Informacije

Specifičnosti lančane reakcije polimeraze

Specifičnosti lančane reakcije polimeraze


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Prelazeći PCR na ovonedeljnom predavanju iz biologije, naišao sam na nekoliko pitanja koja imam o ovom procesu.

Prvo, pošto se PCR fokusira na pokušaj repliciranja specifične ciljane sekvence DNK mnogo puta u kratkom vremenskom periodu, da li su prajmeri koji se koriste u svakom ciklusu ista sekvenca? Razumijem da prednji i reverzni prajmer ne bi bili isti, ali prednji prajmer za jedan prajmer u jednom ciklusu, da li bi bio isti kao prajmer za prednji prajmer za kćerku lancu recimo 8. ciklusa?

Drugo, zašto se prajmeri ne mogu ponovo koristiti za različite cikluse? Mislim da bi ovo bilo zasnovano na odgovoru na moje prvo pitanje. Ako su prajmeri su u suštini isti slijed, zašto se novi prajmeri moraju koristiti za svaki ciklus?

Hvala unapred!


da li se početnice koriste u svakom ciklusu iste sekvence?

Da. Stavljate cijelu reakciju na termocikler, a zatim odlazite dok se svi ciklusi ne završe.

Ali može se napraviti drugi krug PCR-a sa različitim unutrašnjim prajmerima na tom prvom PCR proizvodu, ako želite.

Drugo, zašto se prajmeri ne mogu ponovo koristiti za različite cikluse?

Pitate se zašto ne možete staviti 10 molekula prajmera i iz toga dobiti milion molekula proizvoda?

Svaki molekul prajmera koji se koristi kao produžni šablon ugrađen je u cijeli stalak PCR proizvoda. To više nije prajmer.


Prajmer se ugrađuje u početak novog pramena. Broj proizvedenih niti DNK ograničen je brojem prajmera.


PCR metoda je izuzetno osjetljiva, zahtijeva samo nekoliko molekula DNK u jednoj reakciji za amplifikaciju u nekoliko redova veličine. Stoga su potrebne adekvatne mjere za izbjegavanje kontaminacije bilo kakvom DNK prisutnom u laboratorijskom okruženju (bakterije, virusi ili ljudski izvori). Budući da su proizvodi iz prethodnih PCR amplifikacija uobičajeni izvor kontaminacije, mnoge laboratorije za molekularnu biologiju implementirale su procedure koje uključuju podjelu laboratorije na zasebna područja. [1] Jedna laboratorija je posvećena pripremi i rukovanju pre-PCR reagensima i postavljanju PCR reakcije, a druga oblast post-PCR obradi, kao što je gel elektroforeza ili prečišćavanje PCR proizvoda. Za postavljanje PCR reakcija, mnoge standardne operativne procedure uključuju korištenje pipeta sa vrhovima filtera i nošenje svježih laboratorijskih rukavica, au nekim slučajevima i laminarnog ormarića s UV lampom kao radnom stanicom (da bi se uništila bilo kakva ekstraneomultimerna formacija). PCR se rutinski procjenjuje u odnosu na negativnu kontrolnu reakciju koja se postavlja identično eksperimentalnom PCR-u, ali bez šablonske DNK, i izvodi se uz eksperimentalni PCR.

Sekundarne strukture u DNK mogu rezultirati presavijanjem ili vezanjem DNK šablona ili prajmera, što dovodi do smanjenja prinosa proizvoda ili neuspjeha reakcije. Ukosnice, koje se sastoje od unutrašnjih nabora uzrokovanih uparivanjem baza između nukleotida i invertiranih ponavljanja unutar jednolančane DNK, uobičajene su sekundarne strukture i mogu rezultirati neuspjelim PCR-om.

Tipično, dizajn prajmera koji uključuje provjeru potencijalnih sekundarnih struktura u prajmerima, ili dodavanje DMSO ili glicerola u PCR kako bi se minimizirale sekundarne strukture u DNK šablonu, [2] koriste se u optimizaciji PCR-a koji imaju povijest neuspjeha. zbog sumnje na DNK ukosnice.

