Informacije

7.5: Endoreplikacija - Biologija

7.5: Endoreplikacija - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Endoreplikacija je replikacija DNK tokom S faze ćelijskog ciklusa bez naknadnog završetka mitoze i/ili citokineze. Endoreplikacija se javlja u određenim vrstama stanica i kod životinja i kod biljaka. Postoji nekoliko varijacija:

  • replikacija DNK sa završetkom mitoze, ali bez citokineze.
  • ponovljena replikacija DNK bez formiranja novih jezgara u telofazi. To može rezultirati:
    1. Poliploidija: replicirani hromozomi zadržavaju svoj individualni identitet.
    2. Politenija: replicirani hromozomi ostaju u preciznom poravnanju formirajući „džinovske“ hromozome.
    3. različiti posredni uslovi između 1 i 2

Na fotomikrografu su prikazani politenski hromozomi u ćeliji pljuvačne žlijezde a Drosophila melanogaster larva. Takvi se kromosomi nalaze i u drugim velikim, aktivnim stanicama.

  • Svaki od 4 para hromozoma Drosophile prošao je 10 krugova replikacije DNK.
  • Majčinski i očinski homolozi - kao i svi njihovi duplikati - međusobno su poravnani u tačnom registru.
  • Dakle, svaki hromozom se sastoji od kabla koji sadrži 2048 identičnih lanaca DNK.
  • One su toliko velike da se mogu vidjeti tokom međufaze; čak i sa svjetlosnim mikroskopom male snage.

Funkcija politenije

Verovatni odgovor: amplifikacija gena. Imati više kopija gena omogućava visok nivo ekspresije gena; to jest, obilna transkripcija i translacija za proizvodnju genskih proizvoda. To bi objasnilo da je politenija povezana s velikim, metabolički aktivnim stanicama (poput žlijezda slinovnica). Politenski kromosomi podijeljeni su na oko 5.000 gustih traka odvojenih svijetlim vrpcama. Bendovi se dalje dijele na:

  • tamne trake heterohromatina gde je DNK čvrsto zbijena i postoji mala transkripcija gena;
  • sive trake euhromatina gdje je DNK labavije zbijena i postoji aktivna transkripcija gena.

Ovih osam mikrofotografija () pokazuju promjene u obrascu puhanja ekvivalentnih segmenata hromozoma 3 u Drosophila melanogaster tokom nekih 20 sati normalnog razvoja.

Imajte na umu da su se u tom razdoblju, kada su se larve pripremale za lutkarstvo, stvorile određene regresije, nazadovale i ponovo formirale. Međutim, redoslijed kojim su se oni često razlikovali. Na primjer, kod larve, traka 62E postaje aktivna prije 63E (c, d i e), ali kada započne pupiranje, vrijedi obrnuto (g, h).

Općenito, rani udisaji odražavaju aktivaciju gena koji kodiraju faktore transkripcije. Ovi proteini se zatim vezuju za promotore drugih gena, uključuju ih i uzrokuju pojavu puff na njihovim lokusima.


Ćelijski i molekularni mehanizmi koji kontrolišu ploidnost

Romain Donné za. Chantal Desdouets, u Referentnom modulu u naukama o životu, 2018

Endoreplikacija

Endoreplikacija je specifična mana staničnog ciklusa koja uključuje prelazak s mitotičkog staničnog ciklusa na endocikl (slika 2 (A) Fox i Duronio, 2013). Ovo omogućava replikaciju nuklearnog genoma bez kariokineze ni citokineze što dovodi do stvaranja mononukleatnih poliploidnih kontingenata. Zanimljivo je da su opisane dvije varijante endoreplikacije (slika 2 (A)): Endocikliranje i Endomitoza. Tokom endocikliranja, ćelija izmjenjuje G i S faze, dok u endomitozi, stanica ima karakteristike mitoze kao što je kondenzacija hromozoma, ali preskače citokinezu. Klasično, da bi se izvršila izmjena G i S faza, postoji ciklička aktivacija/inhibicija CDK2/Cyclin E, a da bi se izbjegla mitoza, CDK1/Cyclin B1 mora biti inhibiran (Fox i Duronio, 2013). Endoreplikacija je opsežno okarakterisana tokom embriogeneze u različitim organizmima. Kod miša, tijekom implantacije blastocista, gigantske stanice trofoblasta (TGC) izvode cikluse endoreplikacije i akumuliraju DNK do 1000 kompleta kromosoma. Ova endoreplikacija je pokrenuta inhibicijom aktivnosti CDK1 posredovanom p57 (CKI) (Ullah et al, 2008.). Megakariociti (MKC) su još jedan primjer razvojno regulirane poliploidizacije kod sisara. Dok TGC preskače mitozu, MKC postaju poliploidni endomitozom (preskaču dio anafaze i telofaze). Pokazano je da donja regulacija faktora izmjene gvanidina ECT2 sprječava aktivaciju RhoA i prodiranje brazde cijepanja, zajedno sa smanjenjem ekspresije ciklina B1 (Gao et al., 2012. Nguyen i Ravid, 2010.). Nakon mnogih krugova ovog defekta ćelijskog ciklusa, MKC dostiže poliploidno stanje (sa 128n hromozoma) važno za formiranje trombocita (Raslova et al., 2007.). Zanimljivo je da se ciklusi endoreplikacije također nalaze u patološkim okruženjima pod aktivacijom ćelija koje blokiraju odgovor na oštećenje DNA (DDR) u G2/M i štite tkivo od proliferacije oštećenih stanica koje drže kromosomske nestabilnosti. Ovaj proces je opisan u poremećajima jetre tokom diobe steatotičnih hepatocita (Gentric et al., 2015.). Druge studije su pokazale da endoreplikacija može potaknuti aneuploidiju i tumorigenezu, kriza telomera u fibroblastima dovodi do skraćivanja telomera i neuspjeha mitoze. Nakon toga, reaktivacija telomeraze izaziva ekspanziju klonova i njihovu transformaciju (Davoli i de Lange, 2012).


