Informacije

Ukloniti RNAzu iz pipeta?

Ukloniti RNAzu iz pipeta?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Naša laboratorija koristi stare Gilson Pipetman pipete. Koristio sam neke za pravljenje mRNA in vitro transkripcijom i počeo da nailazim na probleme sa RNAzom. Pokušavam sve očistiti, uključujući i pipete. Nisam siguran da se ove stare pipete mogu autoklavirati, barem ne u jednom komadu, mislim da ih mogu rastaviti i autoklavirati dijelove koji bi mogli dodirnuti rješenja. Postoji li neki način za učinkovito ispiranje pipeta i uklanjanje svih RNAza?

Koristim kutije sa zaštitnim barijerama bez RNAze, radim sav posao na novim komadima aluminijske folije, koristim komercijalnu vodu bez RNAze, rukavice, laboratorijski mantil, masku za lice itd. Međutim, prinosi iz kompleta za transkripciju in vitro su smanjeni, a prinosi iz tailing kit su još gori, ponekad gube 90% RNK. Mogu učiniti samo toliko, naša zgrada je stara i puna prašine, a proklete cijevi iznad mog radnog stola cure (sve cijevi cure, imale su 2 velika pucanja cijevi u posljednjih 6 mjeseci).

Vjerovatno ću morati nabaviti nove komplete. Moram samo dokazati svom savjetniku da su kompleti kontaminirani.


Prema Gilson Pipettman korisničkom priručniku, možete autoklavirati sljedeće dijelove: izbacivač vrha, držač vrha i spojnu maticu (pogledajte gornji PDF ako niste sigurni u dijelove). Svi ostali dijelovi ne mogu se autoklavirati. Gilson kaže da se mogu koristiti sljedeći uslovi (stranica 17 u korisničkom vodiču): Autoklavirati 20 minuta na 121°C, 0,1 MPa.

Međutim, kada zaista imate kontaminaciju DNK -om, nećete je se riješiti autoklaviranjem, jer su RNAze previše stabilne. Možete isprobati različita rješenja na tržištu koja su namijenjena ubijanju RNAza ili jednostavno nabaviti novi set pipeta koji se koristi samo za rad s RNK (na drugoj klupi u drugoj laboratoriji sa potpuno drugačijim i svježim setom kemikalija i plastičnog posuđa) . I preporučio bih savjete za filtere za ovaj posao. Oni su skuplji, ali dugoročno će uštedjeti novac jer ne morate ponavljati eksperimente.

Što se tiče vaših pipeta koje cure: Pipete sadrže gumene prstenove i teflonske brtve iznutra koje je potrebno povremeno mijenjati. Donja slika prikazuje kako se (dijelovi C i D), prsten može kupiti od Gilsona. Ako ne znate kako izvesti ovaj posao (a nemate tehničara koji to radi), također možete poslati pipete na servis. Ovo košta malo novca, ali je mnogo bolje nego koristiti nepouzdane pipete koje cure.

I ne brinite, Gilsonove pipete su prilično dobre. Sada sam koristio manje-više sve brendove na tržištu i još uvijek ih preferiram. Potrebna im je samo neka usluga s vremena na vrijeme.


Pripremite epruvete za uzorke

Upotrijebit ćete epruvete od 1,5 ml za vađenje uzoraka DNK iz pljuvačke.

Za početak pripremite svaku epruvetu tako što ćete je označiti trajnim markerom.

Čak i ako imate samo jedan uzorak, dobra je praksa jasno označiti epruvetu. Na primjer, ako je uzorak od neke osobe, možete koristiti njene inicijale. Takođe je dobra ideja označiti datum uzorka.

Pripremite fiziološki rastvor

Trebat će vam slana voda (fiziološki rastvor) kao sredstvo za ispiranje usta za prikupljanje ćelija obraza.

U manjoj ili sličnoj čaši pomiješajte prstohvat kuhinjske soli s vodom. Čaša je savršena za ovo. Mjerenja ne moraju biti tačna. Malo soli za mali gutljaj vode dobro je pravilo.

Ne morate mnogo zaraditi,#8211 mali gutljaj je dovoljan.

Zašto slana voda? U ovom protokolu cilj je uzeti uzorak DNK iz ćelija obraza. Vaša pljuvačka, nakon ispiranja usta, prirodno će sadržati ćelije obraza, koje će se tijekom protokola otvoriti kako bi se oslobodila DNK. Sol, tj. natrijum hlorid, koristi se za stabilizaciju DNK nakon što se oslobodi.

Ispiranje usta

Sipajte slanu vodu u usta. Nemojte koristiti previše, dovoljan je samo mali gutljaj. Intenzivno ispirajte unutrašnje obraze 30-60 sekundi. Kada završite, ispljunite fiziološki rastvor u novu čašu. (ili, ako je čaša koju ste koristili za miješanje slane vode prazna, možete je ponovo koristiti).

Cilj ovog koraka je da oslobodite što više ćelija iz usta. Možete koristiti zube da nežno stružete obraze i jezik dok vrtite slanu vodu u ustima. Jezikom možete dodirnuti i unutrašnje obraze. Pazite da se ne ozlijedite – nema potrebe za krvlju, samo slina s puno ćelija obraza.

Prenesite svoj uzorak u epruvetu za mikrocentrifugu

Za ovaj korak ćete koristiti svoj uzorak pljuvačke (1), cijev za mikrocentrifugu koju ste označili na početku (2), i pipetu za prijenos (3).

Koristite pipetu za prijenos da prenesete svoj uzorak pljuvačke u epruvetu za mikrocentrifugu. Napunite ga do oznake od 1,5 ml.

Centrifuga

Vrijeme je za korištenje centrifuge. Ovo će koristiti gravitacijsku silu za koncentriranje uzorka.

Stavite epruvetu za centrifugiranje sa uzorkom sline u centrifugu. Uravnotežite centrifugu s drugim uzorkom ili s drugom protuutegom.

Ako imate samo jedan uzorak, najlakši način za uravnoteženje centrifuge je napuniti drugu epruvetu vodom i upotrijebiti je za balansiranje.

Upotreba centrifuge na neuravnotežen način je opasna i pokvariće uređaj. Slijedite naše savjete za balansiranje centrifuge u priručniku ovdje. U ovom slučaju, na primjer, možete koristiti drugi uzorak kao protuvagu ili napuniti drugu epruvetu vodom. Cijevi uvijek moraju biti balansirane s drugom cijevi iste težine.

Kada se epruveta za uzorak uravnoteži u rotoru centrifuge, zatvorite poklopac i aktivirajte modul centrifuge. Postavite brzinu na 4.000G i okrećite se 90 sekundi.

Oporavak peleta

Nakon završetka centrifugiranja provjerite epruvetu za uzorak. Sve ćelije obraza sada treba koncentrirati u malu bijelu kuglu na dnu cijevi (1). Ovo se zove a pelet. Preostala tečnost (2), nazvan supernatant, trebalo bi da bude jasno.

U ovom koraku ćete ukloniti supernatant, tako da ostaje samo bijeli pelet.
Provjerite je li vaš pelet čvrsto pričvršćen za dno cijevi. Ako jeste, možete pažljivo odliti supernatant.

Ako kuglica nije čvrsto pričvršćena za dno epruvete, pokušajte ponovo da okrenete uzorak u centrifugi da biste ga pričvrstili na dno epruvete. Ako ostane labav, možete upotrijebiti mikropipetu sa svježim vrhom za polagani prijenos supernatanta iz epruvete. Također možete pokušati koristiti pipetu za prijenos koju ste ranije koristili, ali može biti teško kontrolirati i može na kraju poremetiti pelet.

Resuspendiranje peleta

Sada biste trebali imati bijeli pelet u epruveti za uzorak. Trebala bi biti otprilike veličine glave šibice.

Ako je vaš pelet manji od glave šibice, možda vam neće biti dovoljno obraza da dobijete koncentrirani uzorak DNK. U tom slučaju, vratite se na korak 2 da koncentrišete dodatne ćelije obraza iz pljuvačke. Možete koristiti istu epruvetu za uzorke i jednostavno dodati još uzorka u postojeći pelet.

Kada dobijete dovoljno veliku kuglicu, možete resuspendirati ćelije u preostalu tekućinu koja je još uvijek u epruveti. Sada imate koncentrirani uzorak ćelije u maloj količini tečnosti.
Uvjerite se da je cijev zatvorena, a zatim miješajte ćelije iz peleta u tekućinu laganim pritiskom cijevi. Ćelije peleta se sada resuspendiraju u tečnosti.

Transfer

U ovom sljedećem koraku koristit ćete mikropipetu (1) za prijenos resuspendiranog uzorka (2) u PCR epruvetu od 0,2 ml (3), tako da ga možete zagrijati u termocikleru.

Prvo podesite podesivu pipetu na maksimalnu zapreminu od 20 μl.

Uvjerite se da pipeta ima novi vrh pipete. Zatim pomoću pipete prenesite staničnu smjesu uzorka u epruvetu za PCR od 0,2 ml. Nastavite dok PCR epruveta nije skoro puna ili dok vam ne ostane uzorak. Dodajte što je moguće više mješavine ćelija u PCR epruvetu.

