Informacije

B2. Određivanje sekvence pomoću masene spektrometrije - Biologija

B2. Određivanje sekvence pomoću masene spektrometrije - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Masena spektrometrija zamjenjuje tradicionalnije metode (vidi gore) kao izbor za određivanje molekularne mase i strukture proteina. Njegova moć dolazi od izuzetne osjetljivosti i savremenih računskih metoda za određivanje strukture kroz poređenje podataka jonskih fragmenata sa računarskim bazama poznatih proteinskih struktura. U spektrometriji mase, molekula se najprije ionizira u izvoru iona. Nabijene čestice se zatim električnim poljem ubrzavaju u analizator mase gdje se podvrgavaju vanjskom magnetskom polju. Vanjsko magnetsko polje stupa u interakciju s magnetskim poljem koje nastaje kretanjem nabijenih čestica, uzrokujući njihovo skretanje. Otklon je proporcionalan omjeru mase i naboja, m/z. Ioni tada ulaze u detektor koji je obično fotomultiplikator. Unošenje uzorka u izvor jona odvija se jednostavnom difuzijom gasova i isparljivih tečnosti iz rezervoara, ubrizgavanjem tečnog uzorka koji sadrži analit raspršivanjem fine magle, ili za veoma velike proteine ​​desorbovanjem proteina iz matrice pomoću lasera. Analiza složenih smjesa vrši se spajanjem HPLC sa masenom spektrometrijom u LCMS.

Izvor iona: Postoji mnogo metoda za ioniziranje molekula, uključujući kemijsku ionizaciju atmosferskog tlaka (APCI), kemijsku ionizaciju (CI) ili udar elektrona (EI). Najčešće metode za analizu proteina/peptida su ionizacija elektroraspršivanjem (ESI) i matrično potpomognuta laserska desorpcijska ionizacija (MALDI).

Ionizacija elektrosprejom (ESI) – Analit, otopljen u isparljivom otapalu poput metanola ili acetonitrila, ubrizgava se kroz finu kapilaru od nehrđajućeg čelika pri sporom protoku u izvor jona. Na kapilari se održava visoki napon (3-4 kV) koji daje pozitivan naboj u odnosu na drugu suprotno nabijenu elektrodu. Tekuća tekućina postaje nabijena istim polaritetom kao i polaritet pozitivno nabijene kapilare. Veliko polje dovodi do pojave uzorka kao nabijenog aerosolnog prskanja nabijenih mikrokapljica koje smanjuje elektrostatička odbijanja u tekućini. Ova metoda u suštini koristi električnu energiju za proizvodnju aerosola umjesto mehaničke energije za proizvodnju tekućeg aerosola, kao u slučaju raspršivača parfema. Oko kapilare teče plin (dušik) koji pomaže pomicanju aerosola prema analizatoru mase. Mikrokapljice postaju sve manje kako isparava hlapljivo otapalo, povećavajući gustoću pozitivnog naboja na kapljicama. Na kraju elektrostatička odbijanja uzrokuju da kapljice eksplodiraju u nizu koraka, stvarajući na kraju analit bez rastvarača. Ova nježna metoda ionizacije proizvodi analite koji nisu cijepani, ali spremni za uvođenje u analizator mase. Proteini nastaju iz ovog procesa sa otprilike Gausovom raspodjelom pozitivnih naboja na osnovnim bočnim lancima. U organskoj hemiji proučavali ste masene spektre malih molekula izazvanih bombardiranjem elektrona. To proizvodi ione +1 naboja dok se elektron odvaja od neutralne molekule. Najviši vrh m/z u spektru je roditeljski ion ili ion M+. Najveći omjer m/z koji se može otkriti u spektru masa je u hiljadama. Međutim, veliki peptidi i proteini s velikom molekularnom masom mogu se otkriti i razlučiti jer je naboj na ionima veći od +1. Godine 2002. John Fenn je dobio Noble nagradu u hemiji za razvoj i upotrebu ESI za proučavanje bioloških molekula.

Primjer ESI spektra apo-mioglobina prikazan je u nastavku. Obratite pažnju na otprilike Gausovu distribuciju pikova, od kojih svaki predstavlja netaknuti protein sa nabojem koji se razlikuje za +1. Proteini imaju pozitivne naboje kako zbog protonacije bočnih lanaca aminokiselina, tako i zbog naboja induciranih tokom samog procesa elektrolutalice. Na osnovu sekvence aminokiselina mioglobina i pretpostavke da je pKa bočnih lanaca isti u proteinu kao i za izolovane aminokiseline, izračunati prosječni neto naboji apoMb bi bili približno +30 pri pH 3,5, +20 pri pH 4,5, +9 pri pH 6 i 0 pri pH 7,8 (izračunati pI). Donji maseni spektar snimljen je direktnim ubrizgavanjem u MS apoMb u 0,1% mravljoj kiselini (pH 2,8). Naboji na peptidu su kombinirani rezultati naboja prisutnih na peptidu prije elektrosprej i promjena naboja induciranih tokom procesa. www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/...onisation.html. .

Slika: ESI maseni spektar apo-mioglobina

Molekularna masa proteina može se odrediti analizom dva susjedna vrha, kao što je prikazano na slici ispod.