Hemija i biologija (kurs 5-7)

Opšti zahtjevi instituta uključuju komunikacione zahtjeve koji su integrirani u zahtjeve HASS -a i zahtjeve svakog od glavnih detalja, pogledajte detalje u nastavku.

Sažetak zahtjeva predmeta Subjects
Science Requirement 6
Zahtjevi za humanističke, umjetničke i društvene nauke (HASS) Najmanje dva od ovih predmeta moraju biti označena kao komunikacijsko intenzivna (CI-H) da bi se ispunio zahtjev za komunikacijom. 8
Zahtjev za ograničene izborne predmete iz nauke i tehnologije (REST) ​​[mogu se ispuniti do 5.12 i 7.03 u programu odsjeka] 2
Laboratorijski zahtjevi (12 jedinica) [može se zadovoljiti do 7.003 [J] ili kombinacijom 5.351, 5.352 i 5.353 u programu odjeljenja] 1
Ukupni GIR predmeti potrebni za SB diplomu 17
Uslovi fizičkog vaspitanja
Uvjeti plivanja, plus četiri kursa fizičkog vaspitanja za osam bodova.

Odsekovni program

Odaberite najmanje dva predmeta u glavnom smjeru koji su označeni kao komunikacijski intenzivni (CI-M) kako bi ispunili komunikacijske zahtjeve.


Rezultati i diskusija

Izvedena globalna regulatorna mreža za HalobacteriumNRC-1

Primijenili smo našu metodu na halofilni arheon Halobacterium NRC-1. The Halobacterium genom sadrži 2.404 neredundantnih gena, od kojih je 124 označeno kao poznati ili navodni TF [28, 29]. Postupak biklusteriranja i zaključivanja mreže provedeni su na nedavno generiranom skupu podataka koji sadrži 268 mjerenja mikromreža ovog mita u arheonu u širokom rasponu genetskih i ekoloških poremećaja ('Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS' i 'Whitehead K, Kish A, Pan M, Kaur A, King N, Hohmann L, Diruggiero J, Baliga NS', lične komunikacije), [30, 31]. Nekoliko TF -a se ne mijenjaju značajno u svojim nivoima ekspresije u skupu podataka od 124 identifikovana TF -a, 100 je pokazalo značajnu promjenu u nivoima ekspresije u skupu podataka, a preostala 24 TF -a su isključena iz skupa potencijalnih uticaja (vidi Materijali i metode, ispod) [32]. Snažno korelirani TF (oni sa korelacijom većom od 0,85) su dalje grupisani, dajući 72 regulatora (neki predstavljaju višestruke korelirane regulatore). Ovim 72 potencijalna regulatora dodano je 10 faktora okoline za ukupno 82 moguća prediktora za 1.934 gena sa značajnim signalom u setu podataka. Pored ovog glavnog skupa podataka, 24 nova eksperimenta (sakupljena nakon prilagođavanja modela) korištena su za nezavisnu procjenu greške nakon procedure inferencije mreže.

Metoda cMonkey (Reiss DJ, Baliga NS, Bonneau R, neobjavljeni podaci) primijenjena je na ovaj skup podataka (originalnih 268 uslova) na biklaster gene i uslove, na osnovu podataka o ekspresiji gena, mreže funkcionalnih asocijacija i pojava i otkrivanje cis-djelovanje regulatornih motiva u biklaster uzvodnim nizovima. Biklasterizacija je rezultirala sa 300 biklastera koji pokrivaju 1.775 gena. Dodatnih 159 gena, koji su pokazali značajnu promjenu u odnosu na zajedničku referencu u nizu podataka, cMonkey je utvrdio da ima jedinstvene obrasce ekspresije, pa stoga nisu uključeni u biklastere, ovih 159 gena je zaključeno pojedinačno.

Postupak zaključivanja regulatorne mreže tada je proveden na ovih 300 biklastera i 159 pojedinačnih gena, što je rezultiralo mrežom koja sadrži 1.431 regulatornih utjecaja (rubovi mreže) različite jačine. Od ovih regulatornih utjecaja, 495 predstavljaju interakcije između dva TF -a ili između TF -a i faktora okoliša. Odabrali smo nulti model za 21 biklaster (nema utjecaja ili su pronađeni samo slabi regulatorni utjecaji, kao što je opisano u materijalima i metodama, ispod), što ukazuje da striktno isključujemo nedovoljno određene gene i biklastera iz našeg mrežnog modela. Odnos tačaka podataka i procenjenih parametara je približno 67 (jedna vremenska konstanta plus tri regulatorna uticaja, u proseku, od 268 uslova). Naš skup podataka nije potpun s obzirom na potpuni fiziološki i ekološki repertoar za Halobacterium NRC-1, i nekoliko TF-ova njihova aktivnost je modulirana neopaženim faktorima (na primjer, post-translacijske modifikacije i vezanje neopaženih liganda) regulatorni odnosi za mnoge gene stoga nisu vidljivi, s obzirom na trenutni skup podataka. Slika 1 prikazuje rezultujuću mrežu za Halobacterium NRC-1 u Cytoscape -u, dostupno kao Cytoscape/Gaggle web start [33, 34].

Pretpostavljena regulatorna mreža Halobacterium NRC-1, vizualizirano korištenjem Cytoscape i Gaggle. (a) Potpuna pretpostavljena regulatorna mreža. Regulatori su označeni kao krugovi, sa crnim neusmjerenim rubovima do biklastera (pravokutnika) čiji su članovi. Zelene i crvene strelice predstavljaju represiju (β & lt 0) i aktivacija (β > 0) ivice, respektivno. Debljina regulacijskih rubova proporcionalna je snazi ​​ruba koju je odredio infrelator (β za tu ivicu). Interakcije su prikazane kao trokuti povezani plavim rubovima s regulatorima. Slabi utjecaji (|β| & lt 0,1) nisu prikazane. (b) Primjer regulacije Biclustera 76. Četiri transkripcijska faktora (TF) sirR, kaiC, VNG1405C, i VNG2476C su odabrani od strane Inferelatora kao najvjerovatniji regulatori gena u biklasteru 76 iz skupa svih (82) kandidata regulatora. Relativne težine, β, pomoću kojih se predviđa da će se regulatori kombinirati kako bi odredili nivo ekspresije gena biklustera 76, naznačeni su uz svaku ivicu regulacije. TF-ovi VNG2476C i kaiC kombinovati u logičkom I odnosu. phoU i prp1 su TF-ovi koji pripadaju biklasteru 76.