Taq polimerazi nedostaje aktivnost egzonukleaze od 3′ do 5′. Prema tome, Taq nema aktivnost očitavanja grešaka, koja se sastoji od ekscizije bilo koje novo pogrešno ugrađene nukleotidne baze iz novonastale (tj. produžene) DNK lanca koja se ne poklapa sa svojom suprotnom bazom u komplementarnom lancu DNK. Nedostatak korekture enzima Taq od 3′ do 5′ dovodi do visoke stope greške (mutacije po nukleotidu po ciklusu) od otprilike 1 od 10 000 baza, što utiče na vjernost PCR-a, posebno ako se greške pojave u ranoj fazi PCR-a sa male količine početnog materijala, uzrokujući nakupljanje velikog udjela amplificirane DNA s pogrešnom sekvencom u konačnom proizvodu. [3]

Dostupno je nekoliko DNK polimeraza "visoke vjernosti", koje su izazvale 3 ′ do 5 ′ egzonukleaznu aktivnost, koje omogućuju preciznije pojačavanje za upotrebu u PCR-ima za sekvenciranje ili kloniranje proizvoda. Primjeri polimeraza sa 3 ′ do 5 ′ egzonukleaznom aktivnošću uključuju: KOD DNA polimerazu, rekombinantni oblik Thermococcus kodakaraensis KOD1 Ventil, koji se izvlači iz Thermococcus litoralis Pfu DNK polimeraza, koja se ekstrahuje iz Pyrococcus furiosus i Pwo, koji se ekstrahuje iz Pyrococcus woesii. [4]

Magnezijum je potreban kao kofaktor za termostabilnu DNK polimerazu. Taq polimeraza je enzim ovisan o magneziju i određivanje optimalne koncentracije za upotrebu je kritično za uspjeh PCR reakcije. [5] Neke komponente reakcijske smjese, poput koncentracije šablona, ​​dNTP -a i prisutnosti helatnih agenasa (EDTA) ili proteina, mogu smanjiti količinu prisutnog slobodnog magnezija, čime se smanjuje aktivnost enzima. [6] Primeri koji se vežu na pogrešna mjesta šablona stabiliziraju se u prisutnosti prekomjernih koncentracija magnezija, pa rezultira smanjenom specifičnošću reakcije. Prevelike koncentracije magnezija također stabiliziraju dvolančanu DNK i sprječavaju potpunu denaturaciju DNK tokom PCR -a smanjujući prinos proizvoda. [5] [6] Neadekvatno odmrzavanje MgCl2 može rezultirati stvaranjem gradijenata koncentracije unutar otopine magnezijum hlorida koja se isporučuje sa DNK polimerazom i takođe doprinosi mnogim neuspjelim eksperimentima. [6]

PCR lako djeluje sa šablonom DNK dužine do dvije do tri hiljade parova baza. Međutim, iznad ove veličine, prinosi proizvoda se često smanjuju, jer sa povećanjem dužine stohastički efekti, poput preranog prekida polimerazom, počinju utjecati na efikasnost PCR -a. Moguće je pojačati veće komade do 50.000 parova baza sa sporijim ciklusom zagrijavanja i posebnim polimerazama. To su polimeraze spojene sa proteinom koji se vezuje za DNK koji poboljšava procesnost, čime se poboljšava prianjanje polimeraze za DNK. [7] [8]

Ostala vrijedna svojstva himernih polimeraza TopoTaq i PfuC2 uključuju poboljšanu termostabilnost, specifičnost i otpornost na kontaminante i inhibitore. [9] [10] Izrađeni su koristeći jedinstvene domene topoizomeraze V za helix-ukosnicu-spiralu (HhH) vezane za topoizomerazu V [11] iz hipertermofila Methanopyrus kandleri. Himerne polimeraze prevazilaze mnoga ograničenja prirodnih enzima i koriste se u direktnoj PCR amplifikaciji iz ćelijskih kultura, pa čak i uzoraka hrane, zaobilazeći tako naporne korake izolacije DNK. Robusna aktivnost istiskivanja niti hibridne TopoTaq polimeraze pomaže u rješavanju problema PCR-a koji mogu biti uzrokovani ukosnicama i dvostrukim spiralama opterećenim G-om. Helice sa visokim sadržajem G-C imaju višu temperaturu topljenja, često ometajući PCR, u zavisnosti od uslova. [12]

