Informacije

Pitanje o indukciji IPTG -a

Pitanje o indukciji IPTG -a


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Našao sam informaciju: 'U nedostatku laktoze, lac represor se vezuje za sekvencu operatera na DNK i savija DNK za 40 stepeni. Ovo blokira pristup T7 RNA polimeraze do mjesta promotora i na taj način sprječava curenje transkripcije vašeg gena prije indukcije. ' Zbunjen sam oko jedne činjenice.

Kad dodam IPTG, protein represor lac (iz E.coli hromozoma) ne može više vezati operatora i nativna E. coli RNA polimeraza počinje prepisivati, gen T7 RNA polimeraze inženjeriran u njegov kromosom.

Dakle, ako postoji IPTG i protein represor lac (iz hromozoma E.coli) ne može više vezati operatora koji stoji ispred gena T7 RNA polimeraze, zašto se protein represor lac još uvijek može vezati za operatora koji stoji ispred ciljanog gena iz plazmida ??


Zašto mislite da će lac represor i dalje biti vezan za ciljani gen?

U sojevima s ovom vrstom regulatorne konfiguracije (obično s DE3 u genotipu) ideja je da indukcija IPTG uključuje ekspresiju T7 polimeraze iz lac promotora na kromosomu, a zatim ta T7 polimeraza zatim prepisuje ciljani gen na plazmidu. Prisustvo IPTG -a osigurava da se represor neće vezati ni na jednoj lokaciji.

Dopunski:

Mislim da razumijem zašto ste sada zbunjeni. Vaša slika načina na koji ovo funkcionira zasnovana je na ideji da je potiskivač pričvršćen za operatera sve dok ne dođe induktor poput IPTG -a. U stvari postoji ravnoteža između vezanog i nevezanog:

represor/operator <=> represor + operator

i, u kratkim periodima kada represor nije vezan, RNA polimeraza E. coli može vezati i transkribovati operon. Ovo se naziva "sinteza bijega" i općenito se pretpostavlja da je funkcionalno relevantno za osiguravanje niske razine ekspresije lac permeaze u svakom trenutku kako bi se laktoza mogla apsorbirati. Da ovo nije slučaj, kako bi prirodni induktor (derivat laktoze) ikada mogao inducirati lac operon?

U sistemima za ekspresiju proteina općenito se smatra poželjnim da se sinteza stranog proteina izbjegne na minimum, tako da ne postoji selekcija koja djeluje na gen da negira bilo kakve štetne efekte njegove ekspresije. Upotreba T7 polimeraze kao srednjeg nivoa regulacije pomaže da se to postigne. Čak i ako postoji nizak nivo escape sinteze T7 polimeraze, koncentracija T7 polimeraze će biti toliko niska u neinduciranom stanju (u poređenju sa endogenom RNA polimerazom) da će količina escape sinteze ciljnog proteina zbog dobijanja T7 polimeraze produktivan pristup T7 promotoru na plazmidu će biti zanemariv.

Pročitajte više ovdje.


Ekološka grupa bakteriofaga

Indukcija je često stimulirana oštećenjem bakterijske DNK, a u slučaju profaga koji su integrirani u bakterijski kromosom, indukcija također uključuje eksciziju profaga iz kromosoma. Imajte na umu da je indukcija skraćenica za "profag indukcija" i da se indukcija profaga također može opisati kao genetska promjena (kao kod prebacivanja u genetskom stanju iz lizogničkog ciklusa u litički ciklus ili, općenito, produktivna infekcija).

U lambda bakteriofaga (& lambda), indukcija je povezana s cijepanjem CI represora. Rezultat je proizvodnja proteina Cro, koji inhibira daljnju proizvodnju CI. Indukcija u & lambdi, kao i s brojnim drugim lizogenima, pa stoga i cijepanje Cro, tipično je odgovor na oštećenje DNA unutar bakterije domaćina. Indukcija koja se javlja u odsustvu specifičnih indukcionih agenasa može se opisati kao spontana, kao u "spontanoj indukciji" ili "spontanom prebacivanju".

Umjereni životni ciklusi faga uključuju višestruke, često sukobljene korake, pri čemu korak indukcije prelazi fag iz stanja u kojem je njihov uspjeh blisko vezan za uspjeh njihovog bakterijskog domaćina, u dužem vremenskom okviru, u stanje u kojem oni funkcioniraju umjesto toga eksplicitno kao antibacerijski antagonisti.