Ako je M molekulska masa proteina analita, a n broj pozitivnih naboja na proteinu predstavljenih u datom m/z piku, tada sljedeće jednadžbe daju molekulsku masu M proteina za svaki vrh:

[Mpeak2 = n (m/z) vrh 2 - n (1.008) ]

[Mpeak1 = (n + 1) (m/z) vrh 1 - (n +1) (1.008) ]

gdje je 1,008 atomska težina H. Pošto postoji samo jedna vrijednost M, dvije jednačine se mogu postaviti jednake jedna drugoj, dajući:

[n(m/z)vrh 2 - n(1,008) = (n + 1) (m/z)vrh 1 - (n +1) (1,008)]

Rješavanje za n daje:

[n = [(m/z) vrh 1- 1.008]/[(m/z) vrh 2 - (m/z) vrh 1]. ]

Poznavajući n, molekulsku masu M proteina može se izračunati za svaki m/z vrh. Najbolja vrijednost M tada se može odrediti prosječnim vrijednostima M utvrđenim za svaki vrh (16.956 sa gornje brojke). Za pikove od m/z od 893-1542, izračunate vrijednosti n kretale su se od +18 do +10.

Jonizacija pomoću laserske desorpcije (MALDI): U ovoj tehnici, koja se koristi za veće biomolekule kao što su proteini i polisaharidi, analit se miješa sa apsorbirajućim materijalom matriksa. Lasersko pobuđivanje se koristi za pobuđivanje matrice, što dovodi do prijenosa energije koji dovodi do ionizacije i "lansiranja" matrice i analita u ionskom obliku iz čvrste smjese. Formiraju se vrhovi matičnih jona (M+H)+ i (M-H)-.

Mass Analyzer

Kvadrupolna ionska zamka (koristi se u ESI) - Složena mješavina iona može biti sadržana (ili zarobljena) u ovoj vrsti analizatora mase. Dva uobičajena tipa su linearni i 3D četveropolni.

Slika: Linearni i 3D kvadrupoli

Kako dipoli pokazuju razdvajanje pozitivnih i negativnih naboja na linearnoj osi, kvadrupoli imaju ili suprotne električne naboje ili suprotna magnetna polja na suprotnim krajevima kvadrata ili kocke. Kod razdvajanja naelektrisanja, monopol (zbir naelektrisanja) i dipoli poništavaju se na nulu, ali kvadrupolni moment ne. Kvadrupoli hvataju ione pomoću kombinacije fiksnih i izmjeničnih električnih polja. Zamka sadrži He na 1 mTorr. Za 3D zamku, prstenasta elektroda ima oscilirajući RF napon koji drži ione zarobljene. Završne kape imaju i naizmjenični napon. Ioni osciliraju u zamci sa "sekularnom" frekvencijom određenom frekvencijom RF napona i, naravno, odnosom m/z. Povećanjem amplitude RF polja preko elektrona u prstenu, kretanje iona u zamci postaje destabilizirano i dovodi do izbacivanja iona u detektor. Kada sekularna frekvencija kretanja iona odgovara primijenjenom izmjeničnom naponu na elektrode na završnoj kapici, dolazi do rezonancije i povećava se amplituda kretanja iona, što također dopušta curenje iz zamke iona u detektor.

Cijev za vrijeme leta (TOF) (koristi se u MALDI) - koristi se dugačka cijev i određuje se vrijeme potrebno za detekciju jona. Ionima male molekularne mase potrebno je najkraće vrijeme da dođu do detektora.

Tandem spektrometrija mase (MS/MS)

Četveropolni analizatori mase koji mogu odabrati ione različitih omjera m/z u ionskim hvatačima obično se koriste za tandem masenu spektrometriju (MS/MS). U ovoj tehnici, odabrani ioni se dalje fragmentiraju na manje ione procesom koji se naziva kolizijom izazvana disocijacija (CID). Kada se izvede na svim početnim ionima prisutnim u zamci iona, može se odrediti sekvenca peptida/proteina. Ova tehnika obično zahtijeva dva analizatora mase s kolizionom ćelijom između gdje su odabrani ioni fragmentirani pri sudaru s inertnim plinom. Može se izvesti i u jednom analizatoru mase pomoću kvadropolne ionske zamke.

U tipičnom MS/MS eksperimentu za određivanje proteinske sekvence, protein se cijepa na proteinske fragmente s enzimom kao što je tripsin, koji cijepa na karboksilnoj strani pozitivno nabijenih Lys i Arg bočnih lanaca. Prosječna veličina proteina u ljudskom proteomu je približno 50.000. Ako je prosječna molekulska masa aminokiseline u proteinu oko 110 (18 oduzeto od oslobađanja vode pri stvaranju amidne veze), prosječan broj aminokiselina u proteinu bio bi oko 454. Ako je 10% aminokiselina Arg i Lys, u prosjeku bi bilo približno 50 Lys i Arg, a time i 50 triptopskih peptida prosječne molekulske mase 1000. Fragmenti se unose u MS gdje se može izvršiti analiza otiska prsta fragmenta peptida. MW fragmenata se mogu identifikovati i uporediti sa poznatim fragmentima digestije peptida iz poznatih proteina da bi se identifikovao protein analita.

Da bi se dobile informacije o sekvenci, triptički peptid sa specifičnim omjerom m/z (optimalno s jednim +1 nabojem) dalje se odabire u ionskoj zamci i fragmentira pri sudaru s inertnim sredstvom (MS/MS). Budući da je m/e raspon masenih spektrometara u tisućama, triptični fragmenti s jednim punjenjem mogu se lako otkriti i usmjeriti na MS/MS. Vjerovatni i uočeni rascjepi za tetrapeptid i rezultirajuće ione sa +1 nabojem su ilustrovani u nastavku. Joni sa originalnim N terminusom su označeni kao a, b i c, dok su joni sa originalnim C terminusom označeni kao x, y i z. c i y joni dobijaju dodatni proton od peptida kako bi formirali pozitivno nabijene -NH3+ grupe. Stvarni uočeni joni zavise od mnogih faktora, uključujući sekvencu peptida, njegov originalni naboj, energiju sudara koja izaziva fragmentaciju, itd. Fragmentacija peptida niske energije u ionskim zamkama obično proizvodi a, b i y jone, zajedno sa vrhovi nastali gubitkom NH3 (a*, b*i y*) ili H2O (ao, bo i yo). Ne primjećuju se vrhovi koji su posljedica fragmentacije bočnih lanaca. Fragmentacija na dva mjesta u peptidu (obično na b i y mjestima u kralježnici) čini unutrašnji fragment.

