Informacije

15.6: Vježba 2 - Imunodetekcija - Biologija

15.6: Vježba 2 - Imunodetekcija - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ovo je višednevna procedura. Membrane se rehidriraju i tretiraju reagensima za blokiranje

  1. Noseći rukavice, odmotajte suhu mrlju od plastične folije. Pomoću prethodno obojenih standarda identificirajte stranu membrane na koju su proteini vezani. Uronite membranu u metanol sa stranom okrenutom prema gore. Lagano miješajte membranu ručnim njihanjem 30-60 sekundi dok membrana ne bude jednolično navlažena metanolom. Prelijte metanol u odgovarajuću posudu i posudu do pola napunite deioniziranom vodom. Lagano miješajte membranu još jedan minut.
  2. Dekantirajte vodu i zamijenite je sa dovoljno TBS-T (puferirani fiziološki rastvor Tris koji sadrži 0,05% Tween 20) da pokrije mrlju. Postavite mrlju na platformu za ljuljanje. Uravnotežite mrlju u TBS-T 5 minuta uz sporo ljuljanje. Na kraju 5 minuta, ispraznite TBS-T.
  3. Sipajte dovoljno otopine za blokiranje (5% nemasnog mlijeka u TBS-T) na mrlju da je prekrije.
  4. Pokrijte pleh sa malim komadom plastične folije. Jasno označite poslužavnik i postavite ga na platformu za ljuljanje u hladnoj prostoriji. Mrlja bi trebala slobodno plutati u ladici tako da se isperu obje strane. Inkubirajte mrlju najmanje sat vremena ili do 24 sata na 4 ̊C.

Membrane se peru i inkubiraju s primarnim antitijelom (~ 24 sata)

  1. Pronađite svoju mrlju u hladnoj sobi i vratite je u laboratoriju.
  2. Uklonite plastičnu foliju iz spremnika koji drži mrlju i izlijte otopinu za blokiranje. UŠTEDITE plastičnu foliju! Trebat će vam da ponovo pokrijete spremnik!
  3. Dodajte dovoljno TBS-T da pokrije mrlju i postavite spremnik na platformu za ljuljanje. Kamenite 5 minuta.
  4. Izlijte TBS-T. Dodajte 15 mL primarnog antitijela razrijeđenog u puferu za blokiranje.
  5. Pokrijte posudu istom plastičnom folijom i stavite tacnu na platformu za ljuljanje u rashladnu prostoriju na 4 ̊C. Uvjerite se da mrlja slobodno pluta u ladici i da su standardi na gornjoj strani mrlje. Inkubirajte preko noći na 4 ̊C uz polagano ljuljanje. NAPOMENA: Vrijeme ovog koraka je najkritičnije u proceduri. Skraćivanje vremena inkubacije sa primarnim antitijelom može smanjiti osjetljivost Western blota.

Sekundarno vezivanje i detekcija antitela (1,5-2 sata)

  1. Pronađite mrlju u hladnoj prostoriji i odnesite je u laboratorijsku učionicu.
  2. Pažljivo ispustite antitelo iz mrlje u epruvetu sa natpisom „Korišćeno primarno antitelo“. (Antitijela su skupa. Na sreću, rješenja se mogu ponovo koristiti.)
  3. Napunite posudu mrljom otprilike do pola sa TBS-T. Stavite poslužavnik na platformu za ljuljanje i isperite membranu 5 minuta kako biste uklonili nevezana primarna antitijela. Isperite TBS-T kada se pranje završi.
  4. Ponovite korak 3 još jednom, za ukupno dva pranja.
  5. Dodajte dovoljno sekundarnog antitijela da pokrije mrlju i inkubirajte membranu 1 sat uz blago ljuljanje na sobnoj temperaturi. Sekundarno antitijelo, koje je konjugirano s peroksidazom hrena (HRP), razrijeđeno je u TBS-T.
  6. Pažljivo iscedite antitelo iz mrlje u epruvetu sa oznakom „Upotrebljeno sekundarno antitelo“.
  7. Operite membranu 3 puta po 5 minuta sa TBS-T, kao u koraku 3.
  8. Ocijedite TBS-T iz mrlje. Pomoću mikropipete P1000 prekrijte mrlju s 1 ml 3,3’5,5’-tetrametil benzidina (TMB), kolorigenog supstrata za HRP. Ostavite da se boja nastavi razvijati sve dok se ne vide jasne trake. Bendovi će vjerovatno postati vidljivi u roku od nekoliko minuta. Ne dopustite da se mrlja previše razvije, kada nespecifične trake postanu vidljive.

9. Zaustavite razvoj boje razrjeđivanjem podloge s viškom deionizirane vode. Ocijedite razrijeđenu podlogu u spremnik za otpad.

