Informacije

Visoka koncentracija prajmera u PCR-u

Visoka koncentracija prajmera u PCR-u


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zašto je veća koncentracija prajmera od DNK šablona u PCR -u pogodovala žarenju šablona na primer?


Jednostavno rečeno, veća koncentracija prajmera znači više prajmera u mješavini, stoga su veće šanse da se pričvrsti na vaš DNK šablon, međutim više nije uvijek dobro. Optimalna koncentracija prajmera u PCR reakciji je između 0,1 i 0,5 µM. Za većinu aplikacija je dovoljno 0,2 µM. Korištenje vrlo visoke koncentracije prajmera može biti problematično jer može uzrokovati da se vaši prajmeri vežu za djelomično komplementarna mjesta što rezultira nespecifičnim PCR proizvodima.

https://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/cloning/pcr_strategy/optimising_pcr/


Upotreba visoke koncentracije prajmera osigurava da se nakon denaturacije DNK DNK veže za prajmere umjesto da se veže jedan za drugi. Takođe veća koncentracija prajmera povećala je prinos proizvoda, jer prajmeri deluju kao ograničavajući faktor za žarenje.

(Referenca: https://academic.oup.com/nar/article/24/5/985/1047654)


Izračunavanje koncentracija za PCR

i) Oligonukleotidni prajmeri se generalno isporučuju kao "toliko OD jedinica/ml" - ali šta ovo znači znači, u smislu mg/ml, ili mmol/ml, itd?

Dato: prajmer je dugačak Y nukleotida (nt)

S obzirom: MW ssDNK je (330 daltona po nt) x (dužina u nt) (Sambrook et al., 1989, str. C.1)

Dato: koncentracija prajmera (=ssDNA) koja proizvodi OD od 1 na 254 nm u kiveti od 1 cm, je 37 ug/ml

Onda: MW prajmera je 330.Y daltona

I: X OD/ml = 37.X ug/ml = 37.X mg/l = 37.X /330.Y mM = 37.X.1000/330.Y uM

Na primjer:

B 88/77 prajmer - 17 -merni oligodeoksinukleotid - isporučen je 12,6 OD jedinica/ml. Moramo napraviti osnovno rješenje od 5 uM za PCR.

MW: 17 x 330 = 5610

Koncentracija: 12,6 OD x 37 ug/ml = 466 ug/ml = 466 mg/l = 0,466 g/l

Molarnost: 0,466/5610 = 0,000083 Molar = 83 uM

Stoga: potrebno nam je 5 ul osnovne otopine oligo u 83 ul (+78 ul vode) da napravimo otopinu od 5 uM (ako 1 ul u 83 ul daje 1 uM otopine.)

ii) Izračunavanje količina za PCR reakcije: ako nam je potrebna konačna koncentracija od 0,5 uM oligo u PCR reakcijskoj mješavini (konačna zapremina 50 ul), dodamo 5 ul 5 uM zaliha u reakcijsku smjesu (1/10 konačnog razrjeđenja) .

B) nukleotidi:

Zalihe nukleotida za PCR (ili neki drugi postupak) su SKORO UVIJEK dNTP s (deoksinukleotidi), a koncentracije su gotovo uvijek navedene SVAKI dNTP: to jest, zadana koncentracija je SVAKI nukleotid u smjesi, NE ukupna koncentracija. To znači da 2,5 mM dNTP mješavina za PCR sadrži 2,5 mM SVAKI dNTP i 10 mM UKUPNO dNTP.

Primjer:

i) Napravite 2,5 mM matičnu otopinu dNTP-a od osnovnih 100 mM pojedinačnih dNTP-a, koju isporučuje Promega:

  • PRVO pomiješajte jednake količine svakog nukleotida (npr.: 50 ul): ovo vam daje 200 ul 25 mM miješanih dNTP (zapamtite: konc. izraženo u SVAKI dNTP).
  • ONDA razrijedite ovu (ili alikvot) 1/10 sa VODA - alikvot u količine od 100 ul i zamrznuti.

ii) Pripremite 1 mM zalihu dNTP-a sa dTTP-om zamijenjenim sa 10% (w/w) digoksigeninom-11-dUTP (DIG-dUTP) za upotrebu kao mješavina za označavanje za PCR označavanje PCR proizvoda:

  • DIG-dUTP isporučen (od strane Boehringer Mannheim) pri 25 nmol/25ul = 1 umol/ml = 1mM konačna koncentracija DIG-dUTP mora biti 1/10 od ostalih nukleotida, a [DIG-dUTP] + [dTTP] mora = [ bilo koji drugi dNTP]. Stoga da bi se dobio 1 mM dNTP temeljni dio mora se razrijediti DIG-dUTP temeljac 1/10.
  • PRVO razblažite odvojene 100 mM dNTP zalihe na 10 mM (npr. 5 ul do 50 ul, u vodi).
  • ONDA pomiješajte jednake količine (npr. 10 ul) 10 mM dCTP, dGTP i dATP zalihe i 9/10 volumena dTTP (9 ul). Dodajte jednaku zapreminu (npr. 10 ul) od 1 mM DIG-dUTP.
  • ONDA dodati vodu do 10 vol (=100 ul dodati 51 ul): konačna koncentracija svakog dNTP = 1 mM konačna koncn DIG-dUTP = 0,1 mM, a dTTP = 0,9 mM.

iii) UPOTREBA mješavinu napravljenu iznad na 50 uM svakog dNTP u PCR reakcijskoj smjesi, konačna zapremina 25ul:


Protokol

Postavka reakcije:

Preporučujemo sastavljanje svih reakcionih komponenti na ledu i brzo prebacivanje reakcija u termocikler zagrejan do temperature denaturacije (95°C).

Komponenta 25 & mul reakcija 50 &mul reakcija Konačna koncentracija
10X Standard Taq Reaction Buffer 2.5 & mul 5 &mul 1X
10 mM dNTP 0,5 &mikrol 1 &mul 200 &mikroM
10 & microM Forward Primer 0,5 &mikrol 1 & mul 0,2 µM (0,05&ndash1 µM)
10 µM Reverse Primer 0,5 &mikrol 1 &mul 0,2 & microM (0,05 & ndash1 & microM)
Predložak DNK varijabla varijabla <1,000 ng
Taq DNK polimeraza 0,125 &mikrola 0,25 &mikrol 1,25 jedinica/50 &mikrola PCR
Voda bez nukleaza do 25 &mikrola do 50 &mikrola

Napomene: Lagano promiješajte reakciju. Sakupite svu tečnost na dno epruvete brzim okretanjem ako je potrebno. Prekrijte uzorak mineralnim uljem ako koristite PCR mašinu bez grijanog poklopca.

Prenesite PCR epruvete iz leda u PCR mašinu sa blokom prethodno zagrijanim na 95°C i započnite termocikliranje.