Slika: Fragmentacija i sekvenciranje peptida pomoću MS/MS

Vrh y1 predstavlja C-terminalni Lys ili Arg (u ovom primjeru) triptičkog peptida. Vrh y2 ima jednu dodatnu aminokiselinu u odnosu na y1, a razlika u molekularnoj masi identificira ekstra aminokiselinu. Pik y3 je isto tako za jednu aminokiselinu veći od y2. Sva tri pika y fragmenta imaju zajednički Lys/Arg C-terminal, a nabijeni fragment sadrži C-terminalni kraj originalnog peptida. Svi vrhovi b fragmenta za dati peptid sadrže zajedničku N terminalnu aminokiselinu sa najmanjim b1. Imajte na umu da indeks predstavlja broj aminokiselina u fragmentu. Identifikacijom b i y vrhova može se odrediti stvarna sekvenca malog peptida. Obično se spektri podudaraju s bazama podataka za identifikaciju strukture svakog peptida i na kraju strukture proteina. Stvarne m vrijednosti za fragmente mogu se izračunati na sljedeći način, gdje je (N molekulska masa neutralne N terminalne grupe, (C) molekulska masa neutralne c terminalne grupe, a (M) molekulska masa neutralne aminokiseline.

  • a: (N)+(M)-CHO
  • b: (N)+(M)
  • y: (C)+(M)+H (imajte na umu na gornjoj slici da amino završetak y peptida ima dodatni proton u +1 nabijenim peptidima.)

m/z vrijednosti mogu se izračunati iz izračunatih m vrijednosti i dodavanjem jedne H mase ukupnom z ako je ukupni naboj +1, itd.

Tabela: Mase aminokiselinskih ostataka u proteinu. (Za N terminalnu aminokiselinu dodajte 1 H. za C kraj dodajte OH)

Ostaci

Kod

Monoizotopna misa

Prosječna masa

Ala

A

71.0779

Arg

R

156.101111

156.1857

Asn

N

114.042927

114.1026

Asp

D

115.026943

115.0874

Cys

C

103.009185

103.1429

Glu

E

129.042593

129.114

Gln

P

128.058578

128.1292

Gly

G

57.0513

Njegovo

H

137.058912

137.1393

Ile

I

113.084064

113.1576

Leu

L

113.084064

113.1576

Lys

K

128.092963

128.1723

Met

M

131.040485

131.1961

Phe

F

147.068414

147.1739

Pro

P

97.1152

Ser

S

87.0773

Thr

T

101.047679

101.1039

Trp

W

186.079313

186.2099

Tyr

Y

163.06332

163.1733

Val

V

99.1311

Kao primjer, ispišite ove vrijednosti MW, sekvenca humanog Glu1-fibrinopeptida B može se odrediti iz MS/MS spektra prikazanih u dolje označenom obliku. Imajte na umu da je većina b vrhova b* posljedica gubitka NH3 s N kraja.

Slika: Opisani MS/MS spektri humanog Glu1-fibrinopeptida B


12.4: Tumačenje spektra mase

Kada tumačite obrasce fragmentacije, možda će vam biti korisno znati da su, kao što ste očekivali, najslabije veze ugljik-ugljik one koje se najvjerojatnije raskinule. Možda ćete poželjeti da se pozovete na tabelu energija disocijacije veza kada pokušavate probleme koji uključuju interpretaciju masenih spektra.

Ova stranica prikazuje kako se formiraju obrasci fragmentacije kada se organski molekuli unose u maseni spektrometar i kako možete dobiti informacije iz masenog spektra.