Primjer predviđene regulacije jednog biclustera, bicluster 76 (koji sadrži gene uključene u transport Fe i Mn Tablica 1), prikazan je na slici 1b. Među 82 moguća regulatora, četiri su odabrana kao najvjerojatniji regulatori ovog skupa. Naučena funkcija ovih TF -ova omogućava predviđanje nivoa ekspresije gena biklastera 76 u novim uslovima, uključujući genetske smetnje (na primjer, za predviđanje nivoa ekspresije u kaiC nokaut deformacija, uticaj kaiC se može ukloniti iz jednačine postavljanjem njegove težine na nulu). Predviđeni regulatorni model za biklus 76 raspravljamo dalje u nastavku.

Procijenili smo sposobnost pretpostavljenog mrežnog modela da predvidi stanje izraza Halobacterium NRC-1 na osnovu genoma. Za svako eksperimentalno stanje napravili smo predviđanja svakog biklasterskog stanja, na osnovu nivoa regulatora i faktora okoline, i uporedili predviđene vrijednosti izraza sa odgovarajućim izmjerenim stanjem (koristeći korijenu srednje kvadratne devijacije [RMSD] za procjenu razlike ili greške, kako je opisano ispod u odjeljku Materijali i metode). Na ovaj način smo procijenili prediktivnu izvedbu zaključene mreže i na eksperimentima u skupu podataka za obuku i na 24 eksperimenta u nezavisnom skupu testova (koji nazivamo novosakupljenim skupom podataka). Nivo ekspresije biklastera predviđa se na osnovu nivoa TF -a i faktora okoline koji na njega utiču u mreži, u prethodnoj vremenskoj tački (za vremenske uslove) ili trenutnom stanju (za stabilne uslove). Procjene greške za 300 biklastera i 159 pojedinačnih gena prikazane su na slikama 2 i 3. Za biklasteri, srednja greška od 0,37 je značajno manja od raspona omjera uočenih u podacima (jer su svi biklasteri normalizirani tako da imaju varijanse od oko 1.0 prije prilagođavanja modela), što ukazuje da je ukupno stanje globalnog izraza dobro predviđeno. Naša moć predviđanja novih podataka (slike 2 i 3, desni paneli) slična je onoj u podacima o obuci (srednja vrijednost RMS -a u okviru skupa za obuku je unutar 1 standardne devijacije od srednje vrijednosti RMS -a u odnosu na nove podatke), što ukazuje da je naš procedura primjenjuje razumnu štedljivost prema modelima (koristeći skupljanje L1 zajedno s deseterostrukom unakrsnom provjerom valjanosti [CV], kako je opisano u odjeljku Materijali i metode, dolje) i precizno procjenjujući stupanj do kojeg možemo predvidjeti nivoe ekspresije biklastera u funkciji TF i faktori okoliša.

Prediktivna moć pretpostavljene mreže na biklasterima. (a) Greška korijena srednje kvadratne devijacije (RMSD) predviđenog odgovora u usporedbi s pravim odgovorom za 300 predviđenih bikusa ocijenjenih u 268 uvjeta skupa za obuku. (b) RMSD greška istih 300 biklastera procijenjenih na novim podacima (24 uslova) prikupljenim nakon ugradnje modela/izgradnje mreže.

Prediktivna moć gena sa jedinstvenim profilima ekspresije. Histogrami korijenske srednje kvadratne devijacije (RMSD) predviđenog odgovora u odnosu na izmjereni odgovor, izračunato na slici 2. (a) RMSD greška od predviđenog istinitog odgovora za 159 gena koje je cMonkey identifikovao kao da imaju jedinstvene obrasce ekspresije i stoga nisu uključeni ni u jedan biklaster. (b) Ista greška u odnosu na nove podatke prikupljene nakon prilagođavanja modela/konstrukcije mreže za ovih 159 izolata.

Iako većina biklastera ima nove RMS vrijednosti podataka koje se dobro poklapaju sa RMS vrijednostima skupa za obuku, postoji i devet biklastera (biklasteri 1, 37, 77, 82, 99, 137, 161, 165 i 180) sa značajno višim RMS vrijednostima u novim podacima nego u podacima o obuci. Nismo uspjeli identificirati bilo koje značajke ovih izdvojenih bikusa (koherentnost biklastera, veličina biklastera, varijacija u uzorku i izvan njega za biklastere itd.) Po kojima se razlikuju od ostalih biklastera. Također smo istražili prediktivne performanse za 159 gena koje cMonkey nije uključio u biklastere. Pronašli smo dobre prediktivne performanse (preko novih podataka kao i podataka o obuci) za otprilike polovinu ovih gena - mnogo nižu stopu uspjeha nego što je to zabilježeno za gene predstavljene biklasterima. Postoji niz mogućih objašnjenja za ovu smanjenu sposobnost predviđanja gena koji također izbjegavaju biklasterizaciju. Usrednjavanje nivoa ekspresije nad genima koji su koregulisani unutar biklastera može se smatrati usrednjavanjem signala, i stoga su pojedinačni geni skloniji i sistematskoj i slučajnoj grešci od nivoa ekspresije biklastera. Drugo moguće objašnjenje je da su ti neuhvatljivi geni pod utjecajem TF -a koji stupaju u interakciju s neopaženim faktorima, poput metabolita. Postoji i oko pet uslova koje ne možemo dobro predvidjeti u odnosu na ostalih 264 uslova (velike vrijednosti RMS -a u obuci i novi podaci Slike 2 i 3). Nije iznenađujuće što se svih ovih pet uvjeta nalazi neposredno nakon velikih poremećaja u vremenskim serijama, kada sistem dramatično fluktuira dok ponovo uspostavlja zastoj.