Uslovi termocikliranja za rutinski PCR:

KORAK
TEMP
VRIJEME
Inicijalna denaturacija
95°C
30 sekundi
30 ciklusa 95°C
45-68°C
68°C
15-30 sekundi
15-60 sekundi
1 minuta/kb
Final Extension 68°C 5 minuta
Čekaj 4-10°C


Opće smjernice:

Oligonukleotidni prajmeri su općenito dugački 20 & ndash40 nukleotida i idealno imaju GC sadržaj od 40 & ndash60%. Računalni programi kao što je Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3) mogu se koristiti za dizajniranje ili analizu prajmera. Konačna koncentracija svakog prajmera u reakciji može biti 0,05&ndash1 &muM, tipično 0,1&ndash0,5 &muM.

Koncentracija Mg++ od 1,5&ndash2,0 mM optimalna je za većinu PCR proizvoda generiranih sa Taq DNK polimeraza. Konačna koncentracija Mg++ u 1X standardu Taq Reakcioni pufer je 1,5 mM. Ovo podržava zadovoljavajuće pojačanje većine amplikona. Međutim, Mg++ se može dalje optimizirati u koracima od 0,5 ili 1,0 mM koristeći MgCl2.

Pojačanje nekih teških meta, poput sekvenci bogatih GC-om, može se poboljšati dodacima, poput DMSO-a (3) ili formamida (4).

Konačna koncentracija dNTP-a je tipično 200 µM svakog deoksinukleotida.

Općenito preporučujemo korištenje Taq DNK polimeraza u koncentraciji od 25 jedinica/ml (1,25 jedinica/50 &mul reakcija). Međutim, optimalna koncentracija od Taq DNK polimeraza može biti u rasponu od 5&ndash50 jedinica/ml (0,25&ndash2,5 jedinica/50 &mul reakcija) u specijalizovanim aplikacijama.

Početna denaturacija od 30 sekundi na 95°C dovoljna je za većinu amplikona iz čistih DNK šablona. Za teške šablone kao što su sekvence bogate GC-om, preporučuje se duža početna denaturacija od 2&ndash4 minuta na 95°C prije PCR ciklusa kako bi se šablon u potpunosti denaturirao. Kod PCR-a kolonija preporučuje se početna denaturacija od 5 minuta na 95°C.

Tokom termocikliranja preporučuje se denaturacija od 15&ndash30 sekundi na 95°C.

Korak žarenja je obično 15&ndash60 sekundi. Temperatura žarenja se zasniva na Tm para prajmera i tipično je 45&ndash68°C. Temperature žarenja mogu se optimizirati PCR -om s temperaturnim gradijentom od 5 ° C ispod izračunatog Tm. NEB Tm kalkulator se preporučuje za izračunavanje odgovarajuće temperature žarenja.

Kada se koriste prajmeri sa temperaturama žarenja iznad 65°C, moguć je PCR protokol u 2 koraka (pogledajte #10).

Preporučena temperatura proširenja je 68°C. Vrijeme proširenja je općenito 1 minuta po kb. Preporučuje se konačno produženje od 5 minuta na 68 ° C.

Generalno, 25&ndash35 ciklusa daje dovoljan proizvod. Može biti potrebno do 45 ciklusa za otkrivanje ciljeva sa malim brojem kopija.

Kada se koriste prajmeri sa temperaturama žarenja iznad 65 ° C, moguć je protokol termocikliranja u 2 koraka.


Protokol

Postavka reakcije:

Preporučujemo sastavljanje svih reakcionih komponenti na ledu i brzo prebacivanje reakcija u termocikler zagrejan do temperature denaturacije (95°C).

Komponenta 25 &mul reakcija 50 &mul reakcija Konačna koncentracija
10X Standard Taq Reaction Buffer 2.5 &mul 5 & ​​mul 1X
10 mM dNTPs 0,5 &mikrol 1 &mul 200 & microM
10 & microM Forward Primer 0,5 & mikrol 1 & mul 0,2 & microM (0,05 & ndash1 & microM)
10 µM Reverse Primer 0,5 & mikrol 1 &mul 0,2 & microM (0,05 & ndash1 & microM)
Predložak DNK varijabla varijabla <1,000 ng
Taq DNK polimeraza 0,125 & mikrol 0,25 &mikrol 1,25 jedinica/50 mikrona PCR
Voda bez nukleaza do 25 &mikrola do 50 i mikrona

Napomene: Lagano promiješajte reakciju. Sakupite svu tečnost na dno epruvete brzim okretanjem ako je potrebno. Prekrijte uzorak mineralnim uljem ako koristite PCR mašinu bez zagrijanog poklopca.

Prenesite PCR epruvete iz leda u PCR mašinu sa blokom prethodno zagrijanim na 95 ° C i počnite termocikliranje.

Uslovi termocikliranja za rutinski PCR:

KORAK
TEMP
VRIJEME
Inicijalna denaturacija
95°C
30 sekundi
30 ciklusa 95 & degC
45-68 & degC
68°C
15-30 sekundi
15-60 sekundi
1 minut/kb
Final Extension 68 & degC 5 minuta
Čekaj 4-10°C


Opće smjernice:

Oligonukleotidni prajmeri su općenito dugački 20 & ndash40 nukleotida i idealno imaju GC sadržaj od 40 & ndash60%. Računalni programi kao što je Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3) mogu se koristiti za dizajniranje ili analizu prajmera. Konačna koncentracija svakog prajmera u reakciji može biti 0,05&ndash1 &muM, tipično 0,1&ndash0,5 &muM.

Koncentracija Mg++ od 1,5&ndash2,0 mM je optimalna za većinu PCR proizvoda generiranih sa Taq DNK polimeraza. Konačna koncentracija Mg++ u 1X standardu Taq Reakcioni pufer je 1,5 mM. Ovo podržava zadovoljavajuće pojačanje većine amplikona. Međutim, Mg++ se može dalje optimizirati u koracima od 0,5 ili 1,0 mM koristeći MgCl2.

Amplifikacija nekih teških ciljeva, kao što su sekvence bogate GC, može se poboljšati aditivima, kao što su DMSO (3) ili formamid (4).

Konačna koncentracija dNTP-a je tipično 200 µM svakog deoksinukleotida.

Općenito preporučujemo korištenje Taq DNK polimeraza u koncentraciji od 25 jedinica/ml (1,25 jedinica/50 &mul reakcija). Međutim, optimalna koncentracija od Taq DNK polimeraza može biti u rasponu od 5&ndash50 jedinica/ml (0,25&ndash2,5 jedinica/50 &mul reakcija) u specijalizovanim aplikacijama.

Početna denaturacija od 30 sekundi na 95°C dovoljna je za većinu amplikona iz čistih DNK šablona. Za teške šablone kao što su sekvence bogate GC-om, preporučuje se duža početna denaturacija od 2&ndash4 minuta na 95°C prije PCR ciklusa kako bi se šablon u potpunosti denaturirao. Kod PCR-a kolonija preporučuje se početna denaturacija od 5 minuta na 95°C.