I. UVOD

Dramatičan tehnološki napredak bioloških nauka u posljednjih nekoliko godina stvorio je novu eru istraživanja, uključujući i novo područje sistemske biologije. Iako je razumijevanje živih organizama na nivou molekularnog sistema još uvijek u povojima, očigledno je da su sveobuhvatna istraživanja ȁkaskade stripova” sa genomikom, transkriptomikom, proteomikom i metabolomikom važni gradivni blokovi i da će igrati centralnu ulogu u ovoj novoj nauci (vidi sliku 1). Integrativna analiza odgovora organizma na poremećaj na nivou transkriptoma, proteoma i metaboloma dovest će do boljeg razumijevanja biohemijskih i bioloških mehanizama u složenim sistemima. Međutim, dok su genomika, transkriptomika i proteomika napravili značajne korake u razvoju tehnologije, alati za sveobuhvatno ispitivanje metaboloma još uvijek se pojavljuju (Bino et al., 2004). Iako je metabolomika krajnja tačka kaskade “omics ” i najbliža je fenotipu, ne postoji platforma s jednim instrumentom koja trenutno može analizirati sve metabolite. Moguće, zato što barem postoji percepcija da se drugim ȁstrip” pristupima može upravljati pomoću jedne platforme, metabolomika je zaostala za drugim tehnologijama. Ovo je ilustrovano na slici 2, koja prikazuje bibliografsko pretraživanje koje sadrži riječi metabolomika, metabonomika i proteomika u Chemical Abstracts Plus (SciFinder Scholar). Dok su 1999. objavljena tri članka koji sadrže ključne riječi metabolomika ili metabonomika, broj se povećao na 147 članaka 2003. i 203 2004. godine. Štaviše, časopis Metabolomika (Springer) nedavno je pokrenut, a posvećen je objavljivanju rezultata istraživanja koji se odnose na razvoj tehnologije metabolomike, analizu i pohranu podataka, integrirane studije s drugim tehnikama “omics ” i aplikacije za metabolomiku. Sve veći broj publikacija na ovom području pokazuje da metabolomika nije samo nova riječ, već vrijedno novo sredstvo za proučavanje fenotipa i promjena u fenotipu uzrokovanih utjecajima okoliša, bolestima ili promjenama u genotipu. Sveobuhvatno istraživanje metaboloma je komplikovano njegovom ogromnom složenošću i dinamikom. Raspodjela metabolita podložna je velikoj vremenskoj i prostornoj varijabilnosti, na primjer, cirkadijalne fluktuacije u organizmima sisara su dobro poznate. Osim toga, biološka varijabilnost ovisna o prehrani u sustavima sisavaca može zakomplicirati analizu (Vigneau-Callahan i sur., 2001). Pažljiv eksperimentalni dizajn stoga je neophodan za uspjeh ove vrste istraživanja. Metabolom predstavlja ogroman broj komponenti koje pripadaju širokom spektru klasa jedinjenja, kao što su aminokiseline, lipidi, organske kiseline, nukleotidi, itd. Ova jedinjenja su veoma raznolika po svojim fizičkim i hemijskim svojstvima i javljaju se u širokom rasponu koncentracija . Na primjer, unutar samih lipida ne susreću se samo spojevi velike količine, poput masnih kiselina, triglicerida ili fosfolipida, već i komponente u tragovima s važnim regulatornim učincima, poput eikozanoida dobivenih iz arahidonske kiseline. Prema Beecheru, čini se da je 2.000 glavnih metabolita dobra procjena za ljude (Beecher, 2003.). Ovaj broj naravno može biti znatno veći s obzirom na sekundarne metabolite. Neki od ovih metabolita mogu biti hemijski posrednici od velikog biološkog značaja. U biljnom carstvu može se naći do 200 000 metabolita (Weckwerth, 2003). Slijedom toga, proučavanje metaboloma veliki je izazov za analitičku kemiju i metabolomijska analiza u pravom smislu te riječi, naime kvantitativna analiza svih metabolita, ne može se postići trenutnom analitičkom instrumentacijom.

Kaskada “Omics” sadrži složene skupove podataka koji kao entitet sveobuhvatno opisuju odgovor bioloških sistema na bolesti, genetske i ekološke perturbacije. Najmoćnija baza podataka integrirat će podatke sa svih omičkih razina. Međutim, od ovih baza podataka metabolom je najpredvidljiviji fenotip.

Bibliografska pretraga u Chemical Abstracts Plus koja sadrži ključne riječi metabolomics i metabonomics koristeći SciFinder Scholar (od 10. juna 2005.). Ukupno je pronađeno 696 članaka u časopisima. Skup podataka je dalje miniran korištenjem masene spektrometrije parametara pretraživanja ili NMR. Dijagram prikazuje učestalost ukupnih metabolomskih publikacija (crni kvadrati), publikacija koje pominju masenu spektrometriju (crne trake) i NMR (sive trake) od 1999. do 2004. godine.

Trenutno se za metabolomska istraživanja koriste dva komplementarna pristupa: metaboličko profilisanje i metabolički otisak prsta (vidi sliku 3) (Dettmer & Hammock, 2004). Sažetak definicija povezanih s metabolomikom dat je u tablici 1. Metaboličko profilisanje fokusira se na analizu grupe metabolita ili povezanih sa specifičnim metaboličkim putem ili klasom spojeva. Kvantitativna analiza masnih kiselina kao metil estera masnih kiselina pomoću GC-FID (detekcija plamene jonizacije) ili analiza aminokiselina su primjeri za metaboličko profiliranje. Još usmjereniji pristup je ciljna analiza koja ima za cilj mjerenje odabranih analita, poput biomarkera bolesti ili izloženosti toksikantima, ili supstrata i produkata enzimskih reakcija (Fiehn, 2002). U većini slučajeva metaboličko profilisanje je pristup zasnovan na hipotezama, a ne pristup koji generiše hipoteze. Na osnovu postavljenih pitanja odabiru se metaboliti za analizu i razvijaju specifične analitičke metode za njihovo određivanje. Ogroman tehnološki napredak u proteklih nekoliko godina omogućava konstantno širenje broja analita koji se kvantificiraju istovremeno u jednoj analizi. Tehnološki, analiza jednog biomarkera često je složena kao i profilisanje svih povezanih ključnih metabolita u datom biohemijskom putu. Međutim, posljednji rezultati će dati potpuniji i detaljniji opis metaboličkih poremećaja nego što to može dati jedan biomarker. Rezultati metaboličkog profiliranja kvantitativni su i idealno neovisni o tehnologiji koja se koristi za prikupljanje podataka. Slijedom toga, podaci se mogu koristiti za izgradnju baza podataka koje se mogu integrirati s mapama puteva ili drugim podacima “omics ”, što će poboljšati biološko razumijevanje. Iako su kvantitativni podaci o metabolitima iz različitih modelnih organizama u izobilju u literaturi, njihova integracija u globalne baze podataka tek treba biti postignuta.

Strategije metabolomičkih istraživanja.