Često se javlja nespecifično vezivanje prajmera i može se pojaviti iz više razloga. To uključuje ponavljajuće sekvence u DNK šablonu, nespecifično vezivanje između prajmera i šablona, ​​visok ili nizak sadržaj G-C u šabloni ili nepotpuno vezivanje prajmera, ostavljajući 5 'kraj prajmera neprivezan za šablon. Nespecifično vezivanje degenerisanih prajmera je takođe uobičajeno. Manipulacija temperaturom žarenja i koncentracijom magnezijevih jona može se koristiti za povećanje specifičnosti. Na primjer, niže koncentracije magnezija ili drugih kationa mogu spriječiti nespecifične interakcije prajmera, omogućavajući tako uspješnu PCR. Enzim polimeraze "vrući start" čija je aktivnost blokirana osim ako se ne zagrije na visoku temperaturu (npr. 90–98 ° C) tokom koraka denaturacije prvog ciklusa, obično se koristi za sprječavanje nespecifičnog prajmiranja tokom pripreme reakcije pri nižim temperaturama. Hemijski posredovani PCR-i sa toplim pokretanjem zahtijevaju više temperature i duže vrijeme inkubacije za aktivaciju polimeraze, u usporedbi s PCR-ovima s toplim startom na bazi antitijela. [ potreban citat ]

Druge metode za povećanje specifičnosti uključuju ugniježđenu PCR i touchdown PCR.

Računarske simulacije teorijskih rezultata PCR -a (elektronski PCR) mogu se izvesti kako bi se pomoglo u dizajnu prajmera. [13]

Touchdown polimerazna lančana reakcija ili touchdown style polimerazna lančana reakcija je metoda lančane reakcije polimeraze pomoću koje će prajmeri izbjeći pojačavanje nespecifičnih sekvenci. Temperatura žarenja tokom lančane reakcije polimeraze određuje specifičnost žarenja prajmera. Tačka topljenja prajmera postavlja gornju granicu temperature žarenja. Na temperaturama neposredno ispod ove točke, doći će do samo vrlo specifičnog uparivanja baze između temeljnog premaza i predloška. Na nižim temperaturama, prajmeri se manje specifično vezuju. Nespecifično vezivanje prajmera zamagljuje rezultate lančane reakcije polimeraze, jer će nespecifične sekvence na koje se prajmeri žare u ranim koracima amplifikacije "zatrpati" sve specifične sekvence zbog eksponencijalne prirode amplifikacije polimeraze.

Najraniji koraci ciklusa lančane reakcije polimeraze sa dodirom imaju visoke temperature žarenja. Temperatura žarenja smanjuje se u koracima za svaki sljedeći set ciklusa (broj pojedinačnih ciklusa i korake smanjenja temperature bira eksperimentator). Primer će se žariti na najvišoj temperaturi koja je najmanje dozvoljena za nespecifično vezivanje koje može tolerirati. Dakle, prva sekvenca pojačana je ona između regija s najvećom specifičnošću prajmera, najvjerojatnije je to sekvenca od interesa. Ovi fragmenti će se dalje umnožavati tokom narednih ciklusa na nižim temperaturama i nadmetati se sa nespecifičnim sekvencama za koje se prajmeri mogu vezati na tim nižim temperaturama. Ako se prajmer inicijalno (tokom faza na višoj temperaturi) veže za sekvencu od interesa, na proizvodu se mogu izvesti naknadni krugovi lančane reakcije polimeraze kako bi se ti fragmenti dodatno pojačali.

Žarenje 3' kraja jednog prajmera na sebe ili drugog prajmera može uzrokovati produžetak prajmera, što rezultira formiranjem takozvanih dimera prajmera, vidljivih kao trake niske molekularne težine na PCR gelovima. [14] Formiranje dimera prajmera često se natječe s formiranjem fragmenta DNK od interesa, a može se izbjeći upotrebom prajmera koji su dizajnirani tako da nemaju komplementarnost - posebno na 3 'krajevima - sa samim sobom ili s drugim primerom koji se koristi u reakciji. Ako je dizajn prajmera ograničen drugim faktorima i ako se pojave dimeri prajmera, metode za ograničavanje njihovog formiranja mogu uključivati ​​optimizaciju MgCl2 koncentracije ili povećanje temperature žarenja u PCR-u. [14]

Deoksinukleotidi (dNTP) mogu vezati ione Mg 2+ i tako utjecati na koncentraciju slobodnih iona magnezija u reakciji. Osim toga, prevelike količine dNTP -a mogu povećati stopu grešaka DNA polimeraze, pa čak i inhibirati reakciju. [5] [6] Neravnoteža u odnosu četiri dNTP -a može dovesti do pogrešne inkorporacije u novoformiranu DNK lanac i doprinijeti smanjenju vjernosti DNA polimeraze. [15]