Tokom termocikliranja preporučuje se denaturacija od 15&ndash30 sekundi na 95°C.

Korak žarenja je obično 15&ndash60 sekundi. Temperatura žarenja se zasniva na Tm para prajmera i tipično je 45&ndash68°C. Temperature žarenja se mogu optimizirati izvođenjem PCR temperaturnog gradijenta počevši od 5°C ispod izračunate Tm. NEB Tm kalkulator se preporučuje za izračunavanje odgovarajuće temperature žarenja.

Kada se koriste prajmeri sa temperaturama žarenja iznad 65°C, moguć je PCR protokol u 2 koraka (pogledajte #10).

Preporučena temperatura proširenja je 68°C. Vrijeme proširenja je općenito 1 minuta po kb. Preporučuje se konačno produženje od 5 minuta na 68 ° C.

Generalno, 25&ndash35 ciklusa daje dovoljan proizvod. Može biti potrebno do 45 ciklusa za otkrivanje ciljeva sa malim brojem kopija.

Kada se koriste prajmeri sa temperaturama žarenja iznad 65°C, moguć je protokol termocikliranja u 2 koraka.


Rezultati

Blokirajuće performanse prajmera

Dodavanje blokirajućeg prajmera u PCR smjesu jasno je smanjilo broj pojačanih fragmenata predatora i povećalo broj fragmenata rjeđih plijena. U mješavinama rDNK koje sadrže 1000 puta više fragmenata rDNK "predatora" (krila) u usporedbi s fragmentima rDNK "plijena" (alge), samo vrhovi koji odgovaraju rDNK krila mogu se detektirati analizom fragmenata kada nije dodan prajmer za blokiranje (Tablica 3). Dodavanje blokirajućeg prajmera koji inhibira žarenje u omjeru 4:1 u poređenju s odgovarajućim univerzalnim prajmerom (1,0 μL blokirajućeg prajmera i 0,25 μL univerzalnog prajmera, oba 10 μM) dovelo je do smanjene amplifikacije rDNK krila, ali ne i do potpunog zaustavljanja amplifikacije (Tabela 3) . A dodavanjem 10 puta više blokirajućeg prajmera od univerzalnih prajmera (2,5 μL blokirajućeg prajmera i 0,25 μL svakog univerzalnog prajmera), rDNK algi je gotovo isključivo pojačana (Tablica 3). Dodavanje 20 puta veće količine prajmera za blokiranje (5,0 μL blokirajućeg prajmera i 0,25 μL svakog univerzalnog prajmera) dodatno je smanjilo vrh krila (tablica 3).

Činilo se da je "normalni" prajmer Short28SR-blkKrill3'c3 bio nešto efikasniji u blokiranju DNK predatora u poređenju sa DPO prajmerom Short28SF-DPO-blkKrill. Pikovi koji odgovaraju rDNK krila bili su niži u 4:1 blokirajućem prajmeru: univerzalne mješavine prajmera i za 1:100 i za 1:1000 plijen: uzorci rDNK predatora s normalnim prajmerom u poređenju sa mješavinama s prajmerom za DPO (tabela 3) . Međutim, DPO prajmer je u velikoj mjeri blokirao amplifikaciju DNK krila kada se doda u omjeru 10: 1 u nemodifikovani prajmer (Tabela 3).

Prajmer za zaustavljanje istezanja 28S-ElArKrill-3'c3 nije radio. Nijedan PCR proizvod nije nastao kada je dodat u PCR smjesu (podaci nisu prikazani).

Krill analiza želuca

Ukupno 111 klonova iz 13 različitih želuca krila je sekvencirano otkrivajući 36 različitih sekvenci koje spadaju u 6 glavnih grupa. Među njima nije bilo sekvenci koje bi odgovarale divljem tipu 28s rDNK krila. Međutim, 10 različitih (ukupno 15) sekvenci su bile jasno porijeklom iz krila (slika 3) i vjerovatno pseudogene ili niske kopije koje se obično ne otkrivaju direktnim sekvenciranjem.

Stablo sličnosti sekvenci. Stablo sličnosti sekvenci sekvenci amplificiranih iz želuca krila i srodnih sekvenci. Sekvence želuca krila su nazvane tako da prva tri slova označavaju datum uzorkovanja, tj. M24 = 24. mart 2007., S17 i ​​S20 = 17. septembar i 20. septembar 2007. St. označava broj želuca, a broj u zagradi je jednak broju identičnih sekvenci svake različite sekvence koje se nalaze u različitim želucima. Drvo je neukorenjeno.

Pronađene su četiri različite grupe sekvenci algi. Dvije od ovih grupa, otkrivene samo u martovskim uzorcima, imale su najbliže podudaranje s vrstama koje pripadaju Bacillariophyta, odnosno rodu Phaeodactylum i rod Skeletonema (Slika 3). Treća grupa, pronađena u želucima iz sva tri datuma uzorkovanja, izgledala je kao da je donekle slična Bacillariophyta, ali nije odgovarala ničemu u GenBank-u (Slika 3). Sekvencirana površina od 200 bp bila je previše neinformativna da bi filogenetskom analizom otkrila gdje grupa pripada, osim što je grupa najvjerovatnije bila algalnog porijekla. Poslednja grupa algi bila je jedna sekvenca iz septembra koja pripada Chlorophyta (slika 3).

Jedna velika grupa sekvenci, koja je preovladavala u uzorku iz septembra, nije mogla biti nedvosmisleno identifikovana pozivanjem na trenutne sekvence u GenBank-u. Najbliža podudaranja bila su 96% Stauroteuthis (Mollusca). Moguće je da to mogu predstavljati namirnice mekušaca poput ličinki ličinki. Međutim, takođe je moguće da je Stauroteuthis sekvenca je pogrešno prijavljena i zapravo je izvedena iz zagađivača originala Stauroteuthis uzorak.

Sekvence su deponovane u GenBank pod pristupnim brojevima EU378965 – EU379000.


Taq Polymerase


Definicija jedinice: Jedna jedinica je definirana kao količina enzima potrebna za katalizaciju inkorporacije 10 nmola dNTP-a u oblik nerastvorljiv u kiselini za 30 minuta na 70 ° C koristeći DNK sperme heringa kao supstrat.

Dostava: isporučeno na plavom ledu

Uslovi skladištenja: čuvati na -20 °C
izbjegavajte cikluse zamrzavanja/odmrzavanja

Rok trajanja: 12 mjeseci

Koncentracija: 5 jedinica/&mul

Opis:
Taq Polymerase se preporučuje za rutinske PCR aplikacije (do 4 kb dužine fragmenta), PCR visoke propusnosti ili genotipizaciju. Pufer sistem garantuje robusne i pouzdane rezultate amplifikacije u skoro svim PCR aplikacijama. Kristalni pufer sadrži dobro izbalansiran odnos iona kalija, amonijaka i magnezija kako bi se osigurala visoka specifičnost i minimalno stvaranje nusproizvoda bez potrebe za dodatnim koracima optimizacije.
Ruby Buffer dodatno sadrži pufer za punjenje gela i inherentnu crvenu boju. Crvena boja omogućava laku vizuelnu kontrolu tokom PCR postavljanja i u kombinaciji sa reagensom za gustinu direktno ubacivanje produkta reakcije u gel.
Enzim replicira DNK na 72 ° C. On katalizira polimerizaciju nukleotida u dupleksnu DNK u smjeru 5 '→ 3' u prisutnosti magnezija. Također posjeduje 5 '→ 3' aktivnost zamjene egzonukleaze ovisnu o polimerizaciji, ali nema aktivnost 3 '→ 5' egzonukleaze (čitanje).