TABELA 1

MetabolitMale molekule koje sudjeluju u općim metaboličkim reakcijama i koje su potrebne za održavanje, rast i normalnu funkciju stanice*.
MetabolomeKompletan skup metabolita u organizmu.
MetabolomikaIdentifikacija i kvantifikacija svih metabolita u biološkom sistemu.
Metaboličko profilisanjeKvantitativna analiza skupa metabolita u odabranom biokemijskom putu ili specifičnoj klasi spojeva. To uključuje analizu cilja, analizu vrlo ograničenog broja metabolita, npr. pojedinačni analiti kao prekursori ili produkti biokemijskih reakcija.
Metabolički otisak prstaNepristrasan, globalni pristup skriningu za klasifikaciju uzoraka na osnovu metabolitnih uzoraka ili “otisaka prsta ” koji se mijenjaju kao odgovor na bolesti, okolišne ili genetske smetnje s krajnjim ciljem da se identificiraju diskriminirajući metaboliti.
Metabolički otisakAnaliza otiska prsta ekstracelularnih metabolita u mediju stanične kulture kao odraz izlučivanja ili preuzimanja metabolita u stanicama.

Nedostatak metaboličkog profilisanja je to što sistem nije globalni ili pravi pristup. Međutim, već su razvijene i rutinski se koriste brojne metode kvantitativnog metaboličkog profiliranja koje analiziraju različite klase metabolita. Ako se ove metode koje mjere ključne metabolite iz različitih biohemijskih puteva sastave kao gradivni blokovi za proučavanje metaboloma, razviti će se moćan metabolomički pristup.

Drugi pristup metabolomiji je metabolički otisak prsta. U početku u ovom pristupu namjera nije da se identifikuje svaki uočeni metabolit, već da se uporede obrasci ili “otisci” metabolita koji se mijenjaju kao odgovor na bolest, izloženost toksinu, okolišne ili genetske promjene. Tipičan, ali pojednostavljen tijek rada za metaboličku analizu otiska prsta prikazan je na slici 4. Metaboličko uzimanje otisaka prstiju izvedeno je u širokom spektru bioloških matrica, kao što su urin, plazma ili serum, pljuvačka i tkiva ili ćelije. Pored metaboličkih otisaka intracelularnih metabolita u sistemima ćelijske kulture, analiza ekstracelularnih metabolita koji se izlučuju u medijum kulture ili preuzimaju iz medijuma od strane ćelija može pružiti vredne informacije o njihovom fenotipu i fiziološkom stanju. Analiza uzoraka metabolita u kondicioniranim medijima ćelijske kulture naziva se metabolički otisak (Allen et al., 2003, 2004). Budući da se metabolički otisak prsta može istovremeno primijeniti na širok raspon metabolita, to je pravi ȁstrip” pristup. Implementacija metaboličkog otiska prstiju zasnovanog na nuklearnoj magnetnoj rezonanciji (NMR) označila je početak metabolomskog pristupa kao alata u biohemiji i pokazala se izuzetno moćnom u skriningu uzoraka za različite uzorke potpisa ili klastere. Metabolički otisci prstiju mogu se koristiti kao dijagnostički alat, na primjer, procjenom metaboličkog otiska prsta pacijenta u usporedbi sa zdravim i bolesnim subjektima. Osim toga, uspješnost strategija liječenja može se pratiti promatranjem da li se metabolički fenotip vraća u zdravo stanje, odnosno drugim riječima da li uzorak nakon tretmana spada u skupinu zdravih ispitanika. Međutim, upotreba metabolomike isključivo za uzimanje otisaka prstiju bez identifikacije metabolita koji uzrokuju grupiranje eksperimentalnih skupina samo će pružiti alat za klasifikaciju, ali neće izravno pridonijeti biokemijskom znanju i razumijevanju osnovnih mehanizama djelovanja. Prava moć metabolomike postiže se kada se izvrše kvalitativne i kvantitativne analize. Poznavanje identiteta metabolita i njihove kvantitativne perturbacije kao deskriptora razlika u specifičnim fenotipovima pružit će informacije koje se mogu tumačiti u svjetlu biohemijskih puteva. Stoga je potrebno identificirati metabolite koji uzrokuju grupnu segregaciju u pristupu uzimanja otisaka prstiju i razviti kvantitativne metode za analizu ovih metabolita i srodnih spojeva, koji će povezati metaboličke otiske prstiju i profilisanje zajedno. Shodno tome, bilješka metaboloma važan je gradivni element za uspješna istraživanja metabolomike.

Pojednostavljeni tok rada za metaboličku analizu otiska prsta.

I metaboličko uzimanje otisaka prstiju i profiliranje mogu se koristiti u potrazi za novim biomarkerima. Vrijednost testova glukoze u krvi i kolesterola u medicinskoj dijagnostici ilustrira vrijednost čak i jednostavnih biomarkera. Metabolomika može dati nove biomarkere koji mogu doći do klinike kao alati za dijagnosticiranje zdravstvenog stanja, bolesti ili ishoda farmakološkog liječenja. Metabolomika nije ograničena na pojedinačne biomarkere. To prije predstavlja novi pristup dijagnostici gdje se veliki skupovi podataka mogu koristiti u potpunosti za razvoj razumijevanja. Na primjer, evaluacija povezanih biokemijskih puteva kao odgovor na liječenje lijekovima dat će potpuniji opis mehanizama povratnih informacija ili preslušavanja nego što pojedinačni biomarkeri mogu pružiti. Štaviše, koncept individualnog zdravlja, uključujući ishranu, ali i prilagođen farmakološki tretman zasnovan na metaboličkom fenotipu, snažno će se oslanjati na tehnologiju metabolomike (Watkins & German, 2002). Obećanje tehnologije u kliničkoj medicini o prelasku s uzoraka mililitra na mikrolitre i prelasku s nekoliko na tisuće analita uzbudljivo je, ali potencijal tehnologije za generiranje biološkog razumijevanja vjerojatno je još značajniji.