Označavanje PCR epruvete

Na kraju, zatvorite poklopac epruvete za PCR i označite epruvetu da identificirate uzorak, slično cijevi za centrifugu.

Označite stranu PCR epruveta, a ne poklopac. PCR mašina ima zagrijani poklopac, tako da bi bilo koje mastilo na poklopcu epruvete moglo otpasti.

Zagrijavanje uzorka

U ovom koraku, termocikler ćete koristiti kao toplinski blok da biste prokuhali ćelije i otvorili ih, kako biste oslobodili DNK u otopinu.

Stavite svoju PCR epruvetu s otopinom ćelije uzorka u blok termociklera.

Postavite termocikler da zagrije uzorak na 99 ° C 10 minuta.

Miješanje uzorka

Nakon zagrijavanja uzorka 10 minuta, ponovo ćemo ga pripremiti za centrifugiranje.

Prvo izvadite PCR cijev iz bloka termociklera.

Blok i grijani poklopac i dalje će biti vrući, stoga budite posebno oprezni.

Lagano pritisnite PCR epruvetu 5 sekundi da biste promiješali uzorak.

Centrifugiranje uzorka

U ovom koraku okrećete uzorak kako biste odvojili supernatant od ostataka ćelije. Sada su ćelije pukle zahvaljujući koraku zagrijavanja, DNK će se osloboditi iz ćelija i plutati u supernatantu.

Molekulska težina DNK je lakša od drugog ćelijskog materijala, poput proteina i ćelijskih zidova. Okretanjem uzorka centrifugom odvajamo ćelijski materijal od DNK, što nam daje čistiji uzorak DNK.

Za okretanje PCR epruvete sa uzorkom (3) u mikrocentrifugi Bento Lab-a, morat ćete koristiti adapter za PCR epruvetu (1) koji se nalazi u normalnoj epruveti za mikrocentrifugu (2) i pretvara ga u PCR cijev.

Ne zaboravite uravnotežiti svoju centrifugu. Dakle, ako radite samo s jednim uzorkom, pripremite drugu PCR epruvetu s količinom vode ekvivalentnoj vašem uzorku.

Postavite centrifugu da radi 90 sekundi na 8kG.

Ako vam je potrebna pomoć u radu centrifuge Bento Lab, pogledajte korisnički priručnik. Kada zatvorite poklopac, odaberite vremenski način (1). Postavite snagu (2) i vrijeme (3) prije potvrde.

Čišćenje uzorka za skladištenje

Nakon centrifugiranja, svi ćelijski ostaci su prisiljeni na dno PCR cijevi (1), ostavljajući samo DNK u tekućem supernatantu (2). Supernatant bi trebao izgledati bistro, poput vode.

Konačno, supernatant ćete prenijeti u novi PCR pomoću mikropipete.

Postavite mikropipetu na 20 μL i stavite novi vrh. Prenesite 40 μL bistrog supernatanta u novu PCR epruvetu.

Budite oprezni kako biste izbjegli pipetiranje ostataka ćelija u novu epruvetu. Prenesite samo bistri tekući supernatant. Izbjegavanje bilo kojeg ćelijskog otpada smanjit će mogućnost interferencije sa uzorkom DNK.

Označavanje i skladištenje

Nova cijev sada sadrži samo DNK u tekućini. Zove se uzorak predloška, a sada se može dalje koristiti za analizu pomoću protokola poput PCR -a.

Ponovo označite epruvetu kako biste mogli identificirati koji je to uzorak predloška.

Konačno, ako uzorak predloška ne koristite odmah u drugom protokolu, pohranite ga u zamrzivač na -20 ° C. Ovo će sačuvati uzorak.

Iako je sama DNK vrlo stabilna, u uzorku još uvijek mogu postojati neki drugi proteini koji će je s vremenom razgraditi. Svrha ovog protokola je da očisti uzorak pljuvačke što je više moguće uz zadržavanje DNK. Čuvanje uzorka u zamrzivaču će usporiti sve reakcije preostalih proteina i stoga će uzorak DNK šablona biti duže sačuvan.


RNase AWAY® i DNA AWAY ™ površinski dekontaminatori, molekularni bioproizvodi

Avantor & reg, kompanija iz Fortune 500, vodeći je globalni dobavljač proizvoda i usluga od kritičnog značaja za klijente u biofarmi, zdravstvu, obrazovanju i industriji amp, te u industriji naprednih tehnologija i pojačala. Naš portfelj se koristi u gotovo svakoj fazi najvažnijih istraživačkih, razvojnih i proizvodnih aktivnosti u industrijama kojima služimo. Jedna od naših najvećih prednosti proizlazi iz globalne infrastrukture koja je strateški locirana da podrži potrebe naših kupaca. Naš globalni otisak omogućava nam opsluživanje više od 225.000 lokacija korisnika i daje nam opsežan pristup istraživačkim laboratorijima i naučnicima u više od 180 zemalja. Pokrenuli smo nauku da stvorimo bolji svijet. Za informacije posjetite www.avantorsciences.com i pronađite nas na LinkedInu, Twitteru i Facebooku.

& kopirajte 2021 VWR International, LLC. Sva prava zadržana.
& kopirajte 2021 FORTUNE Media IP Limited Sva prava zadržana. Koristi se pod licencom.

Ova web lokacija ne podržava vašu verziju programa Internet Explorer. Preporučujemo da nadogradite na Internet Explorer 11 ili neki drugi podržani preglednik i provjerite koristite li IE11 u Način prikaza kompatibilnosti.


Baš kao što je važno očistiti kuhinju nakon kuhanja obroka, laboratorijske radne stolove treba čistiti između upotreba. Čuvanje vašeg laboratorijska klupa clean osigurava da ostaci prljavštine ili drugih materijala ne kontaminiraju buduće projekte. Također možete osigurati da opasne tvari ne završe na pogrešnim mjestima, mogu oštetiti opremu ili nanijeti štetu kolegi.

Opće revizije

Direktori laboratorija bi trebali provjeriti čistoću svojih odjela, ali svi su zaduženi za održavanje radnih mjesta čistima. Osnovna provjera ne mora utjecati na laboratorijske procese, ali bi se trebala raditi s vremena na vrijeme.

  • Prolazi trebaju biti očišćeni od kutija, zaliha ili drugih prepreka.
  • Labave žice, kablovi i računarski kabeli trebaju biti vezani i organizirani.
  • Laboratorijske podove treba brisati barem jednom dnevno
  • Prostirke protiv umora treba redovno mijenjati kako bi se izbjeglo opasno posuđe.
  • Područja za hitne slučajeve, poput stanica za ispiranje očiju, tuševa i aparata za gašenje požara, trebaju ostati neometana u svakom trenutku.
  • Laboratorijske površine treba redovito brisati prašinom i uklanjati nered.
  • Očistite predmete koji možda nisu dio redovnih testiranja ili eksperimenata. Svakodnevno brišite stolice, telefone, računare, tajmere, olovke itd. Kako biste bili sigurni da zaraze nisu slučajno ostavljene.

Dezinfekcija

Zbog upotrebe kemikalija i drugih opasnih materijala koji se koriste u laboratorijima, radne stanice treba više nego organizirati, već ih treba dezinficirati. Dezinfekciju je potrebno izvršiti nakon svakog izlijevanja, kao i nakon svake radne smjene. CDC preporučuje upotrebu deset postotne otopine izbjeljivača kao standard za dezinfekciju, ali za vašu laboratoriju mogu se preferirati drugi proizvodi.

Iako neki proizvođači laboratorijske opreme mogu preporučiti posebna sredstva za čišćenje na svojoj opremi, pobrinite se da su preporučena sredstva za čišćenje učinkovita za materijale i kemikalije koje koristite. Također morate biti svjesni da izbjeljivač može oštetiti neke laboratorijske instrumente. Na kraju, želite koristiti ispravan proizvod za okruženje u kojem radite.

Postupci čišćenja

1. Uvijek koristite odgovarajuću zaštitnu opremu. U najmanju ruku, nosite lateks rukavice i zaštitne naočare. Ako imate dužu kosu, zavežite je.

2. Uklonite labave predmete iz laboratorijska radna stanica . Čaše, epruvete, pipete itd. Treba premestiti i na odgovarajući način oprati.

3. Da biste ispunili minimum, 10 posto izbjeljivača, pomiješajte jedan dio izbjeljivača sa devet dijelova vode. Ovo bi trebalo biti dovoljno za većinu laboratorijskih površina. Istražite svoj specifični materijal stanice u slučaju da je potrebno drugačije rješenje.

4. Umočite papirni ubrus u smjesu i temeljno obrišite površinu radnog stola. Ne zaboravite očistiti uglove, rubove i donje strane. Možda ćete morati upotrijebiti žičanu četku ili neki drugi uređaj za uklanjanje ostataka.

  • Zagrijani materijal kao što je očvrsnuti agar ili drugi proizvodi slični želatini mogu se ukloniti kuhanjem pročišćene vode u opremi.
  • Organski materijali, uključujući i ostatke sapuna, mogu se ukloniti ispiranjem acetonom.
  • Ispiranje etanolom je korisno za sterilizaciju laboratorijske opreme koja zahtijeva uklanjanje svih mikroorganizama prije upotrebe.
  • RNAse Displace dobro funkcionira za opremu koja se koristi u DNK istraživanju.