A. PCR - osnovni proces

Tipični PCR oslanja se na poznavanje dva bita DNK sekvence koja će se koristiti za dizajn i sintezu kratkih oligonukleotidnih sekvenci (oligomeri) u laboratoriji. Dva oligomera su odabrana da budu komplementarna sekvencama suprotnim lancima dvolančane DNK koje sadrže gen za proučavanje. Kažemo da se dva oligomera suočavaju, ili suprotstaviti se jedan drugog. To samo znači da je 3&rsquo kraj jednog oligomera okrenut prema kraju 3&rsquo suprotnog oligomera. Na ovaj način dva oligomera mogu poslužiti kao prajmeri za produženje replikacije oba lanca dvolančane ciljne DNK sekvence. Pogledajte link ispod za dodatna objašnjenja.

Prvi korak u PCR-u je dodavanje oligomernih prajmera ciljnoj DNK iz koje se gen (ili druga genomska sekvenca) treba amplificirati. Smjesa se zatim zagrijava da denaturira ciljnu DNK. Smjesa je ohlađena kako bi se prajmeri omogućili H-vezi za komplementarne ciljne DNK lance. Zatim se dodaju četiri prekursora deoksinukleotida u DNK (dATP, dCTP, dTTP i dGTP) zajedno s malom količinom DNA polimeraze. Novi lanci DNK sada će se produžiti iz oligonukleotidnih početnica na DNK šablona. Da bi se dobilo puno PCR proizvoda, ovaj se reakcijski ciklus mora ponoviti mnogo puta. Stoga se, nakon dopuštanja produženja, smjesa zagrijava da denaturira (odvoji) sve niti DNK. Kad se smjesa ponovo ohladi, oligomeri ponovo pronalaze komplementarne sekvence s kojima se H-veza. Rane verzije PCR -a izvorno su se oslanjale na E. coli DNK polimeraza, koja se inaktivira zagrijavanjem, pa je tako morala biti ponovo dodana u PCR smjesu za svaki ciklus elongacije. Baš kao i kod sekvenciranja DNK, istraživači su vrlo brzo prešli na stabilnu toplinu Taq polimeraza, of Thermus aquaticus. Enzimi od T. aquaticus ostaju aktivni na vrlo visokim temperaturama na kojima ti organizmi žive. Budući da zagrijavanje ne uništava Taq polimerazu in vitro, PCR, kao i reakcije sekvenciranja DNK, mogao bi se automatizirati pomoću programabilnog termocileri povećanu i sniženu temperaturu potrebnu za PCR reakcije. Više nije bilo potrebe za nadopunjavanjem DNK polimeraze nakon što su započeli reakcijski ciklusi. Termocikliranje u tipičnoj PCR amplifikaciji je ilustrovano u nastavku za prva dva PCR ciklusa, od kojih drugi proizvodi prve lančiće DNK koji će se zapravo eksponencijalno pojačati.

Iz ilustracije možete vidjeti da je drugi ciklus PCR-a generirao dva lanca DNA koji će biti uzorci za udvostručavanje i ponovno udvostručavanje željenog proizvoda nakon svakog sljedećeg ciklusa. Tipična PCR reakcija može uključivati ​​30 PCR ciklusa, što rezultira skoro eksponencijalnom amplifikacijom željene sekvence.

Počevši s parom komplementarnih molekula ciljane DNK (nakon 3. PCR ciklusa), koliko bi dvolančanih PCR proizvoda teoretski trebali imati na kraju svih 30 PCR ciklusa?

Amplificirani proizvodi proizvoda PCR amplifikacije su u tolikom izobilju da se lako mogu vidjeti pod fluorescentnim osvjetljenjem na agaroznom gelu obojenom etidijum bromidom (ispod).

U ovom gelu, prva traka (lijevo) sadrži a DNK merdevine, mješavina DNK poznatih dužina koja se može koristiti za procjenu veličine PCR fragmenata u 3. i 4. stazi (gel traka pored ljestvica je prazna). Dvije svijetle trake u stazama 3 i 4 su PCR proizvodi generirani sa dva različita para oligomernih prajmera. PCR -om pojačane DNK se mogu sekvencirati i koristiti u mnogim narednim studijama.