Brojne analitičke platforme su korištene za metabolomske primjene, kao što su NMR (Nicholson & Wilson, 2003), Fourier transform-infracrvena spektroskopija (FT-IR) (Harrigan et al., 2004 Johnson et al., 2004) i masena spektrometrija (MS) spojen na tehnike odvajanja ili pomoću direktnog ubrizgavanja. Velike prednosti NMR-a su potencijal za visokopropusni otisak prsta, minimalni zahtjevi za pripremu uzorka i nediskriminirajuća i nedestruktivna priroda tehnike. Međutim, ovim pristupom će se detektirati samo metaboliti srednje do velike količine, a identifikacija pojedinačnih metabolita na osnovu signala kemijskog pomaka koji uzrokuju grupisanje uzoraka u multivarijantnoj analizi je izazovna u složenim smjesama. Metabolomika zasnovana na spektrometriji mase nudi kvantitativne analize sa visokom selektivnošću i osjetljivošću i potencijalom za identifikaciju metabolita. Kombinacija sa tehnikom odvajanja smanjuje složenost masenog spektra zbog odvajanja metabolita u vremenskoj dimenziji, pruža izobarsko odvajanje i daje dodatne informacije o fizičko-hemijskim svojstvima metabolita. Međutim, tehnike zasnovane na spektrometriji mase obično zahtijevaju korak pripreme uzorka, koji može uzrokovati gubitke metabolita, a na osnovu sistema za uvođenje uzorka i korišćene tehnike jonizacije, mogu se razlikovati specifične klase metabolita. Stoga se želi paralelna primjena nekoliko tehnika, na primjer, GC-MS i LC-MS za sveobuhvatno proučavanje metaboloma. Trenutno, metabolomika zasnovana na spektrometriji mase dinamično je polje u nastajanju s brojnim godišnjim publikacijama koje premašuju objavljena istraživanja zasnovana na NMR (vidi sliku 2).

Međutim, ne samo da odabir analitičkih tehnika zahtijeva pažljivo razmatranje, već bi cijeli eksperiment metabolomike trebao biti planiran kao integrirana jedinica, jer su instrumentalni podaci dobri samo koliko i eksperimentalni dizajn i obrada uzorka. U tom kontekstu Bino i sar. (2004) predlaže minimalne informacije o eksperimentu metabolomike (MIAMET), koje treba prijaviti uz svaku studiju kako bi se olakšala razmjena informacija i uspostava baza podataka. Slične preporuke u pogledu metapodataka date su i za ostale tehnologije##x0201comics ”.

Općenito, za svaki tip metabolomskog eksperimenta zasnovanog na MS-u, tokom razvoja i validacije metode potrebno je riješiti sljedeće korake:

Analiza uzorka uključujući odvajanje metabolita i detekciju MS,


Masena spektrometrija

Pregledi članaka su zbir preuzimanja punog teksta članaka od novembra 2008. (i PDF i HTML) u skladu sa COUNTER-om u svim institucijama i pojedincima. Ovi se metrički pokazatelji redovito ažuriraju kako bi odražavali upotrebu u posljednjih nekoliko dana.

Citati su broj drugih članaka koji citiraju ovaj članak, izračunat od strane Crossref-a i ažuriran svakodnevno. Saznajte više o Crossref brojevima citata.

Altmetric Attention Score je kvantitativna mjera pažnje koju je istraživački članak dobio na internetu. Klikom na ikonu krafne učitat će se stranica na altmetric.com s dodatnim detaljima o ocjeni i prisutnosti na društvenim medijima za dati članak. Saznajte više o altmetrijskoj ocjeni pažnje i načinu izračunavanja ocjene.

Bilješka: Umjesto sažetka, ovo je prva stranica članka.


Metode liječenja za određivanje δ 2 H i δ 18 O keratina za kosu masenom spektrometrijom u omjeru izotopa s kontinuiranim protokom

Strukturni proteini koji se sastoje od ∼90% životinjske dlake imaju potencijal da zabilježe varijacije koje su određene iz okoline i fiziološki. δ 2 H i δ 18 O vrijednosti tjelesne vode. Široke, sistematske, geoprostorne varijacije u stabilnim izotopima vodonika i kiseonika vode u životnoj sredini i kapacitet za brzo, precizno merenje metodama kao što je analizator elemenata konverzije visoke temperature/masena spektrometrija odnosa izotopa (TC/EA-IRMS) čine ove sisteme izotopa posebno dobro prilagođen za aplikacije koje zahtijevaju geolokaciju uzoraka kose. Međutim, kako bi takve aplikacije bile uspješne, moraju postojati metode za točno određivanje kose δ 2 H i δ 18 O vrijednosti koje odražavaju primarne proizvode biosinteze. Ovdje predstavljamo rezultate eksperimenata osmišljenih da ispitaju dvije potencijalne netočnosti koje utječu δ 2 H i δ 18 O mjerenja kose: doprinos nebiološkog vodika i kisika uzorcima u obliku sorbirane molekularne vode i izmjena hidroksil-vezanog vodika između keratina za kosu i vodene pare iz okoline. Pokazujemo da brza sorpcija molekularne vode iz atmosfere može imati značajan utjecaj na izmjerene δ 2 H i δ 18 O vrijednosti kose (sadrži ∼7,7% izmjerenog izotopskog signala za H i do ∼10,6% za O), ali da se ovaj doprinos može efikasno ukloniti sušenjem uzoraka u vakuumu tokom 6 dana. Izmjena vodonika između keratina za kosu i pare iz okoline je također brza (dostizanje ravnoteže u roku od 3-4 dana), sa 9-16% ukupnog vodonika dostupnog za razmjenu na sobnoj temperaturi. Na temelju rezultata ovih eksperimenata, ocrtavamo preporučeni postupak liječenja uzoraka za rutinsko mjerenje δ 2 H i δ 18 O u dlaki sisara. Autorska prava © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.