10. Pustite da se mrlja osuši na komadu filtriranog papira. Snimite svoje podatke kamerom mobilnog telefona.


Dijeta i vježba: spoj napravljen u kostima

Svrha pregleda: Više komponenti prehrane imaju potencijal da pozitivno utječu na mineralnu gustoću kostiju u ranom životu i smanje gubitak koštane mase sa starenjem. Osim toga, redovita tjelesna aktivnost koja podnosi težinu ima snažan pozitivan učinak na kosti kroz aktivaciju signalizacije osteocita. Istražit ćemo moguće sinergijske učinke dijetalnih komponenti i mehaničkih podražaja na zdravlje kostiju identificiranjem dijetalnih komponenti koje imaju potencijal izmijeniti odgovor osteocita na mehaničko opterećenje.

Najnoviji nalazi: Nekoliko (pod) staničnih aspekata osteocita određuje njihovu signalizaciju prema osteoblastima i osteoklastima kao odgovor na mehaničke podražaje, poput citoskeleta osteocita, receptora estrogena α, receptora vitamina D i arhitekture lakunokanalkularnog sistema. Potencijalni modulatori ovih svojstava uključuju 1,25-dihidroksi vitamin D3, nekoliko oblika vitamina K i fitoestrogen genistein. Više komponenti prehrane potencijalno utječu na funkciju osteocita i stoga mogu imati sinergijski učinak na zdravlje kostiju u kombinaciji s režimom tjelesne aktivnosti.

Ključne riječi: Zdravlje kostiju Dijeta Komponente ishrane Ishrana Osteociti Fizička aktivnost.

Izjava o sukobu interesa

Sukob interesa

Ellen GHM van den Heuvel i Ruud JW Schoemaker su zaposleni u FrieslandCampina, mljekarskoj kompaniji.

Astrid Bakker, Jenneke Klein-Nulend i Hubertine Willems izjavljuju da nema sukoba interesa.

Ljudska i životinjska prava i informirani pristanak

Ovaj članak ne sadrži nikakve studije na ljudima ili životinjama koje je izvršio bilo koji od autora.


Naučnici otkrili prirodni molekul za liječenje dijabetesa tipa 2: Molekula oponaša neki učinak tjelesnih vježbi

Istraživači sa Medicinskog fakulteta Université Laval, Istraživačkog centra Instituta za srce i pluća u Quebeku i Instituta za ishranu i funkcionalnu hranu otkrili su prirodnu molekulu koja bi se mogla koristiti za liječenje inzulinske rezistencije i dijabetesa tipa 2. Molekula, derivat omega-3 masnih kiselina, oponaša neke od učinaka tjelesnih vježbi na regulaciju glukoze u krvi.

Detalji otkrića do kojih su došli profesor Andr & eacute Marette i njegov tim objavljeni su danas u Prirodna medicina.

Već je neko vrijeme poznato da omega-3 masne kiseline mogu pomoći u smanjenju rezistencije na inzulin uzrokovane ishranom bogatom zasićenim mastima. U svom ranijem radu, André Marette i njegove kolege povezivali su ove efekte sa bioaktivnim lipidom zvanim protektin D1. Daljnjim istraživanjem otkrili su da drugi član iste porodice po imenu protein DX (PDX) pokreće proizvodnju i oslobađanje interleukina 6 (IL-6) u mišićnim stanicama, odgovor koji se javlja i tijekom tjelesnih vježbi. "Jednom kada uđe u krvotok, IL-6 kontrolira nivoe glukoze na dva načina: signalizira jetri da smanji proizvodnju glukoze i djeluje direktno na mišiće kako bi povećao unos glukoze", objašnjava istraživač koji je i naučni direktor Université Lavalovog instituta za Prehrana i funkcionalna hrana.

Istraživači su koristili transgene miševe kojima nedostaje IL-6 gen da demonstriraju vezu između PDX-a i IL-6. PDX je imao vrlo mali učinak na kontrolu glukoze u krvi kod ovih životinja. U sličnim testovima provedenim na pretilim štakorima s dijabetesom, pokazalo se da PDX dramatično poboljšava osjetljivost na inzulin, hormon koji regulira glukozu u krvi. "Mehanizam djelovanja opisan za PDX predstavlja novu terapijsku strategiju za poboljšanje kontrole glukoze", predlaže istraživač. "Njegova učinkovitost može se usporediti s djelotvornošću određenih lijekova koji se trenutno propisuju za kontrolu glikemije."

Iako se čini da PDX oponaša učinak fizičke vježbe izazivajući lučenje IL-6 u mišićima, Andr & eacute Marette upozorava da to nije zamjena za fizičku aktivnost. "Vježba ima kardiovaskularne i druge hormonalne prednosti koje nadilaze metaboličke učinke na mišiće", dodaje istraživač čiji rad podržavaju Kanadski instituti za zdravstvena istraživanja (CIHR) i Kanadsko udruženje za dijabetes.