Za dodatnu raspravu i reference pogledajte Little (2005), Ptashne (2004) itd.

Za više o ovoj temi, pogledajte Wikipedia, Google i PubMed. Kontaktirajte web majstora. Povratak na uslove.


PROCEDURE

“Uvod u genetsko inženjerstvo” je izborni predmet u trajanju od 90 sati koji se daje studentima osnovnih studija koji su već pohađali nastavu iz biohemije, mikrobiologije i molekularne genetike. Tim je činio profesor discipline (koordinator), docent, dva diplomirana asistenta, od kojih je jedan uključen u određeni program u nastavi (PESCD/CAPES), 1 1 Program stručne prakse pod nadzorom nastavnika (PESCD) je program podržan od strane brazilske institucije za finansiranje istraživanja (Koordinacioni biro za unapređenje studenata dodiplomskih i postdiplomskih studija [CAPES]) kako bi se postdiplomskim studentima omogućila obuka nastavnika. i šest studenata osnovnih studija. Potonji su u eksperimentalnom dijelu kursa podijeljeni u dvije grupe.

Kurs je započeo tako što je koordinator studentima održao teoretsku nastavu o cistatinima i njihovoj inhibitornoj aktivnosti na cistein proteaze. Studenti su također morali pročitati posebnu literaturu o predmetu ovog časa [2, 4]. Dodatna teorijska nastava održana je tokom kursa kako bi se dodatno razjasnili eksperimenti i raspravili principi uključeni u tehnike molekularne biologije. Studenti su izveli u osnovi praktične eksperimente, počevši od potrage za ciljnim genom u NCBI bazama podataka (www.ncbi.nlm.nih.gov) do njegovog kloniranja, ekspresije proteina u Escherichia colii pročišćavanje proteina. Zahtjevi za odabir gena trebali bi biti kodificirani za gen izražen u visokim nivoima u pristupačnoj biljci, imati poznatu cDNA sekvencu cijele dužine i imati otvoren okvir za čitanje (ORF) 2 2 Korištene su skraćenice: ORF , otvoreni okvir za čitanje IPTG, izopropiltiogalaktozid. koji ne sadrži više od 700 bp kako bi se olakšala sinteza cDNK. Konačno, „in vivo” test je proveden kako bi se istražila još neprijavljena biološka aktivnost odabranog cistatina.

Učenici su dobili osnovne protokole koji su ih morali prilagoditi tokom eksperimenata. Učenici su sastavljali izvještaje o svakom eksperimentalnom koraku. Tabela I prikazuje korake kursa i eksperimentalne tehnike uključene u svaku fazu, uključujući vremenski okvir.


REZULTATI I DISKUSIJA

Bakterijske kolonije transformisane sa pET28a-GFP pokazale su zelenu fluorescenciju 2 dana nakon što su stavljene na čvrsti medijum LB. Pregled ploča pod UV svjetlom omogućio je jednostavnu demonstraciju niskog bazalnog nivoa izraza iz lac promoter u odsustvu IPTG.

Slika 1 prikazuje analizu indukcije rekombinantnog GFP u SDS-PAGE E. coli ćelije. Postepeno povećanje proteinske trake, približno 29 kDa, uočeno je pod indukcijom IPTG, ali nije detektirano u neindukovanoj kulturi (bez IPTG). Ovaj protein ima očekivanu veličinu GFP -a (∼26,3 kDa), plus fuzijski peptid koji sadrži His6 tag i mjesto trombina (∼ 3 kDa). Dokaz o povećanju ekspresije GFP-a je takođe prikazan povećanjem fluorescencije indukovane kulture (u poređenju sa neindukovanom kulturom) kada se ispituje pod UV svetlom.

Rekombinantni protein je detektovan i u rastvorljivim i u nerastvorljivim frakcijama indukovanih ćelija (slika 1). Njegovo prisustvo u nerastvornoj frakciji može biti rezultat neefikasnog poremećaja ćelija tokom ultrazvuka.