Održavanje čiste, dezinficirane i uredne radne stanice osigurat će da su vaši eksperimenti i projekti tačni, a vas i vaše kolege zaštititi od štetnih kemikalija. Uvijek je bolje prečistiti nego podčistiti. Iako se većina površina može očistiti otopinom izbjeljivača, provjerite sa svojom opremom zahtjeve i preporuke.

Imate li savjete za održavanje laboratorijske klupe čistom? Podijelite ih u komentarima ispod.


5 sigurnih načina da zeznete ekstrakciju RNK

Rad sa RNK je definitivno stečena vještina. Mnogo je finiji od rada s DNK i zahtijeva pažljivu pažnju prema detaljima kako bi se izbjegla katastrofa putem kontaminacije RNazom. Evo nekoliko uobičajenih načina da izgubite svoju teško stečenu RNK:

1. Ne držite sve na ledu

Održavanje hladne temperature svih vaših reagensa važno je za inhibiranje aktivnosti bilo koje mamljive RNaze. Ako izdvajate RNK iz živih ćelija, u redu je da se ćelije okreću na sobnoj temperaturi, ali čim se liziraju, želite da sve ostane na ledu što je više moguće. Predhlađivanje vaših međuspremnika može pomoći u održavanju uzoraka hladnim tijekom manipulacije – Čak sam čuo da su ljudi hladili svoje pipete i vrhove u hladnoj prostoriji prije rada s osjetljivim uzorcima.

2. Nemojte koristiti#8217t standardne vrhove pipeta

Dobro korištene pipete mogu postati prilično grube na mjestima koja ne biste zamislili – uključujući unutrašnjost cijevi pipete. Zaštitite ovaj otpad od kontaminacije vaših uzoraka pomoću vrhova filtera, koji omogućavaju usisavanje iz pipete, ali blokiraju sve čestice.

3. Ne nosite rukavice

Gole ruke su izvor broj jedan kontaminacije RNase u laboratoriji. Uvijek koristite rukavice pri radu s RNK i ne zaboravite često mijenjati rukavice, posebno nakon što ste dodirnuli nešto drugo. Za komplete ili reagense koji se koriste isključivo za rad na RNK, dobra je ideja staviti rukavice prije nego što otvorite kutiju, kako biste bili dvostruko sigurni da ne uvodite RNaze.

4. Koristite staru/otvorenu kutiju cijevi

"Sterilne" epruvete pohranjene na vašoj klupi često nisu ni približno sterilne kao što biste željeli pomisliti ... pogotovo nakon što ste umočili u svoju zalihu pet ili deset puta. Svaki put kada otvorite kutiju još je jedna prilika za unošenje zagađivača i RNaza. Osim ako nemate izuzetnu sterilnu tehniku, pokušajte koristiti svježu seriju epruveta za bilo koji eksperiment koji uključuje RNK.

5. Nemojte koristiti vodu i reagense bez RNaze

Većina setova za ekstrakciju RNK uključuje vodu bez RNaze za eluciju. Rukujte ovom bocom vode u rukavicama kao što radite sa svakim reagensom namijenjenim za korištenje s RNK. Nemojte doći u iskušenje da sa svoje klupe zgrabite svoju normalnu bocu pufera i#8211 mnogo je bolje biti siguran nego žaliti. Nekoliko kompanija također nudi sprejeve za inhibitore RNase koji se mogu koristiti za čišćenje vaše klupe i rukavica prije nego što započnete delikatan eksperiment.


Amerike

Stranica će biti prikazana na engleskom jeziku.

Koristimo ove kolačiće kako bismo osigurali da naša web stranica funkcionira sigurno i ispravno, neophodni su za funkcioniranje naših usluga i ne mogu se isključiti u našim sustavima. Obično se postavljaju samo kao odgovor na vaše radnje koje predstavljaju zahtjev za usluge, poput prijavljivanja, korištenja košarice za kupovinu ili popunjavanja obrazaca. Možete postaviti svoj pretraživač da blokira ili vas upozorava na ove kolačiće, ali neki dijelovi naših usluga neće raditi bez njih. Kao i drugi kolačići koje koristimo, strogo potrebni kolačići mogu biti kolačići prve strane ili kolačići treće strane.

Koristimo ove kolačiće da zapamtimo vaše postavke i preferencije. Na primjer, ove kolačiće možemo koristiti za pamćenje vaših jezičkih postavki.
Dozvoli preferirane kolačiće

Koristimo ove kolačiće za prikupljanje informacija o načinu na koji komunicirate s našim uslugama te za njihovo mjerenje i poboljšanje. Na primjer, možemo koristiti ove kolačiće da utvrdimo da li ste bili u interakciji s određenom stranicom.
Dozvoli kolačiće učinka/statistiku

Mi i naši partneri u oglašavanju koristimo ove kolačiće za isporuku oglasa, kako bi vam bili relevantniji i značajniji te za praćenje efikasnosti naših reklamnih kampanja, kako na našim uslugama, tako i na drugim web stranicama i društvenim medijima.
Dozvoli marketinške kolačiće


2.1: Pravilna upotreba mikropipeta

  • Doprinos Clare M. O & rsquoConnor
  • Vanredni profesor emeritus (biologija) na Bostonskom koledžu

Vjerovatno, najvažnija naučna oprema koju ćete koristiti u ovoj klasi su podesive mikropipete, koje ćete koristiti u gotovo svakom eksperimentu. Mikropipete su precizni instrumenti koji su dizajnirani za tačnoi preciznozapremine prijenosa u rasponu mikrolitara. Možete koristiti mikrolitre ili mililitre kao jedinice volumena u svojim laboratorijskim bilježnicama i laboratorijskim izvještajima, ali budite oprezni da uvijek navedete jedinicu volumena koju koristite. Prisjetite se odnosa između jedinica volumena:

Tačnost i preciznost

Preciznost zavisi od mikropipete koja daje ispravan volumen. Precizni rezultati
su ponovljivi. Dozvolite & rsquos -u da koristi ciljnu analogiju da pokaže razliku između tačnih i preciznih rezultata. Zamislite da četiri učenika pokušavaju pet puta pogoditi metak. Učenici A i B su precizni, dok su učenici A i C precizni.

Proizvođači određuju tačnost i preciznost mikropipeta koristeći ih za prenošenje određenih količina destilovane vode u kap koja se zatim važe na analitičkoj vagi. Gustina vode je 1,0 gram po mL na 25 ̊C. Proces se ponavlja nekoliko puta tokom procesa kalibracije, a podaci se koriste za izračunavanje tačnosti i preciznosti mikropipete.

Tačnost se odnosi na performanse mikropipete u odnosu na standardnu ​​(namjeravanu) vrijednost. Tačnost se računa iz razlike između stvarne zapremine koju ispušta mikropipeta i predviđene zapremine. Imajte na umu da ovo može biti negativno ili pozitivno
vrijednost. Kada se mikropipete kalibriraju, točnost se obično izražava kao postotak
odabranu vrijednost. Mikropipete su dizajnirane za rad s točnošću unutar nekoliko posto (općenito & lt3%) od predviđene vrijednosti. Tačnost mikropipete se donekle smanjuje kada su mikropipete podešene da isporučuju zapremine blizu najnižih vrednosti u svom opsegu.

Preciznost pruža informacije o ponovljivosti, bez ikakvog pozivanja na standard. Preciznost odražava slučajne greške koje se nikada ne mogu u potpunosti eliminirati iz procedure. Stoga bi niz ponovljenih mjerenja trebao generirati normalnu ili binomsku distribuciju (suprotno). Preciznost se izražava kao standardna devijacija (i) skupa mjerenja. U normalnoj distribuciji,

2/3 mjerenja će pasti unutar jedne standardne devijacije prosjeka ili srednje vrijednosti (x), a 95% mjerenja će biti unutar dvije standardne devijacije srednje vrijednosti. Standardna devijacija za skup n mjerenja se izračunavaju pomoću formule ispod.

Odabir mikropipete

Standardna devijacija opisuje raspodjelu mjerenja u odnosu na srednju vrijednost

U laboratoriji koristimo tri različite veličine mikropipeta, P20, P200 i P1000. Naše mikropipete su kupljene od nekoliko različitih proizvođača, ali principi rada su isti. Brojevi iza &ldquoP&rdquo odnose se na maksimalan broj mikrolitara za koje je mikropipeta dizajnirana da prenese. Imajte na umu da postoji neko preklapanje u rasponima različitih mikropipeta. Na primjer, i P200 i P20 se mogu koristiti za prijenos 15 &mul, ali P20 je precizniji unutar tog raspona. Općenito, uvijek odaberite pipetu najmanjeg volumena koja će prenijeti volumen.