Sadržaj:
Taq polimeraza (crvena kapa)
5 jedinica/mul Taq DNA polimeraze u 20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5 % Tween-20, 0,5 % Nonidet P-40, 50 % (v/v) glicerol, pH 8,0 (25°C)

Ruby Buffer (crni poklopac)
10 x konc. kompletan PCR pufer koji sadrži 200 mM Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4 i 20 mM MgCl2, crvena boja za praćenje i reagens za gustoću za punjenje gela

Kristalni pufer (zelena kapica)
10 x konc. kompletan PCR pufer koji sadrži 200 mM Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4 i 20 mM MgCl2

komponentaPCR-211SPCR-211LPCR-211XL
Taq
Polimeraza
200 jedinica
/ 40 &mul
1000 jedinica
/ 200 &mul
5000 jedinica
/ 1 ml
Ruby Buffer1,2 ml5 x 1,2 ml25 ml
Crystal
Buffer
1,2 ml5 x 1,2 ml25 ml


Postavljanje testa:
Prije početka temeljito vrtložite sve komponente kako biste osigurali homogenost.
Pripremite premiks za broj testova koji su vam potrebni prema sljedećem protokolu:

comp.kapadionica konc.final conc.1 test @ 20 &mul1 test na 50 i mul
Voda za PCRbijela napuniti do 20 &mulnapuniti do 50 &mul
Ruby Buffer ili Crystal Buffercrne ili zelene10x1x2 &mul5 &mul
dNTP Mix / 10 mM #NU-1006bijela10 mM200 &muM0,4 &mul1 &mul
Taq Polymerasecrvena5 jedinica/&mul0,025 jedinica/&mul0,1 &mul0,25 &mul
mješavina prajmera ili svaki prajmer 10 &muM svaki prajmer200 - 400 nM svaki prajmer0,4-0,8 &mul1 - 2 &mul
šablon
/uzorak DNK
10 &mul 1)
izduženje 2)
95 °C
50 - 68 °C
72 ° C
10 - 20 sek
10 - 20 sek
20 sekundi - 4 min

25 - 35x

Punjenje gela i primjene u nizu:
Ruby pufer (#PCR-272) uključuje reagens za gustoću + boju za praćenje i omogućava direktno unošenje PCR proizvoda u gel za elektroforezu. Za detekciju DNK / fluorescentno bojenje DNK preporučujemo upotrebu novih generacija boja (npr. SYBR DNA Stain, #PCR-273) umjesto klasičnog, ali vrlo mutagenog etidijum bromida.
Kristalni pufer (#PCR-271) preporučuje se za nizvodne primjene kao što je sekvenciranje DNK, ligacija, restrikcijska digestija ili gdje je potrebna analiza PCR proizvoda apsorbancijom ili fluorescentnom ekscitacijom. Za elektroforezu u gelu dodajte pufer za punjenje gela i fluorescentnu DNK boju (npr. Gel Loading Buffer with DNK Stain, #PCR-274 - #PCR-276) prije stavljanja PCR-a u gel. Također je moguće koristiti prethodno obojene gelove ili protokole za bojenje nakon testiranja.

Dodatni sistemi međuspremnika:
Pufer za označavanje (#PCR-263) preporučuje se za obilježavanje DNK ili primjene mutageneze. Pufer je posebno optimiziran za ugradnju obilježenih ili modificiranih nukleotida u DNK. Daje superiorne rezultate u širokom rasponu reakcionih uslova sa većinom parova prajmer-šablon, ali amplifikacija takođe može dovesti do povećane nespecifičnosti.
KCl pufer (#PCR-262) preporučuje se za upotrebu u rutinskim PCR reakcijama. Pufer je optimiziran za najveću specifičnost, ali može zahtijevati dodatno fino podešavanje parametara analize kao što je MgCl2 koncentracija i temperatura žarenja.

Optimizacija MgCl2 koncentracija:
Preporučuje se konačna koncentracija Mg 2+ od 2,0 mM u kombinaciji sa puferom za označavanje. Međutim, ako je individualna optimizacija Mg 2+ neophodna, dodajte 25 mM MgCl2 osnovni rastvor (#PCR-266) kao što je prikazano u tabeli ispod.

konačni MgCl2 konc.20 i više konačnog volumena testa50 &mul konačnog volumena testa
2 mM--
3 mM0,8 &mul2.0 & mul
4 mM1.6 &mul4.0 & mul
5 mM2.4 &mul6.0 &mul

Citati proizvoda:
Kliknite na crnu strelicu sa desne strane da proširite listu citata. Kliknite na naslov publikacije za cijeli tekst.


Diskusija

Ovdje opisujemo novu tehniku ​​za amplifikaciju DNK kako bi se smanjili negativni efekti nepodudarnosti između prajmera i šablona na efikasnost amplifikacije ciljnih šablona. Ova metoda je iznimno općenita i jednostavna modifikacija PCR reakcije i uključuje tri enzimska koraka, uključujući polimerazu posredovano linearno kopiranje predložaka genomske DNK, probavu prajmera egzonukleazom i konačno PCR amplifikaciju pomoću prajmera koji ciljaju na ciljno nezavisno povezivanje sekvence. Kao što je prikazano u ovom rukopisu, ovaj pristup dozvoljava eksponencijalno pojačavanje cilja od interesa pomoću prajmera koji nemaju neusklađenosti sa bilo kojim šablonima u reakciji. Ovo značajno smanjuje predrasude povezane s neusklađenostima i degeneriranim prajmerima koji se mogu akumulirati tijekom PCR-a ograničavajući interakcije prajmer-šablon na samo dva ciklusa.