Također smo proveli nekoliko testova kako bismo utvrdili koliko je naša formulacija modela i postupak prilagođavanja izvedena u usporedbi s tri pojednostavljene formulacije, kako je detaljno opisano u datoteci dodatnih podataka 1. Ukratko, ovi dodatni testovi pokazuju da je naša trenutna formulacija za vremensko modeliranje bitna za performanse ovog postupka (srednji RMSD bez vremenskog modeliranja 0,40 značajnost usporedbe s punim modelom P < 10 -10 , upareno t test) i proizvodi znatno više oskudnih modela. Oni također pokazuju da modeli ograničeni na jedan prediktor po biklasteru rade znatno lošije u odnosu na nove podatke (srednja RMSD sa samo jednim prediktorom po biklasteru 0,43 P < 10 -16 ). Konačno, dodatni testovi pokazuju da naše uključivanje interakcija u trenutnu formulaciju modela poboljšava prediktivnu moć (srednja RMSD bez interakcija 0,41, P & lt 0,03).

Homeostatička kontrola ključnih bioloških procesa od prethodno nekarakteriziranih trhporodica

The trh porodica regulatora u Halobacterium (uključujući trh1 to trh7) su članovi LrpA/AsnC obitelji, regulatori koji su široko rasprostranjeni po bakterijskim i arhejskim vrstama [35]. Njihova specifična uloga u regulaciji Halobacterium NRC-1 geni su bili, prije ove studije, nepoznati. Predviđamo da četiri od trh proteina igraju značajnu ulogu u koordinaciji ekspresije različitih staničnih procesa s konkurentnim transportnim procesima. Slika 4 prikazuje Cytoscape izgled okruženja podmreže trh3, trh4, trh5, i trh7. Postoji značajna sličnost u funkcijama koje predstavljaju biklasteri koje regulira svaki od trh proteina, što daje neke naznake da naučeni utjecaji imaju biološki značaj. Štaviše, svaki trh protein reguliše jedinstveni skup biklastera. Koristeći predviđenu podmrežu možemo formirati visoko usmjerene hipoteze o regulaciji koja posreduje homeostatsku ravnotežu različitih funkcija u ćeliji. Naše predviđanje za trh3, na primjer, da je on potiskivač sistema za apsorpciju fosfata i aminokiselina i da je ko-reguliran sa (i stoga mogućim aktivatorom) različitih metaboličkih procesa koji uključuju potrošnju fosfata. Trh3 stoga se čini ključnim za Halobacterium NRC-1 homeostaza fosfata (ograničavajući faktor u Halobacterium prirodno okruženje). Slične izjave/hipoteze mogu se izvući iz naučene mreže za druge regulatore prethodno nepoznate funkcije na ovaj način, mreža predstavlja prvi korak ka dovršenju označavanja regulatorne komponente proteoma. Slika 5 prikazuje predviđeni profil ekspresije za 12 biklastera prikazanih na slici 4.

Osnovna regulacija procesa/homeostaza, uključujući različite transportne procese, do trh3, trh4, trh5, trh7, tbpD, i kaiC. Biklasteri (pravokutnici čija je visina proporcionalna broju gena u biklasteru i širina proporcionalna broju uslova uključenih u biklaster) obojeni su funkcijom, kao što je naznačeno u legendi. U slučajevima gdje je više funkcija prisutno u jednom bikluru, navedene su najviše zastupljene funkcije.

Prediktivne performanse na biklusterima koji predstavljaju ključne procese. Svaki grafikon prikazuje bikluster s dominantnom funkcionalnom temom sa slike 4. Crvena linija označava izmjereni profil izraza, a plava linija prikazuje profil prema mrežnom modelu. Uslovi u krajnjem lijevom dijelu svake grafike uključeni su u biklaster, srednji regioni pokazuju uvjete isključene iz biklastera, a krajnji desni dio svake grafike odgovara 24 mjerenja koja nisu bila dio originalnog skupa podataka. Dva krajnja desna regiona svake grafike, stoga, pokazuju moć predviđanja nad uslovima koji nisu u skupu za obuku. Parametri modela procjene rađeni su samo krajnje lijevo/zeleno.

Eksperimentalna provjera regulatornih utjecaja

Sada ukratko opisujemo tri slučaja u kojima su predviđeni regulatorni utjecaji podržani daljnjim eksperimentima.

VNG1179Caktivira ATPazu P1 tipa koja prenosi Cu

Predviđamo da je bikluster 254, koji sadrži pretpostavljenu ATP-vrstu P1-vrste koja prenosi Cu, reguliran grupom koreliranih TF-ova koji sadrže VNG1179C i VNG6193H - dva regulatora sa navodnim domenima za vezivanje metala [28]. Ovi regulatori postavili su atraktivne mete za dalju istragu. Inferelator to predviđa VNG1179C i/ili VNG6193H su aktivatori transkripcije yvgX (član biklastera 254). VNG1179C je Lrp/AsnC porodični regulator koji također sadrži TRASH domenu koja veže metal [35, 36]. Sojevi s brisanjem pojedinačnih gena u okviru oba VNG1179C i yvgX (jedan od predloženih ciljeva i poznati transporter bakra) rezultirao je sličnim smanjenim rastom prisutnosti Cu. Nadalje, nedavna analiza mikromreža potvrdila je da, za razliku od divljeg tipa, yvgX nivo transkripta ne regulira Cu u VNG1179C izbrisani soj. Ovaj nedostatak aktiviranja yvgX u VNG1179C delecijski soj je rezultirao slabim rastom prisutnosti Cu za sojeve s delecijom u svakom od dva gena (Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS, osobna komunikacija).