Određivanje volumena prijenosa

Na indikatoru jačine zvuka postoje tri broja. Za svaku mikropipetu ćete podesiti jačinu zvuka na tri cifre okretanjem dugmeta za podešavanje jačine zvuka. Također ćete moći ekstrapolirati između najnižih brojeva s oznakama nonija na donjem brojčaniku. Većina mjerenja koja ćete napraviti s mikropipetama bit će točni do četiri značajne brojke!

NIKAD okrenite indikator preko gornje ili donje granice volumena mikropipete! To može oštetiti klip.

​​​​Prenos tomova precizno

Mikropipete rade istiskivanjem zraka. Operater pritiska klip koji pomiče unutrašnji klip u jedan od dva različita položaja. Prvi graničnik se koristi za punjenje vrha mikropipete, a drugi graničnik se koristi za doziranje sadržaja vrha. Kako rukovalac pritisne klip do prvog zaustavljanja, unutrašnji klip istiskuje zapreminu vazduha jednaku zapremini prikazanoj na točkićima indikatora zapremine. Drugi graničnik se koristi samo za ispuštanje sadržaja vrha.

Punjenje mikropipete

  • Skinite poklopac s kutije koja sadrži vrhove mikropipeta odgovarajuće veličine. P-1000 vrhovi mogu biti plavi ili prozirni, dok su vrhovi P-20 i P-200 žuti ili prozirni.
  • Pričvrstite vrh tako što ćete ubaciti dršku mikropipete u vrh i čvrsto pritisnuti (slika desno). To bi trebalo dovesti do hermetičkog zatvaranja između vrha i vratila mikropipete.
  • Vratite poklopac kutije s vrhovima kako bi preostali vrhovi bili sterilni. Izbjegavajte dodirivanje vrha (posebno tanji kraj), jer su vrhovi sterilni.
  • Pritisnite klip mikropipete do PRVOG graničnika.
  • Uronite vrh nekoliko milimetara ispod površine otopine koja se uvlači u

pipeta. Pipetiranje je najpreciznije kada se pipeta drži okomito. Držite ugao manji

od 20 ̊ od vertikale za najbolje rezultate.

da je puna zapremina uzorka ušla u vrh. NE dozvolite da klip pukne. Ovo je posebno važno pri prijenosu većih količina, jer prskanje može kontaminirati osovinu mikropipete. Ako nenamjerno kontaminirate vratilo, odmah ga očistite vlažnim Kimwipe-om.

NIKADA ne stavljajte mikropipetu sa tečnošću u vrh na klupu!

Doziranje sadržaja mikropipete


Sadržaj eseja:

  1. Esej o otkriću enzima
  2. Esej o restrikcijskom enzimu endonukleaze
  3. Esej o enzimima ligaze
  4. Esej o enzimu alkalne fosfataze
  5. Esej o enzimu fosfonukleotid kinaze
  6. Esej o S1 nukleaznom enzimu
  7. Esej o DNK polimerazi I: Holoenzim
  8. Esej o DNK polimerazi I: Klenowov fragment
  9. Esej o enzimu T4 DNK polimeraze
  10. Esej o enzimu Taq DNA polimeraze
  11. Esej o Ribonukleazi
  12. Esej o deoksiribonukleazi I (Dnase I)
  13. Esej o terminalnom enzimu deoksinukleotidil transferaze
  14. Esej o enzimu reverzne transkriptaze

Esej # 1. Otkriće enzima:

Genetski inženjering je rođen jer su naučnici naučili manipulirati DNK. Ova vještina je izvedena uglavnom iz polja enzimologije nukleinskih kiselina. Prije 1970. godine jednostavno nije postojala tehnika za rezanje dupleksne (dvolančane) molekule DNA na različite fragmente. Otkriće enzima za metabolizam DNK omogućilo je naučnicima da predlože i iniciraju genetski inženjering.

Sve vrste DNK istraživanja razvile su se iz sposobnosti rezanja molekula DNK u definiranim redoslijedima. Drugim riječima, zasnovano je na otkriću enzima restrikcijske endonukleaze tipa II.

Izolacija prvih enzima restrikcijske endonukleaze, kao što su Hind II i Hind III, bila je rezultat zanimljivog otkrića Hamiltona O. Smitha i njegovih saradnika (1971.) da ekstrakti Haemophilus influenze sadrže aktivnosti koje seku velike molekule DNK u definirane fragmente.

H. influenza je nepokretna, gram-negativna, fakultativna, anaerobna, patogena bakterija u obliku štapića koja je povezana s respiratornim infekcijama ljudi, konjunktivitisom i meningitisom.

Smithovo otkriće dovelo je do istraživanja rekombinantne DNK. Osim toga, razvila se čitava industrija s glavnom svrhom otkrivanja, karakterizacije, pročišćavanja i marketinga preko 100 različitih restrikcijskih enzima specifičnih za određenu lokaciju.

Okupljanje fragmenata DNK u kovalentno povezane himerne molekule osnova je istraživanja rekombinantne DNK. Ovaj korak je bitan u genetskom inženjeringu. To se postiže ligacijom koju katalizira DNA ligaza, enzim koji je otkriven mnogo prije enzima restrikcija.

Prije 1970. postojala je centralna dogma u molekularnoj biologiji da se genetski prijenos informacija dogodio s DNK na RNK, a zatim na protein. Dokaz da je došlo do prijenosa informacija RNK u DNK temelji se na otkriću i karakterizaciji enzima reverzne transkriptaze od strane Temin i Baltimore (1970).

Enzim reverzne transkriptaze omogućava naučnicima da generiraju DNA kopije (cDNA) mRNA nakon kloniranja. Generacija cDNA, koja sadrži informacije koje kodiraju izravne proteine, normalan je korak u kloniranju eukariotskih gena.

U stvari, najrevolucionarniji i najjednostavniji molekularno biološki tehnički razvoj je PCR (tj. lančana reakcija polimeraze). PGR je direktna primjena DNA polimeraze kako bi se omogućilo binomsko pojačavanje epruvete specifičnim sekvencama DNK.

Otkriće restrikcijskih enzima tipa II pokazalo je ogromnu moć i korisnost reagensa za cijepanje DNK specifičnih za određeno mjesto. Ovaj članak se bavi restrikcionim enzimima i drugim korisnim enzimima koji se obično koriste u genetskom inženjeringu (Tabela 55.1).

Esej # 2. Enzim za restrikciju endonukleaze:

Restrikcijske endonukleaze (RE) su posebna klasa endonukleaza koje cijepaju molekule DNK samo na specifičnim nukleotidnim sekvencama, koje se nazivaju restrikcijska mjesta. Ove specifične sekvence imaju četiri do šest nukleotida.

Tetranukleotidna sekvenca će se češće pojavljivati ​​u datoj molekuli nego heksanukleotid, pa će enzim koji prepoznaje tetranukleotidnu sekvencu proizvesti više fragmenata. Na ovim restrikcijskim mjestima, restrikcijske endonukleaze sijeku DNK cijepanjem dvije fosfodiestarske veze po jednu unutar svakog lanca dvolančane DNK.

Termin ‘restrikciona endonukleaza’ skovali su Lederberg i Meselson (1964) kako bi opisali enzime nukleaze koji uništavaju (‘restrikciju’) bilo koju stranu DNK koja ulazi u ćeliju domaćina. Međutim, prvi restrikcijski enzim endonukleaze koji je izoliran i proučen bio je E. coli K12 Meselsona i Yuana (1968). Sada su ti enzimi razvrstani u tri različite vrste, tip I, tip II i tip III.

Otkriće ovih enzima dovelo je do Nobelove nagrade za W. Arbera, H. Smitha i D. Nathansa 1978. U tehnologiji manipulacije genima, enzimi restrikcijske endonukleaze popularno se nazivaju molekularni noževi, molekularne škare ili molekularni skalpeli.

Dok je precizno rezanje molekula DNK vrlo korisno za kloniranje DNK, njegov puni potencijal se pokazuje samo kada se proizvedeni fragmenti spoje zajedno kako bi se dobila nova struktura, poznata kao rekombinantna DNK. Ovo spajanje ili vezivanje postiže se upotrebom enzima DNA ligaze.

Najčešći enzim ligaze izoliran je iz bakterijskog virusa (tj. T4 bakteriofag). Dakle, DNK ligaze formiraju grupu enzima koji posreduju u žarenju, zatvaranju ili spajanju fragmenata DNK. Enzimi ligaze prvenstveno su uključeni u popravak molekula DNK gdje dolazi do zaptivanja ili sjedinjavanja fragmenata DNK.

DNA ligaze također igraju aktivnu ulogu u procesima poput replikacije i rekombinacije DNK. Ovi enzimi se široko koriste u genetskom inženjeringu za proizvodnju hibridne DNK. Budući da se enzimi ligaze pridružuju fragmentima DNK ili zatvaraju zareze u lancu, oni se nazivaju molekularne strukture.

Aktivnost enzima DNA ligaze:

(i) Ligacija molekula DNK ljepljivim ili kohezivnim krajevima:

Ako se dva različita pripravka DNA tretiraju istim restrikcijskim enzimom kako bi se dobili fragmenti s ljepljivim krajevima, ti krajevi će biti identični u oba pripravka. Dakle, kada se dva seta fragmenata DNK pomiješaju, uparivanje baza između ljepljivih krajeva će rezultirati spajanjem fragmenata koji su izvedeni iz različitih molekula.