Ciljevi ove studije su bili: (i) pokazati da se prva i druga faza PCR-a mogu razdvojiti, i dalje generirati pouzdanu amplifikacija (ii) utvrditi da li su degeneracije u bazama prajmera dovele do očiglednog izobličenja posmatrane mikrobne zajednice, i ako se PEX PCR tehnika može koristiti za zaobilaženje ili smanjenje takvog izobličenja, (iii) razviti robustan radni tok za ovaj pristup koji će se implementirati za bilo koji set ili setove prajmera i (iv) identificirati aplikacije za koje je ovaj pristup najprikladniji. Rezultati ovdje pokazuju da zaista dvije definirane vrste interakcija unutar PCR (i.e. prirodne i umjetne interakcije) mogu se i trebaju odvojiti kada se koriste degenerirani prajmeri ili kada se očekuju neusklađenosti s predloškom. Faze bi trebalo odvojiti jer interakcije genomske DNK šablona i prajmera imaju najveći potencijal pristranosti zbog neusklađenosti proizašlih iz stvarnih neusklađenosti u gDNA i izroda u grupi primera. Naša analiza umjetno sintetizirane lažne zajednice pokazuje snažan potencijal za degeneriranu skupinu prajmera oligonukleotida različitih temperatura taljenja za preferencijalni odabir predložaka na temelju varijacija sekvence na mjestu primera. Naša strategija ograničava interakciju šablona i prajmera gDNA na dva ciklusa, pri čemu svi naredni ciklusi amplifikacije koriste nedegenerisane interakcije bez šablona. Nadalje, budući da se u prvoj fazi interakcija gDNA-prajmer koriste samo dva ciklusa, mogu se koristiti neobični uslovi žarenja i produženja. U ovoj studiji koristili smo duga vremena žarenja (20 minuta) na niskim temperaturama žarenja kako bismo omogućili dovoljno vremena da se polimeraza veže na ciljna mjesta i produži bez povećanja temperature reakcije. Takvi reakcijski uvjeti su vjerovatno tolerantniji na nisku efikasnost žarenja prajmera prajmera i šablona sa neusklađenošću. U sistematskoj studiji interakcije prajmera i šablona, ​​Wu et al. [31] izvijestili su da su pojedinačne neusklađenosti koje su se dogodile u posljednja 3–4 položaja od 3 ’kraja prajmera dale minimalno produženje prajmera ili bez njega. Ovdje primjećujemo da se neusklađenosti od 3’ mogu prevladati korištenjem PEX PCR metode, te da se prajmeri sa 3 ili 4 nepodudarnosti još uvijek mogu spojiti s genomskim DNK ciljevima i dati produžetak polimeraze. Ovo je otkriveno kroz analizu obrazaca korištenja prajmera u lažnim analizama zajednice. Napominjemo da se ovakva analiza ne može izvesti standardnim PCR pristupima, već je potrebna PEX PCR metoda.

Nadalje, kroz poređenje PEX PCR metode sa i bez egzonukleaze pokazujemo da prajmeri koji ciljaju izvornu gDNK (ili lažnu DNK) doprinose distorziji tokom kasnijih ciklusa PCR čak i u prisustvu visokih koncentracija PCR prajmera druge faze. . Potpuno uklanjanje neinkorporiranih prajmera iz reakcije prve faze, iako poželjno, pokazalo se da je teško. Čak i nakon razrjeđivanja, digestije egzonukleaze i snižavanja koncentracije prajmera tokom prva dva ciklusa, određena ograničena količina prajmera prve faze može se propagirati u PCR druge faze. Unatoč tome, liječenje egzonukleazom značajno smanjuje utjecaj prenošenja prajmera i bitan je dio PEX PCR metodologije. U analizama i lažne zajednice i gDNK okoliša, tretman egzonukleazom značajno mijenja promatranu mikrobnu zajednicu. Moguće je da umjesto tretmana egzonukleazom, blokiraju se oligonukleotidi inverznog komplementa prajmera specifičnih za prednji i obrnuti šablon (e.g. inverzni komplement 515F i 806R prajmera bez CS1 i CS2 linkera) mogao bi se dodati u drugu fazu PCR PEX PCR reakcije kako bi se spriječile interakcije gDNK šablon-prajmer.

PEX PCR metoda također pruža nov i robustan mehanizam za istraživanje interakcija prajmera i šablona u analizama složenih uzoraka gDNK. PEX PCR metoda čuva sekvencu žarenja prajmera na gDNK šablonu tokom prva dva ciklusa reakcije, a oni se mogu bioinformatički ispitati kako bi se utvrdilo koji prajmeri unutar degeneriranog skupa su zaista uključeni u žarenje i proširenje. Uočili smo da se pri visokim temperaturama žarenja preferira savršeno žarenje, te je korištena manja raznolikost prajmera u bazenu. Čini se da je ovo štetno za reakciju amplifikacije, jer su savršeno podudarni prajmeri prisutni u maloj ukupnoj zastupljenosti u jako degeneriranoj bazi prajmera. Na nižim temperaturama žarenja, širi spektar prajmera, koji sadrži neusklađenost sa šablonom, je uključen u žarenje i elongaciju. Čini se da je ovo korisno, jer su analize lažne zajednice pod nižim uslovima žarenja generirale bolje prikaze prave osnovne distribucije lažnih DNK. Primećeno je da se prajmeri sa 0-4 neslaganja sa različitim šablonima žare i omogućavaju ekstenzija polimeraze. Kada su 3' nepodudarnosti uvedene u lažne DNK šablone, raspodjela korištenja prajmera pomaknula se prema prajmerima sa 1 ili 2 ukupna nepodudaranja sa šablonom. Stoga, velika degeneracija setova prajmera možda neće biti od koristi kada se koristi PEX PCR metoda. Umjesto toga, možda bi bilo prikladno odabrati “srednje” prajmere koji imaju najviše 1 ili 2 nepodudarnosti sa svim potencijalnim prajmerskim mjestima, uz pretpostavku da svaka varijanta ne zahtijeva jedinstveni prajmer da bi se ciljao. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se odredila najbolja kombinacija degeneracije prajmera i temperatura žarenja za druge, degeneriranije mete, poput mikrobnih funkcionalnih gena. Takva strategija može omogućiti direktnu metodu zasnovanu na PCR-u za analizu gena jedne kopije prisutnog u svim mikroorganizmima u svrhu analize strukture zajednice. Nadalje napominjemo da mogu biti potrebne dodatne strategije kako bi se omogućilo da PEX PCR metoda efikasno radi na nižim temperaturama žarenja (e.g. & lt45 ° C), kao što je uvođenje jednolančanog proteina koji veže DNK u glavne smjese za amplifikaciju.