Profesor Marette i Universit & eacute Laval podnijeli su patentnu prijavu za PDX i njegove terapijske aplikacije. "Za nas je sljedeći korak demonstriranje antidijabetičkih učinaka na ljude i određivanje receptora kroz koji PDX djeluje."

Uz Andr & eacute Marette, autor studije su Phillip White, Philippe St-Pierre, Alexandre Charbonneau, Patricia Mitchell, Emmanuelle St-Amand i Bruno Marcotte.


Dijeta i vježba: spoj napravljen u kostima

Svrha pregleda: Više komponenti prehrane imaju potencijal da pozitivno utječu na mineralnu gustoću kostiju u ranom životu i smanje gubitak koštane mase sa starenjem. Osim toga, redovita tjelesna aktivnost koja podnosi težinu ima snažan pozitivan učinak na kosti kroz aktivaciju signalizacije osteocita. Istražit ćemo moguće sinergističke efekte komponenti ishrane i mehaničkih stimulansa za zdravlje kostiju identifikujući komponente ishrane koje imaju potencijal da promene odgovor osteocita na mehaničko opterećenje.

Najnoviji nalazi: Nekoliko (pod) staničnih aspekata osteocita određuje njihovu signalizaciju prema osteoblastima i osteoklastima kao odgovor na mehaničke podražaje, kao što su citoskelet osteocita, receptor estrogena α, receptor vitamina D i arhitektura lakunokanalikularnog sistema. Potencijalni modulatori ovih karakteristika uključuju 1,25-dihidroksi vitamin D3, nekoliko oblika vitamina K i fitoestrogen genistein. Višestruke komponente ishrane potencijalno utiču na funkciju osteocita i stoga mogu imati sinergistički efekat na zdravlje kostiju kada se kombinuju sa režimom fizičke aktivnosti.

Ključne riječi: Zdravlje kostiju Dijeta Dijetalne komponente Prehrana Osteociti Fizička aktivnost.

Izjava o sukobu interesa

Sukob interesa

Ellen GHM van den Heuvel i Ruud JW Schoemaker zaposlenici su kompanije FrieslandCampina, mliječne kompanije.

Astrid Bakker, Jenneke Klein-Nulend i Hubertine Willems izjavljuju da nema sukoba interesa.

Ljudska i životinjska prava i informirani pristanak

Ovaj članak ne sadrži nikakve studije na ljudima ili životinjama koje je izvršio bilo koji od autora.


Vježba inhibira rast tumora i centralni metabolizam ugljika u modelima ksenografta kolorektalnog karcinoma dobivenim od pacijenata

Pozadina: Iako su vježbe koje su sami prijavili povezane sa smanjenjem rizika od recidiva kolorektalnog karcinoma, molekularni mehanizmi koji podupiru ovu vezu nisu poznati. Nadalje, učinak vježbanja na intratumoralne metaboličke procese nije detaljno istražen kod ljudskih karcinoma. U našoj trenutnoj studiji, generirali smo šest modela ksenografta izvedenih od pacijenata sa kolorektalnim pacijentima (CRC PDX) i tretirali svaki PDX dobrovoljnim trčanjem kotača (vježba) 6-8 tjedana ili bez izlaganja kotaču (kontrola). Sveobuhvatna metabolomička analiza je zatim izvršena na PDX-ima kako bi se identificirale promjene u tumoru izazvane vježbanjem koje su bile povezane sa sporijim rastom.

Rezultati: Inhibicija rasta tumora primijećena je u grupi koja je voljno trčala kotačima u poređenju sa kontrolnom grupom u tri od šest modela. Metabolomska analiza je prvo otkrila da je centralni metabolizam ugljika utjecao na svaki model bez obzira na liječenje. Zanimljivo je da je poređenje modela koji reaguju i otporni pokazalo da su nivoi metabolita u metabolizmu nukleotida, za koje se zna da su povezani sa metabolizmom mitohondrija, bili prediktivni za odgovor. Nadalje, razine fosfokreatina koje su povezane s potrebama mitohondrijske energije bile su povezane s inhibicijom rasta tumora.

zaključak: Sve u svemu, ovo istraživanje pruža dokaze da promjene u metabolizmu mitohondrija tumorskih stanica mogu djelomično pokriti prednosti vježbanja.

Ključne riječi: Centralni metabolizam ugljika Kolorektalni karcinom Vježba Mitohondrijski metabolizam Ksenotransplantat izveden od pacijenata.


Pogledajte video: How to Run an SDS-PAGE gel (Februar 2023).