Takođe će doći do uparivanja fragmenata izvedenih iz istog molekula. Takvo uparivanje je privremeno, zbog slabosti vodikove veze između nekoliko baza na ljepljivim krajevima.

Uparivanje se može stabilizirati upotrebom DNA ligaze, koja tvori kovalentnu vezu između 5 ′-fosforila na kraju jedne niti i 3 ′-hidroksila susjedne niti. Enzim polinukleotidne ligaze T4 bakteriofaga katalizira spajanje kraja na kraj DNK dupleksa na baznom uparenom kraju. Ova reakcija se može pojaviti intermolekularno ili intramolekularno. Istraživanja potvrđuju da je intermolekularni način reakcije ispravan.

Reakciju ligacije pokreće ATP i provodi se na 4 ° C kako bi se smanjila kinetička energija molekula. Ovo smanjuje razdvajanje uparenih ljepljivih krajeva, a kasnije se stabilizuje ligacijom. Međutim, potrebno je dugo vrijeme reakcije kako bi se kompenzirala niska aktivnost enzima DNK ligaze na hladnoći. Koncentracija enzima se održava visokom i polietilen glikol se dodaje u reakcionu smjesu za stimulaciju.

Budući da ligacija rekonstruiše mjesto cijepanja, rekombinantni molekuli DNK proizvedeni ligacijom ljepljivih krajeva mogu se ponovo cijepati na zglobovima, koristeći iste enzime restrikcijske endonukleaze koji su korišteni za generiranje fragmenta u početku. Kao rezultat toga, fragment se može umetnuti u vektorsku DNK, i ponovo oporaviti nakon kloniranja rekombinantnih molekula.

(ii) Ligacija molekula DNK sa tupim krajevima:

Fragmenti tupo završene DNK mogu se podvezati, ali budući da ne postoji uparivanje baza za držanje fragmenata privremeno zajedno, koncentracije DNA i enzima ligaze moraju biti visoke. Međutim, podvezivanje s tupim krajem koristan je način spajanja fragmenata DNA koji nisu proizvedeni istim restrikcijskim enzimom, pa stoga imaju neusklađene ljepljive krajeve. Ovi krajevi se uklanjaju prije ligacije, pomoću enzima S1 nukleaza, koja razgrađuje jednolančanu DNK.

U slučaju podvezivanja tupih krajeva, restrikcijsko mjesto se neće regenerirati i to može spriječiti oporavak fragmenta nakon kloniranja. Iz tog razloga, kratki dupleksi DNK, nazvani linkeri, često se koriste za pridruživanje DNK.

Linkeri su kratki, dvolančani oligonukleotidi, sa tupim krajevima, koji sadrže najmanje jedno restrikciono mesto (tj. Eco RI palindrom) unutar svog niza. Ti se linkeri mogu spojiti s jednim pripravkom DNA vezanjem s tupim krajem, a zatim se ljepljivi krajevi mogu stvoriti cijepanjem linkera s odgovarajućim restrikcijskim enzimom.

Linker je odabran tako da ljepljivi kraj koji proizvodi bude identičan onom na drugom pripravku DNA. Posljedično, to dvoje se tada može spojiti ligacijom njihovih ljepljivih krajeva. Dostupni su neki vrlo svestrani linkeri koji sadrže restrikcijska mjesta za nekoliko različitih enzima unutar niza od samo osam do deset nukleotida. Molekuli s tupim krajevima se također mogu vezati nakon izgradnje ljepljivih krajeva.

Dakle, ovom metodom sada je moguće ubaciti strani segment DNK na određeno mjesto u linker regiji vektora i zatim izvući taj strani segment DNK kad god je to potrebno.

Izvori DNK ligaza:

DNK ligaze su izolovane iz E. coli i T4 bakteriofag. Enzim ligaza izoliran iz E. coli je polipeptidni lanac molekulske težine 75 kDa. Zahtijeva NAD + kao kofaktor. Ligaza dobijena od T4 bakteriofag je 68 kDa. Zahtijeva ATP kao kofaktor i izvor energije.

Za rutinske laboratorijske potrebe, T4 DNA ligaza se dobiva iz induciranog lizogena lambda T4 lig phage. Ovaj enzim ima sposobnost da ligira različite kohezivne i tupe DNK fragmenata. Koncentracija enzima se održava višom i fuzogen koji se zove polietilen glikol se dodaje u reakcijsku smjesu radi stimulacije.

Primjena enzima DNK ligaze:

Enzimi DNA ligaze imaju važnu ulogu u genetskom inženjeringu. U nedostatku enzima DNA ligaze, tehnologija rekombinantne DNA ne može biti uspješna.

Važne funkcije enzima DNA ligaze su sljedeće:

1. Eksperimenti genetskog inženjeringa uključuju spajanje fragmenata DNK za proizvodnju rekombinantnih molekula DNK. U procesu spajanja koriste se enzimi ligaze.

2. Enzimi ligaze pomažu u vezivanju vektora i umetanju rekombinantne DNK.

3. Pomažu u vezivanju linkera ili molekula adaptera na tupim krajevima fragmenata DNK.

4. Pomažu pri zaptivanju zareza u dvolančanoj DNK.

5. Enzimi ligaze zahtijevaju 3′ OH i 5′ P0^4 grupu za ligaciju.

Ovaj zahtjev može biti koristan kao:

(i) Samoligacija DNK može se spriječiti defosforilacijom (upotrebom alkalne fosfataze) namjeravanih donorskih fragmenata prije ligacije.

(ii) Defosforilacija vektorske DNK će spriječiti recirkularizaciju vektora u postupku kloniranja.

Esej # 4. Enzim alkalne fosfataze:

Enzim alkalna fosfataza (AP) katalizira uklanjanje 5 ′-terminalnih fosfatnih ostataka iz nukleinskih kiselina (RNA, DNA i ribo- i deoksiribonukleotid trifosfati). Ovaj enzim je izoliran iz bakterija (BAP) ili telećeg crijeva (CAP).

Ovaj enzim je dimerni glikoprotein molekulske težine 14.000. Sastoji se od dvije identične ili slične podjedinice svaka s molekulskom težinom od 6900. To je enzim koji sadrži cink sa četiri atoma Zn 2+ po molekulu.

Upotreba enzima alkalne fosfataze:

1. Linearni klonirajući vektori mogu se spriječiti recirkularizacijom defosforilacijom s enzimom alkalne fosfataze.

2. Slobodni 5′-OH može se fosforilirati polinukleotid kinazom i ϒ -32P ATP da bi se proizvela nukleinska kiselina označena 32P krajem.

3. AP enzim se koristi za mapiranje i DNK otiske prstiju.

Esej # 5. Enzim fosfonukleotid kinaze:

Enzim fosfonukleotid kinaza katalizira prijenos terminalne fosfatne grupe ATP-a na 5 ′-hidroksilirani terminal DNA ili RNA. Ovaj enzim se često koristi za krajnje označavanje nukleinskih kiselina sa 32 P (tj. dodaje fosfat nazad na 5′-krajeve DNK).

To se može postići bilo kojom od sljedećih metoda:

1. Prednja reakcija:

Prijenos označenog ϒ-fosfatnog oblika (ϒ -32 P)-ATP na slobodnu 5′-hidroksilnu grupu supstrata-

5 ′ – OH – DNA + [-32 P] ATP5 ′ 32 → PO – DNA + ADP

Supstrat kojem nedostaje slobodni 5′-hidroksil zahtijeva prethodnu defosforilaciju alkalnom fosfatazom.

2. Reakcija razmjene:

U početnom koraku, terminalni 5 ′-fosfat se prenosi sa supstrata na ADP prisutan u reakcijskoj smjesi. Then, the labelled ϒ-phosphate from [ϒ- 32 P]-ATP is transferred to free hydroxyl group of substrate.

5′ – HO – DNA + [ϒ -32 P] – ATP → 5′ 32 PO – DNA + ATP

Uses of Polynucleotide Kinase Enzyme:

The enzyme polynucleotide kinase is used to label 5′-termini of DNA and RNA with [ϒ- 32 P]-ATP by phosphorylation of 5′-hydroxyl groups or by the exchange reaction. This 5′-terminal labelling is used in mapping of restriction sites, DNA or RNA fingerprinting, hybridization studies and sequence analysis of DNA.

Essay # 6. S1 Nuclease Enzyme:

The S1 nuclease enzyme is single- strand specific endonuclease which cleaves DNA to release 5′-mono and 5′-oligonucleotides. Normally, double- stranded DNA, double- stranded RNA and DNA-RNA hybrids are resistant to action of S1 nuclease enzyme.

However, very large amounts of S1 nuclease enzyme can completely hydrolyze double- stranded nucleic acids. The enzyme hydrolyzes single stranded regions in duplex DNA such as loops and gaps.

S1 nuclease enzyme can also cleave single stranded areas of super helical DNA at torsional stress points where DNA may be unpaired or weakly hydrogen bonded. Once the super-helical DNA is nicked, S1 nuclease enzyme can cleave the second strand near the nick to generate linear DNA.