PEX PCR metoda se preporučuje za: (i) svaku PCR reakciju u kojoj se koristi degenerirani prajmer (ii) svaku PCR reakciju u kojoj se koristi nedegenerirani prajmer, ali gdje je moguća varijabilnost DNK šablona na mjestu prajminga (iii ) reakcije u kojima se može primijeniti degeneracija visokog stupnja za ciljanje svih poznatih varijanti gena i (iv) kada se istodobno koristi više parova prajmera. Ovdje pokazujemo da se metoda može koristiti za amplifikaciju i sekvencioniranje šablona s neusklađenostima na 3’ kraju prajmera, za koje se pokazalo da su visoko destabilizirajući u PCR-u [31,32]. Crosby i Criddle [33] ranije su koristili strategiju koja je koristila hibridizacijsko hvatanje, nakon čega je slijedila nasumično pripremljena amplifikacija i sekvenciranje kako bi se ciljali geni RNA polimeraze usmjerene na DNA (rpoC). PEX PCR metoda može biti prilagodljiva direktnoj PCR amplifikaciji rpoC geni svih mikroorganizama unutar jedne reakcije amplifikacije. Ovo bi očuvalo originalnu relativnu brojnost pronađenu u DNK šablona i pružilo direktan proxy za relativnu brojnost organizama u uzorku. Ovo je za razliku od amplifikacije i sekvenciranja rRNA gena, kao što je izvedeno u ovoj studiji, budući da se širok spektar genskih kopija rRNA operona nalazi u domenima Bacteria i Archaea [34]. Još ne znamo da li je nivo degeneracije u očuvanim regionima rpoC (ili drugi sličan) gen će vjerovatno biti glavna prepreka tokom prva dva ciklusa faze “A” PEX PCR metode, ali ovo je jasan sljedeći korak u razvoju ove tehnike. Ako se uoči dimerizacija prajmera u reakcijama sa ekstremno degenerisanim prajmerskim skupovima, prečišćavanje komponenti faze „A“ korišćenjem protokola za odabir veličine (e.g. AMPure perle) umjesto egzonukleaze smanjit će prijenos dimera prajmera koji su neosjetljivi na aktivnost jednolančane egzonukleaze.

PEX PCR metoda također može naći široku primjenu za kvantitativne PCR u kojima se koriste degenerisani prajmeri. Kvantitativni PCR se može izvesti početnom obradom uzoraka DNK pripremljenih korištenjem faze “A” PEX PCR metode. Nakon toga, qPCR bi se izvodio korištenjem prajmera koji ciljaju sekvence linkera umjesto prajmera specifičnih za šablon. Ovo bi potencijalno moglo značajno povećati efikasnost qPCR-a i ciljni raspon za širokociljane degenerisane prajmere uobičajene za mikrobiologiju okoliša i izbjeći probleme koji proizlaze iz diferencijalne efikasnosti amplifikacije za različite mete. Sličan pristup je zapravo razvijen, s ciljem da se smanji utjecaj bakterijske kontaminacije DNK u qPCR reakcijama [35].

Konačno, napominjemo da ova metoda ima konceptualne sličnosti sa studijom koju su prethodno izveli Crosby i Criddle [33], u kojoj su sekvence povezivača povezane sa slučajnim prajmerima korištene za amplifikaciju funkcionalnih gena koji su uhvaćeni pomoću hibridizacijskih sondi. U toj studiji za označavanje su korištena dva ciklusa žarenja i elongacije, s naknadnim pojačavanjem. Osim toga, Illumina je razvila pristup hvatanja cilja u kojem se dva prajmera s linkerima na 5’ ili 3’ krajevima dozvoljavaju da se pričvrste na jedan lanac šablonske DNK (i.e. TruSeq Amplicon). Nakon ekstenzije polimeraze, ligacija se koristi za povezivanje izduženog fragmenta sa 3' terminalnim prajmerom sa 3' bočnim linkerom. Nakon toga, PCR amplifikacija korištenjem linker sekvenci se koristi za pripremu fragmenata za sekvenciranje.


QRT-PCR standardne krive u realnom vremenu. efikasnost je previsoka ! - (29.06.2005.)

U svojim qRT-PCR eksperimentima u realnom vremenu koristim metodu standardne krive za kvantifikaciju ekspresije gena. Međutim, čini se da su standardne krive za mene ogromna procedura "pogodi ili promaši", čak i sa genima koji su dobro uspostavljeni da dobro rade sa Real-Time, kao što je GAPDH.

Ponekad sam u stanju da napravim odlične standardne krivine sa nagibom od približno -3,3 (

100% efikasnost) povezane krive topljenja za svako razrjeđivanje su također odlične.

Međutim, većinu vremena mogu dobiti odlične krivulje topljenja za svako razrjeđivanje, ali nagib za moju standardnu ​​krivu može pasti na oko -2,6 (

Može li neko ponuditi neko objašnjenje za ovu čudnu dilemu? Slijedom toga, može li netko ponuditi neke prijedloge za rješavanje ovog problema?

Jedna stvar na koju mogu da pomislim je da dobijam neujednačenu efikasnost amplifikacije pri različitim koncentracijama RNK. FYI, obično koristim 100 ng/uL RNK za "1x" i pravim serijska razrjeđenja do 100x. Razumijem da bih zaista trebao koristiti veći raspon razrjeđenja, ali veća od 100x razrjeđenja jednostavno ne funkcioniraju za moje gene/prajmere.

Hvala na pomoći koju mogu dobiti.

Koji je raspon Cts -a? Jeste li vidjeli bilo kakvu kontaminaciju u svojoj negativnoj kontroli?

My Ct values for the standard curves usually range from around 14-20, and the negative controls are showing no DNA contamination.

What instrument are you using?

Dear YuJ,
Are you using SYBR Green as reporter dye and you are using iCycler?
What is your lowest dilution in your standard?

This is what always happen to me. If i run a SYBR Green assay using standard ranging from 10e6 to 1, i will get > 100% efficiency.
So what i did was I unselect the last two dilution (10 and 1) and the efficiency become

3.3.
I think this is due to the primer dimer formation that contribute to the false signal in you reaction. And the effect of the primer dimer is great enough to afact you data especially in the low concentration standard.

I am indeed using SYBR Green chemistry (ABI SYBR Green PCR Mix), but the instrument I use is the Applied Biosystems 7900HT.

I have tried removing certain dilutions in all possible permutations before plotting the trendlines, but the outcomes are inconsistent between experiments. I also don't believe I have any primer-dimers because of the very pronounced product peaks and complete absence of primer-dimer peaks from the dissociation/melting data.

Hi YuJ,
Could you please describe how you preparing your quantitative standard?

My quantitative standards are prepared as such.

1. RNA isolation using TRIZOL reagent following manufacturer instructions plus an additional overnight purification step with ethanol (100%) and sodium acetate (3 M).

2. Spectrophotometric determination of [RNA]. A260/A280 ratio is usually at around 1.8.

3. Serial dilution of RNA at 1x, 10x, 25x, 75x, 100x, and sometimes 1000x (with 1x being 100 ng/uL diluted from stock, 10x being 10 ng/uL, etc.) using DEPC-treated water. I make sure to vortex each tube very well before pipetting for the next dilution.

4. Reagents in RT-PCR reactions include: Multiscribe Reverse Transcriptase (ABI), RNaseOUT RNase Inhibitor (Invitrogen), SYBR Green 2x PCR Mix (ABI). These, plus DEPC-treated water, are combined as a master mix.

5. Primer concentrations have been previously optimized for each primer. In the case of GAPDH, I determined the ideal concentration to use would be 0.06 uM per reaction for both the forward and reverse primer.

6. In each reaction tube, I first add the water and master mix, then the primers, and then finally the appropriate RNA template.

7. Each tube is vortexed and loaded in triplicate into the appropriate optical reaction plate. Plate is centrifuged to get rid of air bubbles and placed into the ABI 7900HT.