SirRregulira ključne transportne procese

SirR ranije je opisivan kao regulator uključen u otpornost na izgladnjivanje željeza u Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus aureus. SirR je vjerovatno Mn i Fe ovisan transkripcijski regulator u nekoliko mikrobnih sistema i homolog za dtxR [37]. Postoji snažan homolog S. epidermidis sirR u Halobacterium genom, ali uloga ovog proteina u Halobacterium regulatorni krug nije utvrđen. To smo predvideli sirR i kaiC su centralni regulatori, uključeni u regulaciju biklastera povezanih sa transportom Mn/Fe, kao što je biklaster 76 (Slika 1b). U ovaj biklaster su uključena tri gena, tj zurA, zurM i ycdH, koji zajedno kodiraju pretpostavljeni ABC transporter specifičan za Mn/Fe, u skladu s nedavnim zapažanjem da sirR je potrebno za preživljavanje metalom izazvanog stresa (Kaur A, Pan M, Meislin M, El-Geweley R, Baliga NS, lična komunikacija). Slika 6 prikazuje predviđene i izmjerene nivoe ekspresije za biklus 76 kao funkciju pretpostavljenih regulatora (sirR, kaiC) za sve uslove, uključujući vremenske serije, ravnotežna mjerenja, nokaute i nove podatke. Imajte na umu da su regulatorni uticaji za ovaj biklaster zaključeni samo koristeći 189 uslova (od ukupno 268 mogućih) koji cMonkey uključeni u ovaj biklaster isključeni uslovi bili su ili male varijance ili nisu pokazivali koherentnu ekspresiju za gene u ovom biklasteru. SirR Profili mRNA u svih 268 originalnih eksperimentalnih uslova su u pozitivnoj korelaciji sa promenama nivoa transkripta u ova tri gena. Međutim, nakon brisanja SirR, nivoi mRNA ova tri gena porasli su u prisustvu Mn, što ukazuje na to SirR funkcionira kao potiskivač u prisutnosti Mn, za razliku od našeg predviđanja. U stvari, primijećena je dvostruka uloga u regulaciji za najmanje jedan protein u porodici regulatora prema kojima SirR pripada, koji funkcioniše kao aktivator i represor u uslovima niskog i visokog Mn, respektivno [38]. Iako je potrebno daljnje istraživanje, Inferelator je uspješno identificirao dio ovog regulatornog odnosa i ispravno uparivanje regulatora i cilja.

Izmjereni i predviđeni odgovor na transportne procese (biklaster 76). Crveno prikazuje izmjereni odgovor biklastera 76 u 277 uslova (nivoi ekspresije mRNA mjereni kako je opisano u odeljku Materijali i metode, u tekstu). Bicluster 76 predstavlja transportne procese koje kontrolišu regulatori KaiC i SirR (Slika 1b). Plava prikazuje vrijednost koju predviđa mreža utjecaja regulatora. Uslovi u (a) odgovaraju uslovima uključenim u biklus 76 (uslovi za koje ovi geni imaju veliku varijaciju i koherentni su). (b) Prikazuje uslove izvan biklastera, ali u originalnom/skupu podataka za obuku. (Ove regije nisu korištene za uklapanje modela za dvoklaster 76, jer su modeli bili prilagođeni samo u uvjetima dvoklastera.) (c) Sadrži uvjete/mjerenja koja nisu bila dio izvornog skupa podataka i stoga nisu bila prisutna prilikom izvođenja biklusteriranja i naknadnih procedura zaključivanja/prilagođavanja modela. Regije B i C pokazuju da nema snage predviđanja uzorka.

TfbFaktivira proteinsku komponentu ribosoma

Halobacterium NRC-1 ima više kopija ključnih komponenti svoje opće mašine za transkripciju (TfbA to TfbG i TbpA to TbpF). Tekuće studije usmjerene su na određivanje stepena do kojeg su ove višestruke kopije općih TF-ova odgovorne za diferencijalnu regulaciju ćelijskih procesa (Facciotti MT, Bonneau R, Reiss D, Vuthoori M, Pan M, Kaur A, Schmidt A, Whitehead K, Shannon P, Dannahoe S, lična komunikacija), [39]. Mi to predviđamo TfbF je aktivator gena koji kodiraju ribosomalne proteine. Geni za kodiranje ribosomalnih proteina raspoređeni su u sedam biklastera, za koje se predviđa da će svih sedam kontrolirati TfbF. Ovo predviđanje je potvrđeno mjerenjem interakcija protein-DNA za TfbF ChIP-chip analizom kao dio sistemske studije o Tfb i Tbp obrasci vezivanja u cijelom genomu (Facciotti MT, Bonneau R, Reiss D, Vuthoori M, Pan M, Kaur A, Schmidt A, Whitehead K, Shannon P, Dannahoe S, lična komunikacija).


DISKUSIJA

Naši rezultati pokazuju da prolazna endoreplikacija stvara poliploidne (≥8C) ćelije koje se mogu vratiti u podjelu sklonu greškama, što može uzrokovati ozbiljnu nestabilnost genoma mriještanjem proliferativnih aneuploidnih stanica. Iako poliploidni IEC sastavljaju multipolarna vretena koja počinju prolaziti kroz multipolarnu anafazu tijekom RTM -a, često u citokinetičkoj brazdi postoje hromozomi koji zaostaju, što rezultira neuspjehom u citokinezi. To može dovesti do dvije ćelije kćeri s vrlo različitim sadržajem genoma. iEC-ovi koji su se vraćali u mitozu imali su niže nivoe HSET-a, a njegova prekomjerna ekspresija je djelomično spasila multipolarnost vretena u podjeli iEC-a, u skladu s njegovom poznatom ulogom u grupiranju centrosoma. Međutim, ekspresija HSET-a dovela je do samo skromnog smanjenja CIN-a, što sugerira da dodatni smanjeni geni u iEC-ovima vjerovatno doprinose CIN-u tokom RTM-a. Uzeto zajedno, naše studije pružaju model za razumijevanje mehanizama pomoću kojih alternativni ćelijski ciklusi dovode do razvoja poliploidije i kako ove podjele sklone greškama na kraju dovode do genomske nestabilnosti.