S1 nuclease enzyme is a monomeric protein with 3800 dalton molecular weight. It requires Zn 2+ for its activity and is relatively stable against denaturing reagents such as urea, SDS and formamide. The optimum pH requirement lies between 4 to 4.5.

Uses of S1 Nuclease Enzyme:

1. S1 nuclease enzyme is used to analyse DNA-RNA hybrid structures to map transcripts.

2. It can be used to remove singles stranded tails from DNA fragments to produce blunt ends.

3. Hair pin loop structures formed during synthesis of double-stranded cDNA is digested by this enzyme.

4. S1 nuclease enzyme is also used for DNA mapping, called SI nuclease mapping Turner.

Essay # 7. DNA Polymerase I: Holoenzyme:

This enzyme has two-fold activities:

5′ → 3’exonuclease activity and DNA synthesis (acts as 5’ -3’ polymerase). Such a bifunctional activity enables the DNA polymerase I enzyme to use nicks or gaps in double- a stranded DNA as a starting point of DNA synthesis.

The 5′-exonuclease activity degrades that DNA strand which is complementary to the template strand and thus forming nick. DNA synthesis begins at 3′-end of nick and produces a new strand of DNA complementary to the template.

The new result is the movement of nick along the template strand (nick translation) until all the DNA complementary to the template strand (starting from the site of the origin of nick to the 5′-end of the template strand) is replaced.

Uses of DNA Polymerase I:

1. DNA polymerase I enzyme is used with radioactive or biotinylated nucleotides to prepare labelled DNA of high specific activity.

2. DNA polymerase I enzyme can also catalyse de novo DNA synthesis.

3. The enzyme DNA polymerase I has 3’→5′ proof-reading exonuclease activities on a single polynucleotide chain.

Essay # 8. DNA Polymerase I: Klenow Fragment:

Treatment of DNA polymerase I holoenzyme of E. coli with protease enzyme results in the production of two protein fragments. The larger fragment is called Klenow fragment and it does not show 5′-exonuclease activity (i.e., the 5′- exonuclease activity is exhibited by the intact enzyme) This Klenow fragment is used to synthesize DNA when there is no need of removing the DNA strand which is complementary to the template strand.

Uses of Klenow Fragment:

Klenow fragments are used in the following ways:

1. In DNA sequencing by dideoxy method.

2. For the production of second strand of cDNA.

3. Radiolabelling by filling in 5′-single stranded extension on double-stranded DNA.

4. Mutagenesis of DNA with synthetic oligonucleotides.

5. In labelling the DNA by random primer method.

+ stands for presence of particular activity by the enzyme.

0 presents absence of such activity.

Essay # 9. T4 DNA Polymerase Enzyme:

The enzyme T4 DNA polymerase lacks 5′-exonuclease activity but has a very active 3′- exonuclease action. This property allows radiolabelling of DNA fragment by replacement synthesis.

In method of replacement synthesis, T4 DNA polymerase enzyme acts on both the 3’ -ends of double sanded extensions. DNA complementary to these single strands are synthesized with deoxynucleoside triphosphate enzyme in the presence of radiolabelling compounds.

Application of T4 DNK polymerase:

1. T4 DNA polymerase is useful in generating 5′ single-stranded ends.

2. The enzyme can be used in radiolabelling of DNA.

Essay # 10. Taq DNA Polymerase Enzyme:

The enzyme Taq to DNA polymerase is isolated from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus. Taq enzyme has the highest DNA polymerase activity at a pH of 9 and temperature around 75°C.

A Activity of Taq DNA polymerase is resistant to incubation at high as 95°C. Taq enzyme consists of a single polypeptide chain with a molecular weight of 95000. It lacks 5′ to 3′ and 3′ to 5′ exonuclease activity.

The highly thermostable Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus is ideal for both manual and automated DNA sequencing because it is fast, highly progressive, has little or no 3’ – exonuclease activity and is active over a broad range of temperature.

Application of Taq Polymerase:

1. Taq enzyme is used in DNA sequencing studies.

2. Taq enzyme is used in ‘Polymerase chain reaction’ or PGR as it can withstand high temperatures.

Essay # 11. Ribonuclease:

Generally RNase A and RNase T1 enzymes are used in genetic engineering techniques. Both enzymes cleave the phosphodiester bond between adjacent ribonucleotides. RNase A cleaves next to uracil (U) and cytosine (C) in such a way that phosphate remains with these pyrimidines. The nucleotide present on the other side of phosphate is dephosphorylated. RNase A enzyme is isolated from the bovine pancreas.

RNase T1 cleaves specifically next to guanine. The phosphate group at the 3′ end of the nucleotide remains with the cut end. This enzyme is isolated from Aspergillus oryzae.

Ribonuclease H (RNase H):

The enzyme RNase H is an endoribonuclease that degrades the RNA portion of the RNA- DNA hybrids. RNase H enzyme cuts the RNA into short fragments.

Applications of RNase H:

1. RNase H is the key enzyme in the cDNA cloning technique. In this case, it is used to remove the mRNA from the RNA-DNA hybrid.

2. RNase H enzyme is used to detect the presence of RNA-DNA hybrid.

3. RNase H enzyme is used to remove poly (A) tails on mRNA.

The enzyme poIy-A polymerase plays a vital role in vitro gene manipulation techniques as it analyses the addition of AMP units to the 3′ end of RNA.

Essay # 12. Deoxyribonuclease I (Dnase I):

The enzyme DNase I is an endonuclease enzyme which digests either single or double-stranded DNA, producing a mixture of mononucleotides and oligonucleotides. DNase I hydrolyses each strand of double-stranded DNA independently and at random. Addition of Mg 2+ to reaction mixture ensures random cleavage while addition of Mn 2+ gives cleavage nearly at the same place on both strands. DNase enzyme is obtained mostly from bovine pancreas.

Uses of DNase I Enzyme:

DNase 1 enzyme is useful for a variety of applications including nick translation, DNA foot printing, bisulphite mediated mutagenesis and RNA purification.

esej # 13. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Enzyme:

The enzyme deoxynucleotidyl transferase catalyses the repetitive addition of monodeoxynucleotide units from a deoxynucleoside triphosphate to the terminal 3′-hydroxyl group of a DNA molecule. This enzyme has a molecular weight of 32000 and consists of two subunits each with a molecular weight of 26500 and 8000. This enzyme is isolated from calf thymus.

Uses of Terminal Transferase Enzyme:

1. The enzyme terminal transferase is used to add homopolymer tails of DNA fragmeirts. Using a technique called homopolymer tailing, sticky ends can be built up on blunt-ended DNA molecules.

For examples, one preparation of DNA could be treated with the enzyme terminal transferase in the presence of dATP, resulting in the addition of a poly (dA) chain to each DNA strand. There is another preparation of DNA which provides 3 tails of poly (T) using same enzyme with TTP.

When both types of DNA preparations DNA fragments with poly A tails and DNA fragments with poly T tails, are mixed, there takes place base pairing between complementary sticky ends, which could then be ligated. One advantage of this method is that ligation does not take place between fragments from the same DNA preparation.

2. Terminal transferase enzyme is used for 3′-end labelling of DNA fragments

3. Terminal transferase enzyme is also used for the addition of single nucleotides to the 3- end of DNA for in vitro mutagenesis.

Purine and pyrimidine polymerization rates, by using terminal transferase enzyme, depend on the addition of Mg 2+ , Mn 2+ or Co 2+ in the reaction mixture.

Essay # 14. Reverse Transcriptase Enzyme:

The enzyme reverse transcriptase is isolated from avian myeloblastos virus (AMV). It is an RNA-dependent DNA polymerase. The enzyme requires DNA primer complementary to the RNA template, as well as presence of Mg 2+ or Mn 2+ for initiation of transcription. Reverse transcriptase mediates the conversion of genetic information present in single- stranded molecule of RNA into a double-stranded molecule of DNA.

Until recently, it was known that the genetic information’s of DNA pass to protein through mRNA. During 1960s, Temin and coworkers postulated that in certain cancer causing animal viruses which contain RNA as genetic material, transcription of cancerous genes (on RNA into DNA) takes places most probably by DNA polymerase directed by viral RNA.

Then DNA is used as template for synthesis of many copies of viral RNA in a cell. In 1970, S. Mizutani, H.M. Temin and D. Baltimore discovered that information can pass back from RNA to DNA.

They found that retroviruses (possessing RNA) contain RNA dependent DNA polymerase which IS also called reverse transcriptase. This process produces single- stranded DNA which in turn functions as template for complementary chain of DNA.

Reverse transcriptase enzyme has two subunits. The enzymatically active forms of the purified enzyme are α, β and αβ. The molecular weight of the α-subunit is 68000 and that of β-subunit is 92,000.

The mature α-β form is the most active form of AMV reverse transcriptase enzyme. It has several enzymatic roles such as RNA-directed DNA polymerase action, DNA dependent RNA polymerase activity and RNase-H activity.

The α- subunit of reverse transcriptase contains the polymerase activity. It also has the RNase- H activity during which degradation of RNA in DNA: RNA hybrids takes place. Such a sort of exonucleolytic activity of RNase-H enzyme can proceed either from the 5′- or 3′- terminus.