Amplifikacija cijelog genoma (WGA)

Većina ćelija sadrži samo jednu ili nekoliko kopija svog genoma, čineći pikograme DNK, što nije dovoljno za direktnu analizu sa trenutnim tehnologijama sekvenciranja. Ispitivanje jednostanične DNK za dijagnostiku, što može zahtijevati višestruke eksperimente s ograničenim uzorkom, također zahtijeva brzo nepristrano pojačavanje DNK. Istraživanje drevne DNK, koja je često fragmentirana, predstavlja još jednu vrstu izazova. Ovo su područja u kojima se koristi tehnologija izotermičkog pojačanja za povećanje DNK materijala potrebnog za nizvodnu analizu.

Za povećanje količine ograničenih DNK meta, izotermna amplifikacija cijelog genoma (WGA) je najefikasnija tehnika.[3] Ovo je posebno korisno u istraživanju genetskih bolesti, gdje je potrebno mnogo ponavljanja. DNK amplificirana pomoću WGA koristi se za nizvodno sekvenciranje sljedeće generacije, Sanger sekvenciranje, genotipiziranje s mikropokretima i genotipizaciju jednonukleotidnog polimorfizma (SNP). Razvijene su različite WGA tehnike koje se razlikuju i po protokolima i po jednostavnosti upotrebe.

Phi29 DNK polimeraza je glavni enzim izbora za WGA. Thermo Scientific također nudi i poboljšana EquiPhi29 DNA polimeraza, koji je vlasnički Phi29 mutant DNK polimeraze razvijen kroz in vitro evolucija proteina.[5] Ovaj enzim je značajno superiorniji u odnosu na Phi29 u termostabilnosti proteina, brzini reakcije, prinosu proizvoda i pristranosti umnožavanja. Štaviše, zadržava sve prednosti enzima divljeg tipa, uključujući visoku procesivnost (do 70 kb), snažno istiskivanje niti i 3'-5 'egzonukleazu (lektorisanje). Iz tog razloga, preporučuju se nasumični prajmeri otporni na egzo. Tabela 3 uspoređuje klasične DNA polimeraze Phi29 i EquiPhi29.

Tabela 3. Poređenje Phi29 i EquiPhi29 DNK polimeraza s pratećim podacima.

DNK polimeraze tipa Phi29EquiPhi29 DNA polimeraza
Procesivnost/pomicanje nitiVisoka (do 70 kb)Visoko (do 70 kb)
Optimalna temperatura pojačanja30-37 ° C42-45 ° C
Vrijeme reakcijeSporo - do 12hSporo – do 3h
Lektura3'– 5 '(niske stope grešaka)3'– 5 '(niske stope grešaka)
PreciznostVisoka (niske stope grešaka)Visoka (niska stopa grešaka)
PrinosVisokoVeoma visoko
Pristrasnost sekvence (preference)Nisko pristrasno, jednolično pojačanje dugih fragmenata (cijeli genom)Vrlo niska pristranost, uključujući GC i AT bogate (podaci vrijede za 0,5 ng početnog materijala)

Kako radi PCR?

PCR oponaša ono što se dešava u ćelijama kada se DNK kopira (replicira) prije diobe ćelije, ali se provodi u kontroliranim uvjetima u laboratoriji. Mašina koja se koristi se jednostavno naziva PCR mašina ili termocikler. Epruvete koje sadrže mješavinu DNK od interesa stavljaju se u mašinu i mašina mijenja temperaturu tako da odgovara svakom koraku procesa.

Standardni sastojci u mešavini su:

  • DNK segment od interesa
  • specifični prajmeri
  • enzim DNA polimeraze otporan na toplinu
  • četiri različite vrste nukleotida DNK
  • soli potrebne za stvaranje prikladnog okruženja za djelovanje enzima.

Lančana reakcija polimeraze

Tehnika korištena u molekularnoj biologiji, lančana reakcija polimeraze (PCR) omogućava naučnicima da izoliraju, karakteriziraju i proizvedu velike količine specifičnih komada DNK iz vrlo malih količina polaznog materijala. Određeni komad DNK se više puta kopira, što rezultira ogromnim pojačanjem početnog materijala koji se inače ne bi mogao otkriti. Tehniku ​​je 1983. razvio američki biohemičar Kary B. Mullis, koji je za svoj izum 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za hemiju. Praktična primjena PCR -a revolucionirala je biologiju. Do 1990. godine ova tehnika se koristila za dijagnosticiranje prenatalnih i postnatalnih genetskih bolesti, zaraznih bolesti (kao što je AIDS) i raka i za pomoć primaocima transplantata u odnosu na donatore. PCR je zaposlen u projektu humanog genoma. Takođe se koristi za proučavanje ljudske genetske istorije i evolucije vrsta i pomaže forenzičarima sa DNK otiskom prstiju.


