itself is regulated. For example, silencing signals get spread between cells by a group of enzymes called RdRPs (RNA-dependent RNA polymerases) or RDRs. [2]

Growing understanding of small RNA gene-silencing mechanisms involving dsRNA-mediated sequence-specific mRNA degradation has directly impacted the fields of functional genomics, biomedicine, and experimental biology. The following section describes various applications involving the effects of RNA silencing. These include uses in biotechnology, therapeutics, and laboratory research. Bioinformatics techniques are also being applied to identify and characterize large numbers of small RNAs and their targets.

Biotechnology Edit

Artificial introduction of long dsRNAs or siRNAs has been adopted as a tool to inactivate gene expression, both in cultured cells and in living organisms. [2] Structural and functional resolution of small RNAs as the effectors of RNA silencing has had a direct impact on experimental biology. For example, dsRNA may be synthesized to have a specific sequence complementary to a gene of interest. Once introduced into a cell or biological system, it is recognized as exogenous genetic material and activates the corresponding RNA silencing pathway. This mechanism can be used to effect decreases in gene expression with respect to the target, useful for investigating loss of function for genes relative to a phenotype. That is, studying the phenotypic and/or physiologic effects of expression decreases can reveal the role of a gene product. The observable effects can be nuanced, such that some methods can distinguish between “knockdown” (decrease expression) and “knockout” (eliminate expression) of a gene. [47] RNA interference technologies have been noted recently as one of the most widely utilized techniques in functional genomics. [48] Screens developed using small RNAs have been used to identify genes involved in fundamental processes such as cell division, apoptosis and fat regulation.

Biomedicine Edit

Since at least the mid-2000s, there has been intensifying interest in developing short interfering RNAs for biomedical and therapeutic applications. [49] Bolstering this interest is a growing number of experiments which have successfully demonstrated the clinical potential and safety of small RNAs for combatting diseases ranging from viral infections to cancer as well as neurodegenerative disorders. [50] In 2004, the first Investigational New Drug applications for siRNA were filed in the United States with the Food and Drug Administration it was intended as a therapy for age-related macular degeneration. [48] RNA silencing in vitro and in vivo has been accomplished by creating triggers (nucleic acids that induce RNAi) either via expression in viruses or synthesis of oligonucleotides. [51] Optimistically many studies indicate that small RNA-based therapies may offer novel and potent weapons against pathogens and diseases where small molecule/pharmacologic and vaccine/biologic treatments have failed or proved less effective in the past. [49] However, it is also warned that the design and delivery of small RNA effector molecules should be carefully considered in order to ensure safety and efficacy.

The role of RNA silencing in therapeutics, clinical medicine, and diagnostics is a fast developing area and it is expected that in the next few years some of the compounds using this technology will reach market approval. A report has been summarized below to highlight the many clinical domains in which RNA silencing is playing an increasingly important role, chief among them are ocular and retinal disorders, cancer, kidney disorders, LDL lowering, and antiviral. [51] The following table displays a listing of RNAi based therapy currently in various phases of clinical trials. The status of these trials can be monitored on the ClinicalTrials.gov website, a service of the National Institutes of Health (NIH). [52] Of note are treatments in development for ocular and retinal disorders, that were among the first compounds to reach clinical development. AGN211745 (sirna027) (Allergan) and bevasiranib (Cand5) (Opko) underwent clinical development for the treatment of age-related macular degeneration, but trials were terminated before the compounds reached the market. Other compounds in development for ocular conditions include SYL040012 (Sylentis) and QPI-007 (Quark). SYL040012 (bamosinan) is a drug candidate under clinical development for glaucoma, a progressive optic neurdegeneration frequently associated to increased intraocular pressure QPI-007 is a candidate for the treatment of angle-closure glaucoma and Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy both compounds are currently undergoing phase II clinical trials. Several compounds are also under development for conditions such as cancer and rare diseases.

Clinical domain Drug Indication Target
Ocular and retinal disorders TD101 Pachyonychia congenita Keratin 6A N171K mutant
Ocular and retinal disorders QPI-1007 Non-arteritic anterior ischaemic optic neuropathy Caspase 2
Ocular and retinal disorders AGN211745 Age-related macular degeneration, choroidal neovascularization VEGFR1
Ocular and retinal disorders PF-655 Diabetic macular oedema, age-related macular degeneration RTP801
Ocular and retinal disorders SYL040012 Glaukom β2 adrenergic receptor
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Diabetic macular oedema VEGF
Ocular and retinal disorders Bevasiranib Macular degeneration VEGF
Rak CEQ508 Porodična adenomatozna polipoza β-catenin
Rak ALN-PLK1 Tumor jetre PLK1
Rak FANG Solid tumor Furin
Rak CALAA-01 Solid tumor RRM2
Rak SPC2996 hronična limfocitna leukemija BCL-2
Rak ALN-VSP02 Solid tumor VEGF, kinesin spindle protein
Rak NCT00672542 Metastatic melanoma LMP2, LMP7, and MECL1
Rak Atu027 Solid malignancies PKN3
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Acute kidney injury p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Graft dysfunction kidney transplant p53
Kidney disorders QPI-1002/I5NP Kidney injury acute renal failure p53
LDL lowering TKM-ApoB Hypercholesterolaemia APOB
LDL lowering PRO-040,201 Hypercholesterolaemia APOB
Antivirusno miravirsen Virus hepatitisa C miR-122
Antivirusno pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ HIV HIV Tat protein, HIV TAR RNA, human CCR5
Antivirusno ALN-RSV01 RSV RSV nucleocapsid
Antivirusno ALN-RSV01 RSV in lung transplant patients RSV nucleocapsid

Main challenge Edit

As with conventional manufactured drugs, the main challenge in developing successful offshoots of the RNAi-based drugs is the precise delivery of the RNAi triggers to where they are needed in the body. The reason that the ocular macular degeneration antidote was successful sooner than the antidote with other diseases is that the eyeball is almost a closed system, and the serum can be injected with a needle exactly where it needs to be. The future successful drugs will be the ones who are able to land where needed, probably with the help of nanobots. Below is a rendition of a table [51] that shows the existing means of delivery of the RNAi triggers.