8. Thermocycler is set for a 45C RT phase (30min), 95C melting + 60C annealing phase (40 cycles), and then an additional dissociation phase at the end for generating the dissociation curves.

I probably included a lot of irrelevant facts, but hopefully this is what you meant by how I prepare my quantiative standards.

Dear YuJ,
Thanks for your description. I would strongly suggest you to use invitro transcription to prepare your GAPDH mRNA rather than using TRIzol extracted total RNA.

The reason is when you use TRIzol to extraction, you will get total RNA not GAPDH specific mRNA. So when you quantitate using spetrophotometrically, the reading will be out. Thus it would not give you a

You may try to clone the GAPDH gene into a plasmid and invitro trascripted(IVT) into GAPDH mRNA --> treat with DNase I to completly remove DNA conteminant--> stop DNase reaction --> purify the mRNA --> quantitate you mRNA*-->converte xx ug/ul into xx RNA copy/ul--> perform 10 fold serial dilution --> run RT-PCR.

This should give you a batter result.

*optional:
If you want to make sure that you IVT GAPDH mRNA is free from DNA conteminat, you may run a RT-PCR and a PCR (no RT) simultaneously. Your (no RT) PCR should not give you any band. If it does, treat you standard again with DNase I.

Bilješka:
when you do a cloning please in clude 10-20 bp extra flanking at the both 3' and 5' end of your acture mRNA target. This will provide bater stability against exonuclease and yield prolong shelf life to your standard.

I would like to recommend you to use Ambion produst for IVT purpose.

Thank you for your advice, Hadrian, but I do not believe that method is suitable for me.

Although I've only mentioned GAPDH serial dilution as an example, I am actually conducting a gene expression study for some other genes, merely using GAPDH as an internal control.

Also, when I made the spectrophotometric measurements, I was just interested in the A260/A280 ratio as a measure of RNA purity and a rough estimate of the total RNA concentration in the stock tube. Indeed I am measuring total RNA, but gene-specific primers are used in the RT-PCR for actual quantification.

Sorry, I should have first mentioned what I'm actually doing instead of assuming that others can read my mind.


The Degenerate Primer Design Problem: Theory and Applications

A PCR primer sequence is called degenerate if some of its positions have several possible bases. The degeneracy of the primer is the number of unique sequence combinations it contains. We study the problem of designing a pair of primers with prescribed degeneracy that match a maximum number of given input sequences. Such problems occur when studying a family of genes that is known only in part, or is known in a related species. We prove that various simplified versions of the problem are hard, show the polynomiality of some restricted cases, and develop approximation algorithms for one variant. Based on these algorithms, we implemented a program called HYDEN for designing highly degenerate primers for a set of genomic sequences. We report on the success of the program in several applications, one of which is an experimental scheme for identifying all human olfactory receptor (OR) genes. In that project, HYDEN was used to design primers with degeneracies up to 10 10 that amplified with high specificity many novel genes of that family, tripling the number of OR genes known at the time.


High concentration of primer in PCR - Biology

The 64-bit Mac version should work on most modern Macs (OS X 10.7 or newer).

FreeBSD users may simply type pkg install pooler

For all other systems (GNU/Linux, older Mac, Solaris. ) please compile from source (below).

Example primers file

Source code

  • a C compiler (GCC or Clang) and basic Unix tools,
  • MingW compiler(s) if you want to cross-compile for Windows.

Usage

  • If you opt to use Score when your primers and/or tags are very long, you will be asked if you are really sure you don't want to use deltaG instead.
  • If you opt for deltaG, the following questions will be asked: Temperature: Enter a number (decimal fractions are allowed). You can enter it in Celsius, Kelvin, Fahrenheit or Rankine. Do not enter the suffix C or K or F or R---Primer Pooler will determine for itself which unit was meant, and ask you to confirm. (Recent versions of Primer Pooler offer 5 additional obscure temperature scales if you decline all of the more probable ones.) Magnesium concentration in mM (0 for no correction): Enter your concentration of magnesium in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). Enter 0 if you don't mind the deltaG figures not being corrected for magnesium concentration. Monovalent cation (e.g. sodium) concentration in mM: Enter your concentration of sodium etc in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). If in doubt, try 50. dNTP concentration in mM (0 for no correction): Enter your concentration of deoxynucleotide (dNTP) in nanomoles per cubic metre (decimal fractions are allowed). Enter 0 if you don't mind the deltaG figures not being corrected for dNTP concentration.
  • If you answered yes to this question, the summary will be displayed on screen, and you will be asked if you also want to save it to a file. If you answer yes to this, you will be asked for a filename.
  • These up-front counts will include self-interactions (a primer interacting with itself), and interactions between the pair of primers in any given set. Self-interactions and in-set interactions are ne counted when summarizing the counts of each pool (below).
  1. Go to http:// hgdownload. cse. ucsc. edu/ downloads. html
  2. Choose a species (e.g. Human)
  3. Choose "Genome sequence files"
  4. If you're under hg38, choose "Standard genome sequence files"
  5. Scroll down to the links, and choose the one that ends .2bit (e.g. hg38.2bit)
  • After the overlap scan is complete, Primer Pooler will then have enough data to write an input file for MultiPLX if you wish to run that software as well for comparison. If you decline this, it will ask if you want it to write a simple text file with the locations of all amplicons, which you may accept or decline.
  • If you do ne opt to check for overlaps in the genome, then Primer Pooler will ne take overlaps into account when generating its pools. This is rarely useful unless you have already ensured there are no overlaps in the set of amplicons under consideration. Even then, I would recommend performing a scan anyway, just to double-check: an early version found 11 overlaps in a supposedly overlap-free batch drawn up by an experienced academic---we all make mistakes. But bypassing the overlap check might be useful if you are sure there are no overlaps and you don't want to download a very large genome file to the workstation you're using.