Lančana reakcija polimeraze

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je glavni alat u molekularnoj biologiji koji omogućava brzu replikaciju DNK. Omogućava brzo i precizno dupliranje DNK niske kvalitete, međutim, zahtijeva poznavanje ciljnog područja i njegove sekvence te može replicirati druge genome ako su zagađivači.

Tehniku ​​je osnovao Kary Mullis 1980 -ih, navodno zamislivši tu ideju dok je bio na kampovanju.

onlinebiologynotes.com

Denaturacija – obično 1 minut

Da bi se pokrenula reakcija, DNK se prvo mora denaturirati – to se radi oko 94-96°C – ovo otvara DNK što znači da će se DNK bogata G-C “lepiti” zajedno duže od DNK bogate A-T. Na ovoj temperaturi potrebna je bakterijska polimeraza iz toplih izvora. Polimeraza bakterije thermus aquaticus (Taq) ima poluživot 1,6 sati na 95 °C. To znači da može izdržati ovu visoku temperaturu i i dalje ostati aktivan razgovor ako se pojavi u kratkom vremenskom periodu.

Ovaj početni korak znači da možemo koristiti DNK niske kvalitete.

Žarenje – obično 1 minut

Prajmeri su obično duži ili jednaki 18 nukleotida, temperatura topljenja lanca i prajmera DNK mora biti blizu i blizu područja interesa koje želimo primijeniti.

Tokom faze žarenja, prajmer se veže za DNK, iz tog razloga se temperatura snižava na 60 °C.

Elongation – obično 1 minut

Produženje je ono što nam omogućava da udvostručimo DNK u svakoj sljedećoj rundi. DNTP -ovi#8217 dodaju se Taq polimerazom u 5 ′ do 3 ′ redoslijedu. Optimalna temperatura za Taq polimerazu je 72 °C, omogućavajući mu da doda približno 1000 baza u minuti u DNK lanac. Stoga se reakcija provodi na 72 °C.

Ova sekvenca se često ponavlja 30 do 40 puta u zavisnosti od toga koliko je pojačanje DNK potrebno.

Objasnite izbor određene temperature za svaku fazu PCR reakcije.

Navedite reaktante potrebne za PCR reakciju i koje su njihove funkcije.


PCR procedura

Inicijalizacija

Ovaj korak je neophodan samo za DNK polimeraze koje zahtijevaju PCR s vrućim startom. Reakcija se zagrijava na između 94 i 96 ° C i drži 1-9 minuta.

Denaturacija

Ako procedura ne zahtijeva inicijalizaciju, prvi korak je denaturacija. Reakcija se zagrijava na 94-98 ° C 20-30 sekundi. Vodonične veze DNK šablona su poremećene i stvaraju se jednolančani molekuli DNK.

Žarenje

Temperatura reakcije je niža na između 50 i 65 ° C i održava se 20-40 sekundi. Prajmeri se žare na šablon sa jednolančanom DNK. Temperatura je izuzetno važna tokom ovog koraka. Ako je prevruće, prajmer se možda neće vezati. Ako je previše hladno, prajmer se može nesavršeno vezati. Dobra veza nastaje kada se niz prajmera blisko podudara sa šablonom.

Ekstenzija/izduženje

Temperatura u ovom koraku varira ovisno o vrsti polimeraze. DNK polimeraza sintetizira potpuno novi lanac DNK.

Final Elongation

Ovaj korak se izvodi na 70-74 °C tokom 5-15 minuta nakon završnog PCR ciklusa.

Final Hold

Ovaj korak nije obavezan. Temperatura se održava na 4-15 ° C i ubrzava reakciju.


Lančana reakcija polimeraze

In vitro sredstva za značajno pojačavanje kopija specifičnih DNK segmenti, do nekoliko kilobaze u dužini.