Perturbacija ćelijskog ciklusa može izazvati poliploidiju

Odgovori ćelija na perturbaciju ćelijskog ciklusa su veoma heterogeni, uključujući zaustavljanje ćelijskog ciklusa, mitotičko klizanje ili smrt ćelije. Na primjer, agensi koji oštećuju DNA, inhibitori kinaze ćelijskog ciklusa i antimikrobni agensi mogu izazvati poliploidizaciju ili mitotsko klizanje (Roberts et al., 1990. Verdoodt et al., 1999 Erenpreisa et al., 2005, 2008 Puig et al., 2008). Iz našeg rada jasno je da se ćelije mogu inducirati u varijantne ćelijske cikluse, što rezultira visokom ploidnošću s niskim nivoom ćelijske smrti. Nedavne studije pokazuju da mitotički neuspjeh obično prati zaustavljanje ćelijskog ciklusa ovisno o p53 ili ćelijska smrt putem aktivacije Hippo puta (Ganem i Pellman, 2012. Ganem et al., 2014). Nasuprot tome, otkrili smo da su p53 + HCT-116 ćelije podvrgnute endoreplikaciji nakon tretmana RO3306 ili SU6656 umjesto da su zaustavljene u tetraploidnom stanju, što ukazuje da endoreplikacija može biti alternativa pomoću koje stanice izbjegavaju mitotičku katastrofu. Osim toga, naši podaci pokazuju da se većina ćelijskih smrti događa nakon povratka IEC -a u mitozu, a ne nakon početnog liječenja lijekom. Endociklirajuće ćelije mogu imati viši prag apoptoze (Zheng et al., 2012) i toleriraju visok nivo oštećenja DNK (Ullah et al., 2008, 2011 Davoli i de Lange, 2011). U Drosophila, prirodne i inducirane endociklične stanice ne apoptoziraju kao odgovor na genotoksični stres, jer potiskuju put p53 (Mehrotra et al., 2008 Hassel et al., 2014 Zhang et al., 2014). Nadalje, mreža odgovora na oštećenje DNA regulirana je prema gore kako bi se spriječili odgovori oštećenja u induciranim endoreplicirajućim embrionalnim fibroblastima miša, što također može objasniti kako endociklirajuće stanice mogu imati viši apoptotički prag (Zheng et al., 2012). Ove studije zajedno podržavaju ideju da varijantni ćelijski ciklusi, kao što su oni koji se javljaju kod endoreplikacije, mogu biti važan, ali nedovoljno cijenjen doprinos preživljavanju ćelija i genomskoj nestabilnosti.

Jedno pitanje bez odgovora je kako ćelije biraju da se podvrgnu endociklu u odnosu na endomitozu. U nekim slučajevima ovo je razvojni izbor. Na primjer, gigantske ćelije trofoblasta kod sisavaca i stanice žlijezda slinovnica u Drosophila oba snažno potiskuju funkciju CDK1 i imaju oscilacije Cdk2/ciklina E naizmjenično s APC/Cdh1 (Palazón et al., 1998 Hattori et al., 2000 Edgar i Orr-Weaver, 2001). Nasuprot tome, megakariociti postaju poliploidni endomitozom (Jackson, 1990) zbog, barem djelomično, sniženih nivoa Cdk1/ciklina B (Ravid et al., 2002.). Naše otkriće da visoke koncentracije RO3306 induciraju endocikle, dok niže koncentracije induciraju endomitozu sugerira da je Cdk1 važan posrednik u izboru između endocikla i endomitoze. Zajedno, ovi rezultati podržavaju ideju da su endocikl i endomitoza varijacije na kontinuumu s različitim stupnjevima potiskivanja oscilatora mitotičke kinaze.

Smanjena regulacija ključnih mitotičkih igrača može dovesti do defektne segregacije kromosoma i citokineze

Kinezin-14 HSET esencijalan je za grupiranje centrosoma u stanicama s centrosomskom amplifikacijom (Kwon et al., 2008). U tetraploidnim stanicama grupisanje centrosoma na dva pola dovodi do defekata u diobi stanica zbog nepravilnog vezivanja kinetohora -mikrotubula koje nastaje na prolaznim multipolarnim vretenima (Ganem et al., 2009.). Naši podaci podržavaju ideju da poliploidne ćelije imaju povećanu razinu multipolarnosti i neuspjeh u grupiranju centrosoma u usporedbi s podjeljenim tetraploidnim stanicama, potencijalno pojačavajući opseg klatnih kinetohora -mikrotubula (Fujiwara et al., 2005.). U skladu s ovom idejom, otkrili smo da je HSET sniženo reguliran u iEC-ovima i da je prekomjerna ekspresija HSET-a smanjila opseg multipolarnosti vretena. Nadalje, naša zapažanja sugeriraju da povećanje nepovezanih kinetohora u poliploidnim stanicama može dovesti do povećanih zaostalih kromosoma što rezultira neuspjehom citokineze. Zaista, kinezin-14 ncd bio je među genima koji su smanjeni u regulaciji Drosophila endociklirajuće stanice, a naši sadašnji nalazi podržavaju ideju da humani kinezin-14, HSET, također može biti važan igrač u vjernosti segregacije kromosoma tijekom RTM poliploidnih stanica. Prethodne studije su također pokazale da je slična grupa mitotičkih gena regulisana Drosophila i ćelije za endocikliranje miša (Maqbool et al., 2010. Chen et al., 2012 Pandit et al., 2012). Atraktivan model je da ovaj niži nivo ekspresije mitotičkog gena doprinosi višestrukim defektima u formiranju vretena, segregaciji kromosoma i citokinezi kada se endoreplicirajuće ćelije vrate u mitozu.