Uses of Reverse Transcriptase Enzyme:

1. The in vitro synthesis of cDNA from mRNA and other RNA molecule using reverse transcriptase enzyme has become a very important technique in the field of molecular biology.

2. DNA-dependent DNA polymerase activity of reverse transcriptase enzyme is responsible for second-strand formation in cDNA synthesis. Such a polymerising activity of reverse transcriptase is inhibited by the addition of actinomycin-D.

3. The reverse transcriptase enzyme mediates the conversion of genetic information present in single-stranded molecule of RNA into a double-stranded molecule of DNA.


Sadržaj

Ribonuclease H is a family of endonuclease enzymes with a shared substrate specificity for the RNA strand of RNA-DNA duplexes. By definition, RNases H cleave RNA backbone phosphodiester bonds to leave a 3' hydroxyl and a 5' phosphate group. [7] RNases H have been proposed as members of an evolutionarily related superfamily encompassing other nucleases and nucleic acid processing enzymes such as retroviral integrases, DNA transposases, Holliday junction resolvases, Piwi and Argonaute proteins, various exonucleases, and the spliceosomal protein Prp8. [8] [9]

RNases H can be broadly divided into two subtypes, H1 and H2, which for historical reasons are given Arabic numeral designations in eukaryotes and Roman numeral designations in prokaryotes. Tako je Escherichia coli RNase HI is a homolog of the Homo sapiens RNase H1. [2] [7] In E. coli and many other prokaryotes, the rnhA gene encodes HI and the rnhB gene encodes HII. A third related class, called HIII, occurs in a few bacteria and archaea it is closely related to prokaryotic HII enzymes. [4]

The structure of RNase H commonly consists of a 5-stranded β-sheet surrounded by a distribution of α-helices. [10] All RNases H have an active site centered on a conserved sequence motif composed of aspartate and glutamate residues, often referred to as the DEDD motif. These residues interact with catalytically required magnesium ions. [7] [5]

RNases H2 are larger than H1 and usually have additional helices. The domain organization of the enzymes varies some prokaryotic and most eukaryotic members of the H1 group have an additional small domain at the N-terminus known as the "hybrid binding domain", which facilitates binding to RNA:DNA hybrid duplexes and sometimes confers increased processivity. [2] [7] [11] While all members of the H1 group and the prokaryotic members of the H2 group function as monomers, eukaryotic H2 enzymes are obligate heterotrimers. [2] [7] Prokaryotic HIII enzymes are members of the broader H2 group and share most structural features with H2, with the addition of an N-terminal TATA box binding domain. [7] Retroviral RNase H domains occurring in multidomain reverse transcriptase proteins have structures closely resembling the H1 group. [5]

RNases H1 have been extensively studied to explore the relationships between structure and enzymatic activity. They are also used, especially the E. coli homolog, as model systems to study protein folding. [12] [13] [14] Within the H1 group, a relationship has been identified between higher substrate-binding affinity and the presence of structural elements consisting of a helix and flexible loop providing a larger and more basic substrate-binding surface. The C-helix has a scattered taxonomic distribution it is present in the E. coli and human RNase H1 homologs and absent in the HIV RNase H domain, but examples of retroviral domains with C-helices do exist. [15] [16]

Ribonuclease H enzymes cleave the phosphodiester bonds of RNA in a double-stranded RNA:DNA hybrid, leaving a 3' hydroxyl and a 5' phosphate group on either end of the cut site with a two-metal-ion catalysis mechanism, in which two divalent cations, such as Mg2+ and Mn2+, directly participate in the catalytic function. [17] Depending on the differences in their amino acid sequences, these RNases H are classified into type 1 and type 2 RNases H. [18] [19] Type 1 RNases H have prokaryotic and eukaryotic RNases H1 and retroviral RNase H. Type 2 RNases H have prokaryotic and eukaryotic RNases H2 and bacterial RNase H3. These RNases H exist in a monomeric form , except for eukaryotic RNases H2, which exist in a heterotrimeric form. [20] [21] RNase H1 and H2 have distinct substrate preferences and distinct but overlapping functions in the cell. In prokaryotes and lower eukaryotes, neither enzyme is essential, whereas both are believed to be essential in higher eukaryotes. [2] The combined activity of both H1 and H2 enzymes is associated with maintenance of genome stability due to the enzymes' degradation of the RNA component of R-loops. [22] [23]

Ribonuclease H1 Edit

Ribonuclease H1 enzymes require at least four ribonucleotide-containing base pairs in a substrate and cannot remove a single ribonucleotide from a strand that is otherwise composed of deoxyribonucleotides. For this reason, it is considered unlikely that RNase H1 enzymes are involved in the processing of RNA primers from Okazaki fragments during DNA replication. [2] RNase H1 is not essential in unicellular organisms where it has been investigated in E. coli, RNase H1 knockouts confer a temperature-sensitive phenotype, [7] and in S. cerevisiae, they produce defects in stress response. [24]

In many eukaryotes, including mammals, RNase H1 genes include a mitochondrial targeting sequence, leading to expression of isoforms with and without the MTS present. As a result, RNase H1 is localized to both mitochondria and the nucleus. In knockout mouse models, RNase H1-null mutants are lethal during embryogenesis due to defects in replicating mitochondrial DNA. [2] [25] [26] The defects in mitochondrial DNA replication induced by loss of RNase H1 are likely due to defects in R-loop processing. [23]

Ribonuclease H2 Edit

In prokaryotes, RNase H2 is enzymatically active as a monomeric protein. In eukaryotes, it is an obligate heterotrimer composed of a catalytic subunit A and structural subunits B and C. While the A subunit is closely homologous to the prokaryotic RNase H2, the B and C subunits have no apparent homologs in prokaryotes and are poorly conserved at the sequence level even among eukaryotes. [27] [28] The B subunit mediates protein-protein interactions between the H2 complex and PCNA, which localizes H2 to replication foci. [29]

Both prokaryotic and eukaryotic H2 enzymes can cleave single ribonucleotides in a strand. [2] however, they have slightly different cleavage patterns and substrate preferences: prokaryotic enzymes have lower processivity and hydrolyze successive ribonucleotides more efficiently than ribonucleotides with a 5' deoxyribonucleotide, while eukaryotic enzymes are more processive and hydrolyze both types of substrate with similar efficiency. [2] [30] The substrate specificity of RNase H2 gives it a role in ribonucleotide excision repair, removing misincorporated ribonucleotides from DNA, in addition to R-loop processing. [31] [32] [29] Although both H1 and H2 are present in the mammalian cell nucleus, H2 is the dominant source of RNase H activity there and is important for maintaining genome stability. [29]

Some prokaryotes possess an additional H2-type gene designated RNase HIII in the Roman-numeral nomenclature used for the prokaryotic genes. HIII proteins are more closely related to the H2 group by sequence identity and structural similarity, but have substrate preferences that more closely resemble H1. [7] [33] Unlike HI and HII, which are both widely distributed among prokaryotes, HIII is found in only a few organisms with a scattered taxonomic distribution it is somewhat more common in archaea and is rarely or never found in the same prokaryotic genome as HI. [34]

The active site of nearly all RNases H contains four negatively charged amino acid residues, known as the DEDD motif often a histidine e.g in HIV-1, human or E. coli is also present. [2] [7]

The charged residues bind two metal ions that are required for catalysis under physiological conditions these are magnesium ions, but manganese also usually supports enzymatic activity, [2] [7] while calcium or high concentration of Mg2+ inhibits activity. [11] [35] [36]

Based on experimental evidence and computer simulations the enzyme activates a water molecule bound to one of the metal ions with the conserved histidine. [35] [37] The transition state is associative in nature [38] and forms an intermediate with protonated phosphate and deprotonated alkoxide leaving group. [37] The leaving group is protonated via the glutamate which has an elevated pKa and is likely to be protonated. The mechanism is similar to RNase T and the RuvC subunit in the Cas9 enzyme which both also use a histidine and a two-metal ion mechanism.