Legenda o figuri: Lančana reakcija polimeraze kao što se dešava u a termocikler. Više temperature denatura the DNK (kao što je prikazano strelicama) dok niže temperature dozvoljavaju polimerizacija. Krećući se s lijeva na desno, rezultat je doslovno jedan eksponencijalno povećanje u iznosu od DNK prisutan, iako na račun jednog prajmer zajedno sa bezbroj dNTP po rundi polimerizacija. Dakle, postoje ograničenja koliko DNK mogu se proizvesti u jednoj seriji unutar jedne cijevi (a cijevi su obično male jer je lakše grijati i hladiti male količine u odnosu na veće). Imajte na umu da kao što je prikazano ovo nije reprezentacija a gel. Umjesto toga, vrijeme teče slijeva nadesno dok DNK akumulira se od vrha do dna.

Lančana reakcija polimeraze može se posmatrati kao alternativa kloniranju gena kao sredstvo za amplifikaciju DNK, kao sredstvo za povećanje količine inače vrlo rijetke DNK (kao što se može naći na mjestu zločina ili u drevnim kostima), ili kao sredstva za stvaranje relativno velikih količina DNK kao prethodnika kloniranja gena.


DNK polimeraze

DNK polimeraze su kritične komponente u PCR-u, budući da sintetiziraju nove komplementarne niti iz jednolančanih DNK šablona. Sve DNK polimeraze poseduju 5′→ 3′ polimerazu aktivnost, što je inkorporacija nukleotida za proširenje prajmera na njihovim 3′ krajevima u smeru od 5’ do 3’ (Slika 2).

U ranim danima PCR-a, Klenow fragment DNK polimeraze I iz E. coli korišten je za stvaranje novih kćeri niti [3]. Međutim, ovo E. coli Enzim je osjetljiv na toplinu i lako se uništava pri visokim temperaturama denaturiranja koje prethode koracima žarenja i produžavanja. Dakle, enzim je trebalo nadopunjavati u koraku žarenja svakog ciklusa tokom cijelog procesa.

Otkriće termostabilnih DNK polimeraza pokazalo se kao važan napredak, otvarajući ogromne mogućnosti za poboljšanje PCR metoda omogućavajući dugoročnu stabilnost reakcija. Jedna od najpoznatijih termostabilnih DNK polimeraza je Taq DNK polimeraza, izolirana iz termofilne bakterijske vrste Thermus aquaticus 1976. godine [5,6]. U prvom izvještaju iz 1988. [7], istraživači su pokazali Taq Zadržavanje aktivnosti DNA polimeraze iznad 75 ° C, omogućavajući kontinuirani ciklus bez ručnog dodavanja svježeg enzima, i na taj način omogućava automatizaciju radnog procesa. Nadalje, u poređenju sa E. coli DNK polimeraza, Taq DNK polimeraza proizvodi duže PCR amplikone s većom osjetljivošću, specifičnošću i prinosom. Iz svih gore navedenih razloga, Taq DNK polimerazu je časopis proglasio „molekulom godine“ Nauka 1989. godine [8].

Slika 2. DNK polimeraza koja se proteže na 3′ kraj PCR prajmera u pravcu 5′ do 3′.

Iako Taq DNK polimeraza je značajno poboljšala PCR protokole, ali je enzim ipak imao neke nedostatke. Taq DNK polimeraza je relativno nestabilna na 90 ° C tokom denaturacije lanaca DNK. Ovo je posebno problematično za šablone DNK s visokim sadržajem GC -a i/ili jakim sekundarnim strukturama koje zahtijevaju više temperature za odvajanje. Enzim takođe nema lektorsku aktivnost, stoga, Taq DNK polimeraza može pogrešno inkorporirati nukleotide tokom amplifikacije. Tamo gdje je tačnost sekvence kritična, PCR amplikoni sa greškama nisu poželjni za kloniranje i sekvenciranje. Osim toga, priroda sklona greškama Taq DNK polimeraza doprinosi nemogućnosti da pojača fragmente duže od 5 kb općenito. Da bi se prevladali takvi nedostaci, DNK polimeraze se kontinuirano razvijaju kako bi se iskoristila moć PCR-a u različitim biološkim primjenama (saznajte više o karakteristikama DNK polimeraze).

Video: Brzi PCR enzim

Postignite 4 puta bržu sintezu DNK, žarite prajmere na 60 ° C i unesite uzorke direktno na gelove nakon PCR -a, koristeći Invitrogen Platinum II Taq Hot-Start DNK polimeraza.


Pogledajte video: Nested PCR (Decembar 2022).