Jedno zanimljivo zapažanje je da se nakon RTM-a iEC-ovi vraćaju na hromozomski broj sličan onom u početnoj populaciji, što sugerira da ove poliploidne ćelije prolaze kroz diobe koje smanjuju sadržaj genoma. Takve redukcijske genomske podjele prvi su put opisane u tetraploidnim fibroblastima, a kasnije su pronađene u različitim tipovima stanica (Duncan et al., 2010 Fox et al., 2010 Hassel et al., 2014. Schoenfelder et al., 2014). Prethodne studije su zaključile da su multipolarne diobe ćelija u poliploidnim hepatocitima miša rezultirale preokretom ploidije u jednom koraku na potomstvo sa prepolovljenim ili četvrtinama sadržaja genoma (Duncan et al., 2010). U skladu s ovim zapažanjem, otkrili smo da naši iEC -i imaju multipolarna vretena i prolaze kroz višepolarnu anafazu. However, due to cytokinesis failure, iEC RTM usually resulted in two or three daughter cells of different sizes and DNA contents. Kinetochore analysis of the first-generation progeny in these cells showed highly variable levels of chromosomes in the resulting daughter cell nuclei, suggesting that ploidy reversal is not a one-step process in the iECs. In addition, our FACS data suggest that ploidy reversal occurs over successive cell divisions, ultimately resulting in a DNA content that is similar to that in control cells. Of interest, it was recently shown in an analysis of tumors with numerical CIN that both diploid and tetraploid chromosomal populations converged on a near-triploid DNA content, suggesting that there is likely some type of selective advantage to maintaining a certain level of aneuploidy (Laughney et al., 2015).

Consequence of CIN after transient endoreplication

A potential shortcoming of genome reductive mitosis is that mitotic cells do not have enough genome content to buffer the deleterious effects of the massive aneuploidy that occurs in these divisions. Multipolar cell divisions in cells with excess centrosomes typically result in low viability of the progeny (Ganem et al., 2009.). In contrast, the kinetochore distribution analysis of our polyploid cells suggests that progeny from these divisions have a larger number of kinetochores and thus likely have a higher probability to have at least one complete set of chromosomes. In addition, the high cytokinesis failure rate during RTM in polyploid cells results in only two or three daughter cells, decreasing the probability of cells containing incomplete chromosomal complements incompatible with life. Our studies also show that iEC daughters undergo multiple rounds of division to ultimately reduce the genome, but the fraction of cells that ultimately survive is not known. A future goal will be to assess the precise mechanisms by which polyploid cells return to a near-triploid state.

Aneuploidy after RTM in polyploid cells after transient endoreplication may lead to karyotype evolution and selective cellular advantage. Our FISH analysis of chromosomes 2 and 7 demonstrated that the chromosomes are not evenly distributed into daughter cells during polyploid divisions, suggesting that these cells have high levels of CIN and a different chromosome composition from the original cell population. It has been proposed that high levels of CIN allow for selective advantages in the subsequent daughter cells due to the selection of certain favorable chromosomal complements (Duncan, 2013). In contrast, error-prone divisions in tetraploid cells usually lead to loss or gain of only a few chromosomes in daughter cells, resulting in subclones with accumulated mutations (Storchova and Pellman, 2004 Fujiwara et al., 2005.). A more striking example is that the aneuploid daughters that arise after polyploid divisions in mouse hepatocytes quickly adapt to external stress (Duncan et al., 2012). A future goal will be to understand whether and how these polyploid divisions lead to favorable karyotypes and the underlying molecular mechanisms that govern this selection.

Polyploid mitosis could contribute to cancer relapse

CIN followed by selection of aneuploid cells is proposed to play a major role in tumorigenesis (Storchova and Pellman, 2004 Fujiwara et al., 2005 Weaver et al., 2007 Williams et al., 2008 Davoli and de Lange, 2011 Varetti and Pellman, 2012 Silk et al., 2013.). Our data suggest that transient iECs are a potent contributor to CIN and aneuploidy, suggesting that transient iECs may contribute to tumorigenesis. It is well known that many cancers are polyploid and that polyploidy often correlates with poor prognosis (Davoli and de Lange, 2011), but it is not clear what the mechanistic link is between these observations. Some studies suggest that polyploidy invariably leads to senescence or apoptosis (Verdoodt et al., 1999), consistent with our observation that a fraction of polyploid cell divisions result in cell death. It is well established that many chemotherapeutic agents target the cell cycle, resulting in a failure in cell cycle progression and a triggering of apoptosis. However, we propose that a fraction of the cells escape apoptosis and instead enter the alternative cell cycle state of endocycle or endomitosis (Figure 9). When cells undergo endoreplication, they are resistant to genotoxic stress, such as would be caused by radiation therapy. Thus a transient switch to endoreplication could provide a mechanism for therapy resistance. On discontinuation of the chemotherapy, these transient iECs would be competent to resume mitotic divisions, which are highly error-prone. In this sense, error-prone RTM would elevate rates of genome instability, with microselection of proliferative aneuploid daughters contributing to tumor regrowth. Taken together, our findings support the idea that a return to mitosis by polyploid iECs may be an underappreciated aspect of tumorigenesis and provide a novel inroad into the identification of new therapeutic strategies.

FIGURE 9: Model. After treatments that perturb cell cycle progression, a fraction of the cells escape apoptosis and instead enter the alternative cell cycle state of endoreplication (endocycle/endomitosis). Switching to endoreplication may provide a mechanism for therapy resistance. On discontinuation of the perturbation, many cells die, but a fraction of these polyploid cells resume mitotic divisions, which are highly error-prone, contributing to tumor heterogeneity and leading to cancer relapse.


Diskusija

The results presented here show a central role for endogenous Myc in epidermal homeostasis. The reduction of the proliferative compartment led to premature differentiation both in vivo and in culture. However, keratinocytes were capable of cycling in vivo in the absence of Myc, and drastic cell-cycle phasing defects were not observed in proliferative cells, in agreement with observations in dmyc Drosophila mutants (Johnston et al., 1999). It is worth noting, though, that an upregulation of L-myc was detected in younger mice before the more severe phenotype arose. A possible compensatory effect by L-myc or other pathways supporting proliferation in KO epidermis, cannot be ruled out. However, keratinocytes continued to cycle in adult mice even when L-myc and B-myc were downregulated and N-myc was undetectable. In addition, neither a compensatory effect nor the presence of cells carrying undeleted Myc was detected in culture, as no growing clones were obtained from any KO mouse. Nevertheless, the hyperproliferation involved in wound healing, hair follicles and stratified cultures was consistently and severely compromised, indicating that Myc is required for rapid epidermal proliferative cycles.