The mechanism of the release of the cleaved product is still unresolved. Experimental evidence from time-resolved crystallography and similar nucleases points to a role of a third ion in the reaction recruited to the active site. [39] [40]

The human genome contains four genes encoding RNase H:

    , an example of the H1 (monomeric) subtype , the catalytic subunit of the trimeric H2 complex , a structural subunit of the trimeric H2 complex , a structural subunit of the trimeric H2 complex

In addition, genetic material of retroviral origin appears frequently in the genome, reflecting integration of the genomes of human endogenous retroviruses. Such integration events result in the presence of genes encoding retroviral reverse transcriptase, which includes an RNase H domain. An example is ERVK6. [41] Long terminal repeat (LTR) and non-long terminal repeat (non-LTR) retrotransposons are also common in the genome and often include their own RNase H domains, with a complex evolutionary history. [42] [43] [44]

Role in disease Edit

In small studies, mutations in human RNase H1 have been associated with chronic progressive external ophthalmoplegia, a common feature of mitochondrial disease. [26]

Mutations in any of the three RNase H2 subunits are well-established as causes of a rare genetic disorder known as Aicardi–Goutières syndrome (AGS), [3] which manifests as neurological and dermatological symptoms at an early age. [46] The symptoms of AGS closely resemble those of congenital viral infection and are associated with inappropriate upregulation of type I interferon. AGS can also be caused by mutations in other genes: TREX1, SAMHD1, ADAR, and MDA5/IFIH1, all of which are involved in nucleic acid processing. [47] Characterization of mutational distribution in an AGS patient population found 5% of all AGS mutations in RNASEH2A, 36% in 2B, and 12% in 2C. [48] Mutations in 2B have been associated with somewhat milder neurological impairment [49] and with an absence of interferon-induced gene upregulation that can be detected in patients with other AGS-associated genotypes. [47]

Two groups of viruses use reverse transcription as part of their life cycles: retroviruses, which encode their genomes in single-stranded RNA and replicate through a double-stranded DNA intermediate and dsDNA-RT viruses, which replicate their double-stranded DNA genomes through an RNA "pregenome" intermediate. Pathogenic examples include human immunodeficiency virus and hepatitis B virus, respectively. Both encode large multifunctional reverse transcriptase (RT) proteins containing RNase H domains. [51] [52]

Retroviral RT proteins from HIV-1 and murine leukemia virus are the best-studied members of the family. [53] [54] Retroviral RT is responsible for converting the virus' single-stranded RNA genome into double-stranded DNA. This process requires three steps: first, RNA-dependent DNA polymerase activity produces minus-strand DNA from the plus-strand RNA template, generating an RNA:DNA hybrid intermediate second, the RNA strand is destroyed and third, DNA-dependent DNA polymerase activity synthesizes plus-strand DNA, generating double-stranded DNA as the final product. The second step of this process is carried out by an RNase H domain located at the C-terminus of the RT protein. [5] [6] [55] [56]

RNase H performs three types of cleaving actions: non-specific degradation of the plus-strand RNA genome, specific removal of the minus-strand tRNA primer, and removal of the plus-strand purine-rich polypurine tract (PPT) primer. [57] RNase H plays a role in the priming of the plus-strand, but not in the conventional method of synthesizing a new primer sequence. Rather RNase H creates a "primer" from the PPT that is resistant to RNase H cleavage. By removing all bases but the PPT, the PPT is used as a marker for the end of the U3 region of its long terminal repeat. [56]

Because RNase H activity is required for viral proliferation, this domain has been considered a drug target for the development of antiretroviral drugs used in the treatment of HIV/AIDS and other conditions caused by retroviruses. Inhibitors of retroviral RNase H of several different chemotypes have been identified, many of which have a mechanism of action based on chelation of the active-site cations. [58] Reverse-transcriptase inhibitors that specifically inhibit the polymerase function of RT are in widespread clinical use, but not inhibitors of the RNase H function it is the only enzymatic function encoded by HIV that is not yet targeted by drugs in clinical use. [55] [59]

RNases H are widely distributed and occur in all domains of life. The family belongs to a larger superfamily of nuclease enzymes [8] [9] and is considered to be evolutionarily ancient. [60] In prokaryotic genomes, multiple RNase H genes are often present, but there is little correlation between occurrence of HI, HII, and HIII genes and overall phylogenetic relationships, suggesting that horizontal gene transfer may have played a role in establishing the distribution of these enzymes. RNase HI and HIII rarely or never appear in the same prokaryotic genome. When an organism's genome contains more than one RNase H gene, they sometimes have significant differences in activity level. These observations have been suggested to reflect an evolutionary pattern that minimizes functional redundancy among RNase H genes. [7] [34] RNase HIII, which is unique to prokaryotes, has a scattered taxonomic distribution and is found in both bacteria and archaea [34] it is believed to have diverged from HII fairly early. [61]

The evolutionary trajectory of RNase H2 in eukaryotes, especially the mechanism by which eukaryotic homologs became obligate heterotrimers, is unclear the B and C subunits have no apparent homologs in prokaryotes. [2] [28]

Because RNase H specifically degrades only the RNA in double-stranded RNA:DNA hybrids, it is commonly used as a laboratory reagent in molecular biology. Purified preparations of E. coli RNase HI and HII are commercially available. RNase HI is often used to destroy the RNA template after first-strand complementary DNA (cDNA) synthesis by reverse transcription. It can also be used to cleave specific RNA sequences in the presence of short complementary segments of DNA. [62] Highly sensitive techniques such as surface plasmon resonance can be used for detection. [63] [64] RNase HII can be used to degrade the RNA primer component of an Okazaki fragment or to introduce single-stranded nicks at positions containing a ribonucleotide. [62] A variant of hot start PCR, known as RNase H-dependent PCR or rhPCR, has been described using a thermostable RNase HII from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus abyssi. [65] Of note, the ribonuclease inhibitor protein commonly used as a reagent is not effective at inhibiting the activity of either HI or HII. [62]

Ribonucleases H were first discovered in the laboratory of Peter Hausen when researchers found RNA:DNA hybrid endonuclease activity in calf thymus in 1969 and gave it the name "ribonuclease H" to designate its hibrid specificity. [27] [66] [67] RNase H activity was subsequently discovered in E. coli [68] and in a sample of oncoviruses with RNA genomes during early studies of viral reverse transcription. [69] [70] It later became clear that calf thymus extract contained more than one protein with RNase H activity [71] and that E. coli contained two RNase H genes. [72] [73] Originally, the enzyme now known as RNase H2 in eukaryotes was designated H1 and vice versa, but the names of the eukaryotic enzymes were switched to match those in E. coli to facilitate comparative analysis, yielding the modern nomenclature in which the prokaryotic enzymes are designated with Roman numerals and the eukaryotic enzymes with Arabic numerals. [2] [27] [74] [75] The prokaryotic RNase HIII, reported in 1999, was the last RNase H subtype to be identified. [74]

Characterizing eukaryotic RNase H2 was historically a challenge, in part due to its low abundance. [2] Careful efforts at purification of the enzyme suggested that, unlike the E. coli RNase H2, the eukaryotic enzyme had multiple subunits. [76] The S. cerevisiae homolog of the E. coli protein (that is, the H2A subunit) was easily identifiable by bioinformatics when the yeast genome was sequenced, [77] but the corresponding protein was found not to have enzymatic activity in isolation. [2] [24] Eventually, the yeast B and C subunits were isolated by co-purification and found to be required for enzymatic activity. [78] However, the yeast B and C subunits have very low sequence identity to their homologs in other organisms, and the corresponding human proteins were conclusively identified only after mutations in all three were found to cause Aicardi–Goutières syndrome. [2] [3]


Ribonucleases - Part A

Walt F. Lima , . Stanley T. Crooke , in Methods in Enzymology , 2001

Uvod

RNase H hydrolyzes RNA in RNA–DNA hybrids. 1 RNase H activity appears to be ubiquitous in eukaryotes and bacteria. 2–7 Although RNases H constitute a family of proteins of varying molecular weight, the nucleolytic activity and substrate requirements appear to be similar for the various isotypes. For example, all RNases H studied to date function as endonucleases exhibiting limited sequence specificity and requiring divalent cations (e.g., Mg 2+ , Mn 2+ ) to produce cleavage products with 5′-phosphate and 3′-hydroxyl termini. 8

Two classes of RNase H enzymes have been identified in mammalian cells. 5,9,10 These enzymes were shown to differ with respect to cofactor requirements. For example, RNase H1 is activated by both Mg 2+ and Mn 2+ , whereas RNase H2 was shown to be activated by only Mg 2+ and inhibited by Mn 2+ . Furthermore, both RNase H1 and H2 were shown to be inhibited by sulfhydryl reagents. 10,11 Although the biological roles of the mammalian enzymes are not fully understood, it has been suggested that mammalian RNase H1 may be involved in replication and that the type 2 enzyme may be involved in transcription. 12,13

Recently, both human RNase H genes have been cloned and expressed. 11,14,15 The type 1 enzyme is a 286 amino acid protein with a calculated mass of 32 kDa. 11 The enzyme is encoded by a single gene that is at least 10 kb in length and is expressed ubiquitously in human cells and tissues. The amino acid sequence of human RNase H1 displays strong homology with RNase H1 from yeast (21.8% amino acid identity), chicken (59%), Escherichia coli (33.6%), and mouse (84.3%). The type 1 enzymes are all small proteins (<40 kDa) and their estimated pI values are all 8.7 and greater. The amino acid residues in E. coli RNase HI thought to be involved in the Mg 2+ binding site, catalytic center, and substrate binding region 16–18 are well conserved in the cloned human RNase H1 sequence. 11 The human RNase H2 enzyme is a 299 amino acid protein with a calculated mass of 33.4 kDa and has also been shown to be ubiquitously expressed in human cells and tissues (see Ref. 14 Wu, unpublished data, 1998). Human RNase H2 shares strong amino acid sequence homology with RNase H2 from Caenorhabditis elegans (45.5% amino acid identity), yeast (25.7%), and E. coli (14.4%). Unlike the RNase H1 isotype, the type 2 enzyme is an acidic protein exhibiting a pI of 4.94.