Etičke deklaracije

Konkurentni interesi

Autori objavljuju stalnu saradnju sa Protein Metrics u uspostavljanju HDX platforme za obradu podataka, što nije tema koja se odnosi na ovaj protokol. Preporuka da se Protein Metrics koristi kao preferirani softver za obradu podataka za FPOP podatke prethodi tekućoj saradnji. M.L.G. je neplaćeni član naučno -savjetodavnog odbora GenNext Technologies, koji pruža proizvode i usluge za otiske hidroksilnih radikala.


Istorija

Temelji masene spektroskopije postavljeni su 1898. godine, kada je Wilhelm Wien, njemački fizičar, otkrio da se snopovi nabijenih čestica mogu skretati magnetnim poljem. U rafiniranijim eksperimentima izvedenim između 1907. i 1913., britanski fizičar J.J. Thomson, koji je već otkrio elektron i promatrao njegovo skretanje električnim poljem, prošao je snop pozitivno nabijenih iona kroz kombinirano elektrostatičko i magnetsko polje. Dva polja u Thomsonovoj cijevi bila su smještena tako da su ioni odbijeni pod malim kutovima u dva okomita smjera. Neto rezultat je bio da su ioni proizveli niz paraboličnih krivulja na fotografskoj ploči postavljenoj na njihovim putanjama. Svaka parabola je odgovarala ionima s određenim omjerom mase i naboja, pri čemu je specifičan položaj svakog iona ovisio o njegovoj brzini. Later, in an attempt to estimate the relative abundances of the various ion species present, Thomson replaced the photographic plate with a metal sheet in which was cut a parabolic slit. By varying the magnetic field, he was able to scan through a mass spectrum and measure a current corresponding to each separated ion species. Thus he may be credited with the construction of the first mass spectrograph and the first mass spectrometer.

The most noteworthy observation made with the parabola spectrography was the spectrum of rare gases present in the atmosphere. In addition to lines due to helium (mass 4), neon (mass 20), and argon (mass 40), there was a line corresponding to an ion of mass 22 that could not be attributed to any known gas. The existence of forms of the same element with different masses had been suspected since it had been found that many pairs of radioactive materials could not be separated by chemical means. The name isotope (from the Greek for “same place”) was suggested by the British chemist Frederick Soddy in 1913 for these different radioactive forms of the same chemical species, because they could be classified in the same place in the periodic table of the elements. The ion of mass 22 was, in fact, a stable heavy isotope of neon.


<p>This section provides information on the quaternary structure of a protein and on interaction(s) with other proteins or protein complexes.<p><a href='/help/interaction_section' target='_top'>More. </a></p> Interaction i

<p>This subsection of the <a href="http://www.uniprot.org/help/interaction%5Fsection">'Interaction'</a> section provides information about the protein quaternary structure and interaction(s) with other proteins or protein complexes (with the exception of physiological receptor-ligand interactions which are annotated in the <a href="http://www.uniprot.org/help/function%5Fsection">'Function'</a> section).<p><a href='/help/subunit_structure' target='_top'>More. </a></p> Subunit structure i

Homo/heterodimer, or complexes of higher-order. The structure of beta-crystallin oligomers seems to be stabilized through interactions between the N-terminal arms (By similarity).

<p>This subsection of the '<a href="http://www.uniprot.org/help/interaction%5Fsection">Interaction</a>' section provides information about binary protein-protein interactions. The data presented in this section are a quality-filtered subset of binary interactions automatically derived from the <a href="https://www.ebi.ac.uk/intact/">IntAct database</a>. It is updated at every <a href="http://www.uniprot.org/help/synchronization">UniProt release</a>.<p><a href='/help/binary_interactions' target='_top'>More. </a></p> Binary interactions i

P43320

GO - Molecular function i

Protein-protein interaction databases

The Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)

Protein interaction database and analysis system

Molecular INTeraction database

STRING: functional protein association networks

Razne baze podataka

RNAct, Protein-RNA interaction predictions for model organisms.


The basics of mass spectrometry

Since their inception in 1912, mass spectrometers have undergone continuous development, and these sophisticated bioanalytical instruments have now reached unrivalled detection limits, speed and diversity in applications. They detect the presence and abundance of peptides (or other biomolecules such as metabolites, lipids and proteins) using fundamental properties of molecules, such as mass, and net charge. When peptides obtain a net charge (usually through gain of protons), they are referred to as peptide ions.

All mass spectrometers have three fundamental components: an ion source, mass analyser and detector (Figure 1A). As mass spectrometers can only analyse gaseous ions, methods such as electrospray ionization (ESI) are needed to convert peptides from the liquid phase to gaseous ions. The liquid containing the peptides is pumped through a micrometre-sized orifice held at a high voltage (2–4 kV). Upon reaching this emitter, the steady stream of liquid disintegrates into extremely small, highly charged and rapidly evaporating charged droplets, leaving peptide ions in the gas phase. Even 20 years after John Fenn received the Nobel Prize for this discovery, the exact mechanisms are not completely understood. We know that the abundance of gaseous peptide ions is proportional to their original concentration, making it beneficial to use the lowest flow rates possible, thereby maximizing sensitivity. It is common in proteomics to separate peptide mixtures using high-performance liquid chromatography (HPLC) systems with flow rates of only a few hundred nanolitres per minute rather than millilitres in conventional HPLC.