Myc, cell size and endoreplication

KO cells were significantly smaller, suggesting that cellular growth might be the primary defect in keratinocytes without Myc, causing the observed effects on the proliferation/differentiation balance. Suppression of Myc activity in epidermis also impaired keratinocyte endoreplication. Endoreplication has been often disregarded or poorly studied in mammalian organisms, in spite of the fact that it is found in various human tissues including epidermis (Gandarillas et al., 2000) (J.Z. et al., unpublished), and that it might have an important role in cellular growth (for example, see Edgar and Orr-Weaver, 2001). A correlation between DNA ploidy, cell-size and -differentiation has been observed in plants, Drosophila and mammals, but their interdependence is not clear. However, it has been shown that endoreplication allows plant cells to increase in size, also during epidermal differentiation (Traas et al., 1998 Kondorosi et al., 2000). Our present data suggest that endoreplication is not required for terminal differentiation to take place, but that it is necessary for the cell enlargement that occurs during normal post-mitotic differentiation (Banks-Schlegel and Green, 1981 Gandarillas et al., 2000).

Myc and stem cell function

A possible role of Myc in regulating stem cell biology has been recently proposed (Gandarillas and Watt, 1997 Waikel et al., 2001 Arnold and Watt, 2001). Our data show that Myc KO stem cells are unable to amplify and have a limited life span in culture, and give rise to a limited proliferative progeny in vivo. Reconciling the data reported for the exogenous and the endogenous gene on keratinocytes reveals that Myc pushes stem cells into clonal expansion along the differentiation programme when overactivated (Gandarillas and Watt, 1997 Waikel et al., 2001 Arnold and Watt, 2001), but causes stem cell daughters to enter premature differentiation when absent. Altogether our results suggest that the stem cell turnover is higher and that their compartment might be reduced, in adult Myc KO epidermis. A logical rationale to explain this seems that incapable to undergo rapid amplification and in order to sustain epidermis, stem cells are forced to divide and undergo differentiation more frequently and therefore, their compartment might be progressively reduced. This would explain why the difference observed in the replication index between KO and control epidermis at a given time was not drastic and yet the proliferative compartment (TAC) was reduced. According to this, Myc would not be required for stem cell divisions, nor `a switch' of the stem cell decision to enter the differentiation programme (Gandarillas et Watt, 1997), but it would be `an amplifier' of such a decision (Fig. 9). If this model is correct, the skin should have more difficulties to grow with time and indeed, a more severe phenotype appeared after 2 or 3 months of age. Another expectable consequence of forcing stem cells to divide more frequently is that the epidermis would age prematurely, and this seems to be the case of adult KO skin, since it appeared atrophic and slow regenerating. Altogether, a correct Myc activity appears essential for normal stem cell function and renewal.

Myc and cell growth

The tight and shiny skin and the reduced body size of epidermal Myc KO mice resemble the phenotype of epidermal-specific transgenics for the keratinocyte growth-inhibitory factor TGF-β (Sellheyer et al., 1993), which is known to downregulate Myc. These features are also reminiscent of the `tight skin contracture' human inherited lethal syndrome affecting newborns (Lowry et al., 1985 Lenz and Meschede, 1993 Abrahamson and Stone, 2002). Interestingly, this condition has been described by some authors as `generalised skin atrophy' or hypoplasia (Lenz and Meschede, 1993), and this is consistent with our observations.

A key remaining question is whether mammalian Myc function and cell growth are coupled to cell division. Johnston et al. (Johnston et al., 1999) concluded that Drosophila dmyc stimulates the G1/S transition independently of mitosis control, thus resulting in increased cell size. We made similar observations after constitutive activation of Myc in human keratinocytes, which resulted in cell size increase upon a cell division block (Gandarillas et al., 2000). This coincidence is consistent with the fact that dmyc and Myc share biological activities (Gallant et al., 1996 Schreiber-Agus et al., 1997). However, by reducing Myc expression in the whole mouse body, Trumpp et al. (Trumpp et al., 2001) found fewer cells of normal size in some organs. They suggested that Myc is not essential for cellular growth and instead controls the decision of cells to divide or not to divide, due to a tighter coupling of cell growth and cell division in mammals. Our results show that endogenous Myc controls mammalian epidermal cell size both in proliferative and especially, in postmitotic cells. Two possible reconciling explanations for such discrepancy are that the mice analysed by Trumpp et al. had some remaining Myc expression, and/or that the consequences of Myc function are tissue dependent and cell context dependent rather than species specific. Interestingly, Myc produced larger cells when overexpressed (Kim et al., 2000) and smaller cells when inactivated (Baena et al., 2005), in mouse liver, another endoreplicative tissue. Interestingly, two different groups have reported a requirement of dmyc in Drosophila endoreplication (Maines et al., 2004 Pierce et al., 2004). A selective advantage of cells overexpressing dmyc in Drosophila has also been recently reported by inducing apoptosis of cells with lower levels of dmyc (de la Cova et al., 2004 Moreno and Basler, 2004). Whether this effect is related or not to cell growth remains to be elucidated. A role for Myc in stem cell renewal has also been very recently reported by Wilson et al. (Wilson et al., 2004) in bone marrow. In agreement with our observations, the authors conclude that Myc is not required for stem cell proliferation, although in this case they find an accumulation of stem cells. Different tissue-regulatory mechanisms and cell contexts might account for the different consequences of Myc function (a similar conclusion has been drawn from overexpression of Myc in mouse liver by Beer et al.) (Beer et al., 2004).

The study presented here shows that at least in some tissues and as for dmyc in flies, mammalian Myc function and cell growth are not tightly coupled to cell division. This implies that in addition to cell growth control deregulation, oncogenic alterations may have to hit the mitosis checkpoint to trigger tumorigenesis. In all cases reported, nevertheless, endogenous or exogenous Myc function resulted in increased biomass production, an advantage that tumours would clearly not hesitate to select. Unifying Myc functions in the mammalian body and carcinogenesis should now be the challenge.


Pogledajte video: DNA Replication Updated (Decembar 2022).