You will not be allowed to set the maximum size of each pool lower than the average size of each pool, since that would make it logically impossible to fit all primer-sets into all pools. It is not advisable to set it just above the average either, since being overly strict about the evenness of the pools could hinder Primer Pooler from finding a solution with lower dimer formation. You might want to experiment with different maxima---you will be able to come back to this question and try again. Do you want to give me a time limit? (y/n): If you answer y, you will be asked to set a time limit in minutes. Normally 1 or 2 is enough, although you may wish to let it run a long time to see if it can find better solutions. You don't imati to set a time limit: you may manually interrupt the pooling process at any time and have it give the best solution it has found so far, whether a time limit is in place or not. Additionally, Primer Pooler will stop automatically when it detects better solutions are unlikely to be found. Do you want my "random" choices to be 100% reproducible for demonstrations? (y/n): If you answer y, Primer Pooler's random choices will be generated in a way that merely look random but are in fact completely reproducible. This is useful for demonstration purposes---you'll know how long it will take to find the solution you want. Otherwise, the random choices will be less predictable, as a different sequence will be chosen depending on the exact time at which the pooling was started. Pooling display While pooling is in progress, Primer Pooler will periodically display a brief summary of the best solution found so far, showing the pool sizes, and the counts of interactions (by deltaG range or score) within each pool. As instructed on screen, you may press Ctrl-C (i.e. hold down Ctrl while pressing and releasing C, then release Ctrl) to cancel further exploration and use the best solution found so far. Do you want to see the statistics of each pool? (y/n): After the pooling is complete, or after you have interrupted it (by pressing Ctrl-C as instructed on screen), you will be asked if you wish to see the interaction counts of each pool (rather than a simple summary of sve pools as appeared during pooling). If you want this, you will also be asked if you wish to save them to a file, and, if so, what file name. Do you want to see the highest bonds of these pools? (y/n): If you answer Yes, you will be asked for a deltaG or score threshold, and all interactions worse than that threshold will be displayed on-screen with bonds diagrams such as:and you will then be asked if you wish to save it to a file, and, if so, what file name. You will then be asked if you would like to try another threshold. Shall I write each pool to a different result file? (y/n): If you answer y to this, you will be asked for a prefix, which will be used to name the individual results files. Otherwise, you will be asked if you wish to save all results to a single file. If you decline saving all results to a single file, the results will not be saved at all---this is for when you weren't happy with the solution and want to go back to try a different number of pools or a different maximum pool size. Do you want to try a different number of pools? (y/n): This question is self-explanatory. You can go back as many times as you like, trying different numbers of pools. But many researchers have a pretty good idea of how many pools they want to use, or else are happy with the computer's initial suggestion. Would you like another go? (y/n): If you answered No to trying a different number of pools, or if you didn't want the program to do pooling at all, then you will be asked if you want to start the program again. Answering No to this question will exit.

Command-line usage

The only mandatory argument (if not running interactively) is a filename for the primers file. This should be a text file in multiple-sequence FASTA format, such as:(this example does not represent real primers). Degenerate bases are allowed using the normal letters, and both upper and lower case is allowed. Names of amplicons' primers should end with F or R, and otherwise match. Optionally include tags (tails, barcoding) to apply to all primers: >tagF and >tagR (tags can also be changed part-way through the file).

Processing options should be placed before this filename. Options are as follows: --help or /help or /? Show a brief help message and exit. --counts Show score or deltaG-range pair counts for the whole input. deltaG will be used if the --dg option is set (see below). This option produces a fast summary of how many primer pairs (in the entire collection, before pooling) have what range of interaction strengths. This could be used for example to check a pool that you have already chosen manually, or if you want a rough idea of the worst-case scenario that pooling aims to avoid. --self-omit Causes the --counts option to avoid counting self-interactions(a primer interacting with itself), and interactions between the pair of primers in any given set. --print-bonds=THRESHOLD Similar to --counts , this can be useful for checking a manual selection or for a rough idea. All interactions worse than the given threshold (deltaG if --dg is in use, otherwise score) will be written to standard output, with bonds diagrams. --dg[= temperature[, mg[, cation[, dNTP]]]] Set this option to use deltaG instead of score. Optional parameters are the temperature (default is human blood heat), the concentration of magnesium (default 0), the concentration of monovalent cation (e.g. sodium, default 50), and the concentration of deoxynucleotide (dNTP, default 0). Decimal fractions are allowed in all of these. Temperature is specified in kelvin, and all concentrations are specified in nanomoles per cubic metre. --suggest-pools Outputs a suggested number of pools. This is the approximate lowest number of pools needed to achieve no worse than a deltaG of -7 (or a score of 7) in each. --pools[= NUM[, MINS[, PREFIX]]] Splits the primers into pools. Optional parameters are the number of pools (if omitted or set to ? then the suggested number will be calculated and used), a time limit in minutes, and a prefix for the filenames of each pool (set this to - to write all to standard output). --max-count=NUM Set the maximum number of pairs per pool. This is optional but can make the pools more even. A maximum lower than the average is not allowed, and it's usually best to allow a generous margin above the average. --genome=PATH Check the amplicons for overlaps in the genome, and avoid these overlaps during pooling. The genome file may be in .2bit format as supplied by UCSC, or in .fa (FASTA) format. --scan-variants When searching for amplicons in a genome file, scan variant sequences in that file too, i.e. sequences with _ and - in their names. By default such sequences are omitted as they're not normally needed if using hg38. --amp-max=LENGTH Sets maximum amplicon length for the overlap check. The default is 220. --multiplx=FILE Write a MultiPLX input file after the --genome stage, to assist comparisons with MultiPLX's pooling etc. --seedless Don't seed the random number generator --version Just show the program version number and exit.

Changes

Defects fixed

  1. an error in incremental-update logic sometimes had the effect of generating suboptimal solutions (in particular, pools could be unnecessarily empty, and/or full beyond any limit that was set)
  2. an error in the user-interface loop meant that if you use tags, run interactively, and answer "yes" to the question "Do you want to try a different number of pools", the second run will have been done without the tags, and its results will have been de-tagged twice, removing some bases from the output moreover, the resulting truncated versions of your primers will have made it into the interaction calculations for any third run.

Versions prior to 1.17 also had a display bug: the concentrations for the deltaG calculation are in millimoles per litre, not nanomoles as stated on-screen in interactive mode (please ignore the on-screen instruction and enter millimoles, or upgrade to the latest version which fixes that instruction).

Versions prior to 1.34 would round down any decimal fraction you type when in interactive mode (for deltaG temperature, concentration and threshold settings). Internal calculation and command-line use was not affected by this bug.

Versions prior to 1.37 did not ignore whitespace characters after FASTA labels and the label) -->.

Notable additions

Version 1.2 added the MultiPLX output option, and Version 1.33 fixed a bug when MultiPLX output was used with tags and multiple chromosomes. Version 1.3 added genome reading from FASTA (not just 2bit), auto-open browser, and suggest number of pools.

Version 1.36 clarified the use of Taq probes, and allowed these to be in the input file during the overlap check. It's consequently stricter about the requirement that reverse primers must end with R or B : previous versions would accept any letter other than F for these.

Version 1.4 allows tags to be changed part-way through a FASTA file. For example, if there are two >tagF sequences, the first >tagF will set the tags for all F primers between the beginning of the file and the point at which the second >tagF is given the second >tagF will set the tags for all F primers from that point forward. You can change tags as often as you like.

Version 1.5 allows primer sets to be "fixed" to predetermined pools by specifying these as primer name prefixes , e.g. [email protected]:myPrimer-F fixes myPrimer-F to pool 2.

Version 1.6 detects and warns about alternative products of non-unique PCR. It was followed within hours by Version 1.61 which fixed a regression in the amplicon overlap check.

Version 1.7 makes the ignoring of variant sequences in the genome optional, and warns if primers not being found might be due to variant sequences having been ignored.


Pogledajte video: 33min result, New qPCR Detective Solution for DNARNA Release (Oktobar 2022).