Overview of sample preparation and instrumentation used in MS-based proteomics. (A) Proteins are digested into peptides using sequence-specific proteases. Optionally, post-translational modification (PTM)-containing peptides can be enriched using beads with specific surface chemistry or coupled antibodies. High-performance liquid chromatography (HPLC) separates peptides based on hydrophobicity, and they are subsequently analysed by a TOF mass spectrometer. (B) Alternatively, peptides can be analysed by an Orbitrap mass spectrometer, which is a mainstream instrument in proteomics.

The principal role of a mass analyser is to separate ions by their mass-to-charge ratios (m/z). Fundamentally, all ions are separated by modulating their trajectories in electrical fields. Mass analysers differ in the principle they use for separating ions, and this defines their preferred application areas. Quadrupoles, usually combined with time-of-flight (TOF) or Orbitrap analysers, are the most common in proteomics. Quadrupole mass analysers separate ions using an oscillating electrical field between four cylindrical rods in a parallel arrangement, where each pair of rods produces a radio frequency electrical field with a phase offset. The resulting electrical fields define a pseudo-potential surface that is configured to allow the transmission of all ions, or to selectively transmit ions of a specific m/z window.

TOF mass analysers separate ions based on the differences in velocities after acceleration to about 20 kV and subsequent different arrival times at the detector. A TOF can measure mass differences of one part per million (ppm) by detecting time differences of sub-microseconds. In contrast, the Orbitrap mass analyser distinguishes ions based on their oscillation frequencies. Ions are tangentially injected and then trapped in the Orbitrap, and they move along the length axis of a central metal spindle (Figure 1B). Although an Orbitrap is only a few centimetres long, the ions can rapidly travel up to several kilometres, enabling very high resolution (typically tens of thousands) and low ppm mass accuracy.

In proteomics, the quadrupole element is normally followed by a ‘collision cell’, which is a quadrupole where the ions can be fragmented. Either intact peptide ions or fragment ions enter the final stage that also contains the detector – the resulting spectra are called MS 1 or precursor ion spectra in the former case and MS 2 or product or MS/MS spectra in the latter. TOF instruments have microchannel plate (MCP) detectors, where each individual ion ejects electrons from a surface that are then amplified. Individual ions can be readily measured with MCPs, but this exquisite sensitivity comes with the caveat that the detector can easily saturate in case of high signals. In Orbitrap analysers, the ‘image current’ induced by the rapidly oscillating ions is measured, and it represents a quantitative readout of the strength of the individual ion packages. The current is recorded in the time domain and is converted into the frequency domain using Fourier transformation. Advances in signal processing algorithms have repeatedly doubled the achievable resolution with a given transient time of the signal, but these are still orders of magnitude slower than those of TOF analysers (tens to hundreds of milliseconds vs typically 100 microseconds for a single TOF pulse).

How do the MS instruments sequence or identify peptides? Precursor ions with a specific m/z are first isolated by the quadrupole and fragmented through collision with inert gases such as N2, He or Ar. This causes them to break apart at the lowest energy bonds – typically, some of the amide bonds (peptide bonds) connecting the amino acid residues – and leaves MS/MS spectra with incomplete ladders of peaks differing by amino acid masses. This information is incredibly specific and is used for identification of the peptide sequence. A sequence of just a few amino acids and the flanking masses – a peptide sequence tag – is sufficient for identifying a peptide from the entirety of human proteome. More usually, database identification involves generating all possible fragmentation spectra and then statistically scoring them against the experimental spectra.

The chromatographic retention time is an important level of information when matching a dataset against a previous measurement and is key to ‘targeted proteomics’ technologies. Furthermore, ion mobility analysis, an additional dimension of separation of peptide ions, has recently become mainstream. Ions are either filtered based on their cross-section (FAIMS, field asymmetric ion mobility spectrometry) or actually separated during their analysis (T-Wave or TIMS, trapped ion mobility spectrometry). TIMS is the basis of the parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) technology, which multiplies sequencing speed 10-fold while improving sensitivity.


Broad Institute

Mass spectrometry is an analytical tool useful for measuring the mass-to-charge ratio (m/z) of one or more molecules present in a sample. These measurements can often be used to calculate the exact molecular weight of the sample components as well. Typically, mass spectrometers can be used to identify unknown compounds via molecular weight determination, to quantify known compounds, and to determine structure and chemical properties of molecules.

How does a mass spectrometer perform such a feat? Every mass spectrometer consists of at least these three components:

1. The Ionization Source

Molecules are converted to gas-phase ions so that they can be moved about and manipulated by external electric and magnetic fields. In our laboratory we use a technique called nanoelectrospray ionization, which is somewhat similar to how cars are industrially painted. This method allows for creating positively or negatively charged ions, depending on the experimental requirements. Nanoelectrospray ionization can directly couple the outlet of a small-scale chromatography column directly to the inlet of a mass spectrometer. The flow from the column is passed through a needle that is 10-15 um at its tip.

2. The Mass Analyzer

Once ionized, the ions are sorted and separated according to mass-to-charge (m/z) ratios. There are a number of mass analyzers currently available, each of which has trade-offs relating to speed of operation, resolution of separation, and other operational requirements. The specific types in use at the Broad Institute are discussed in the next section. The mass analyzer often works in concert with the ion detection system.

3. Ion Detection System

The separated ions are then measured and sent to a data system where the m/z ratios are stored together along with their relative abundance. A mass spectrum is simply the m/z ratios of the ions present in a sample plotted against their intensities. Each peak in a mass spectrum shows a component of unique m/z in the sample, and heights of the peaks connote the relative abundance of the various components in the sample.


Pogledajte video: Materials for exam preparation - ÖSD Zertifikat B2 - Mündliche Prüfung - Individual Exam (Decembar 2022).