Laboratory Edit

The scientific community has been quick to harness RNA silencing as a research tool. The strategic targeting of mRNA can provide a large amount of information about gene function and its ability to be turned on and off. Induced RNA silencing can serve as a controlled method for suppressing gene expression. Since the machinery is conserved across most eukaryotes, these experiments scale well to a range of model organisms. [53] In practice, expressing synthetic short hairpin RNAs can be used to reach stable knock-down. [54] If promoters can be made to express these designer short hairpin RNAs, the result is often potent, stable, and controlled gene knock-down in both in vitro and in vivo contexts. [55] Short hairpin RNA vector systems can be seen as roughly analogous in scope to using cDNA overexpression systems. [56] Overall, synthetic and natural small RNAs have proven to be an important tool for studying gene function in cells as well as animals. [57]

Bioinformatics approaches to identify small RNAs and their targets have returned several hundred, if not thousands of, small RNA candidates predicted to affect gene expression in plants, C. elegans, D. melanogaster, zebrafish, mouse, rat, and human. [58] These methods are largely directed to identifying small RNA candidates for knock-out experiments but may have broader applications. One bioinformatics approach evaluated sequence conservation criteria by filtering seed complementary target-binding sites. The cited study predicted that approximately one third of mammalian genes were to be regulated by, in this case, miRNAs. [59]

Ethics & Risk-Benefit Analysis Edit

One aspect of RNA silencing to consider is its possible off-target affects, toxicity, and delivery methods. If RNA silencing is to become a conventional drug, it must first pass the typical ethical issues of biomedicine. [60] Using risk-benefit analysis, researchers can determine whether RNA silencing conforms to ethical ideologies such as nonmaleficence, beneficence, and autonomy. [61]

There is a risk of creating infection-competent viruses that could infect non-consenting people. [62] There is also a risk of affecting future generations based on these treatments. These two scenarios, in respect to autonomy, is possible unethical. At this moment, unsafe delivery methods and unintended aspects of vector viruses add to the argument against RNA silencing. [61]

In terms of off-target effects, siRNA can induce innate interferon responses, inhibit endogenous miRNAs through saturation, and may have complementary sequences to other non-target mRNAs. These off-targets could also have target up-regulations such as oncogenes and antiapoptotic genes. The toxicity of RNA silencing is still under review as there are conflicting reports. [61] [62] [63]

RNA silencing is quickly developing, because of that, the ethical issues need to be discussed further. With the knowledge of general ethical principles, we must continuously perform risk-benefit analysis. [61]


Zaključci

The method reported here, EMIRGE, reconstructs full-length SSU sequences from metagenomic data from a microbial community of interest, accurate to the species level. In addition, the method also provides accurate SSU sequence abundance estimates. EMIRGE is robust to errors and omissions in the reference database, and is broadly applicable to any dataset produced with short read sequencing technology. An open-source implementation of the algorithm is freely available [41]. We expect that application of the method, especially with very deep sequencing, will provide new insights into fine details of changing microbial community structure.


Original articles

Lovell, J. F. et al. Membrane binding by tBid initiates an ordered series of events culminating in membrane permeabilization by Bax. Cell 135, 1074–1084 (2008)

Edlich, F. et al. Bcl-x(L) retrotranslocates Bax from the mitochondria into the cytosol. Cell 145, 104–116 (2011)

Czabotar et al. Bax crystal structures reveal how BH3 domains activate Bax and nucleate its oligomerization to induce apoptosis. Cell 152, 519–531 (2013)

Ichim et al. Limited mitochondrial permeabilization causes DNA damage and genomic instability in the absence of cell death. Mol. Cell 57, 860–872 (2015)

McArthur, K. et al. BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis. Nauka 23, eaao6047 (2018)


Podaci o autoru

Jonathan B Baell, Sanji Kulasegaram, John P Parisot & Brian J Smith

Present address: Present addresses: Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Parkville, Victoria, Australia (J.B.B.) Chemistry Department, Monash University, Clayton, Victoria, Australia (S.K.) Peter McCallum Cancer Centre, East Melbourne, Victoria, Australia (J.P.P.) Department of Chemistry, La Trobe Institute of Molecular Sciences, La Trobe University, Bundoora, Victoria, Australia (B.J.S.).,

Peter E Czabotar and Brad E Sleebs: These authors contributed equally to this work.

Pripadnosti

Chemical Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jonathan B Baell, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Department of Medical Biology, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

Guillaume Lessene, Peter E Czabotar, Brad E Sleebs, Kym N Lowes, Jerry M Adams, Jonathan B Baell, Peter M Colman, Wilhelmus J A Kersten, Sanji Kulasegaram, Rebecca M Moss, John P Parisot, Brian J Smith, Ian P Street, Hong Yang, David C S Huang & Keith G Watson

Structural Biology Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Peter E Czabotar & Peter M Colman

Department of Early Discovery Biochemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA

Kerry Zobel, Kurt Deshayes & Wayne J Fairbrother

Molecular Genetics of Cancer Division, Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Parkville, Victoria, Australia

Department of Discovery Chemistry, Genentech, Inc., San Francisco, California, USA


Pogledajte video: Foods modulate the Bcl2 pathway (Decembar 2022).