Slika 2 prikazuje analizu oporabljenih frakcija tijekom pročišćavanja proteina afinitetnom hromatografijom. Mnogi nespecifični proteini koji nisu vezali smolu oslobođeni su u protočnoj otopini i s puferom za ispiranje. Proteini sa niskim afinitetom za ione nikla ili kobalta eluirani su sa niskim koncentracijama imidazola (npr. 25 m M). Rekombinantni GFP je počeo da se eluira u rasponu koncentracija imidazola, počevši od 50 m M (slika 2.A) ili 75 m M (slika 2B). Pri ovim koncentracijama, neki kontaminantni proteini su također eluirani sa proteinom od interesa. Pri većim koncentracijama imidazola, rekombinantni protein je gotovo isključivo eluiran. Visok nivo oporavka dogodio se na 100 m M (slika 2.).A) ili 250 m M imidazola (slika 2B), ovisno o afinitetu rekombinantnog GFP -a za matrice različitih dobavljača. Najmanje 12 mg GFP -a je pročišćeno na 250 ml bakterijske kulture (tj. 48 mg po litru). Elucija s gradijentima imidazola omogućila je selektivniji oporavak proteina označenog His-om, jer su proteini niskog afiniteta ranije eluirani iz rekombinantnog proteina. Kao što je prikazano na slici 2C, eluirane frakcije koje sadrže pročišćeni GFP mogu se direktno identificirati zbog prirodne fluorescencije proteina.

Druge teme o kojima se raspravljalo

Nakon nastave sa studentima se detaljno razgovaralo o sljedećim temama.

Presavijanje proteina i kemijska modifikacija -

Novonastali polipeptidni lanac sintetiziran na ribosomu podvrgava se savijanju, a svi molekuli bilo kojeg proteina dobivaju jednu konformaciju koja se naziva nativno stanje, a ne mnoge druge moguće konformacije. Većina proteina prisutnih u stanicama nalazi se u svojoj topljivoj nativnoj konformaciji, koja je potrebna za pravilnu biološku aktivnost.

Neki ćelijski mehanizmi mogu spriječiti formiranje pogrešno savijenih proteina. Šaperoni su porodica proteina koji se nalaze u svim organizmima, od bakterija do ljudi. Oni su locirani u svakom ćelijskom odjeljku, vezujući različite tipove proteina i vjerovatno sudjeluju u općem mehanizmu savijanja proteina. Molekularni šaperoni, koji vezuju i stabilizuju nesavijene ili delimično presavijene proteine, mogu sprečiti degradaciju ovih proteina, dok šaperonini direktno olakšavaju savijanje [9].

Čest problem heterolognog izražavanja u E. coli je neprikladno savijanje proteina, što dovodi do stvaranja nerastvorljivih agregata koji se nazivaju inkluzijska tijela. Ovi agregati mogu nastati uslijed interakcije hidrofobnih grupa sa sličnim regijama drugih razvijenih molekula ili stvaranjem disulfidnih veza između različitih molekula.

Unutarstanična stanja bakterijskih stanica mogu utjecati na pravilno savijanje određenih eukariotskih proteina. Izrazito redoks stanje citoplazme bakterija u usporedbi sa stanicama sisavaca može utjecati na stvaranje disulfidnih veza na različite načine, a time i na savijanje proteina i topljivost.

Protein koji se pročišćava obično je najpoželjniji ako je što bliže prirodnoj konformaciji. Međutim, neke posttranslacijske modifikacije važne za funkciju proteina i topljivost u eukariotskim stanicama (npr. glikozilacija) nema u E. coli. Bez obzira na to, glikozilacija rijetko igra ključnu ulogu in vitro studije sa rekombinantnim proteinom. Nadalje, struktura možda nije bitna ako se protein koristi kao antigen za proizvodnju antitijela [10].

Drugi faktori uključeni u izražavanje proteina -

Nekoliko faktora koji sprečavaju ili ometaju ekspresiju proteina u E. coli kao i neke strategije za njihovo prevazilaženje razmatrane su na satovima.

Neki proteini, posebno oni manji od 10 kDa, nisu stabilni E. coli i mogu se brzo razgraditi proteazama [11]. Fuzija sa većim proteinom kao što je glutation S-transferaza može prevazići ovaj problem. Takođe, mnogi nerastvorljivi proteini postaju rastvorljivi u E. coli kada se eksprimira u fuziji sa glutation S-transferazom i može se lako pročistiti afinitetnom hromatografijom, koristeći kolonu koja sadrži imobilizirani glutation. Alternativno, netopivi proteini se mogu otopiti korištenjem haotrofnih agenasa kao što su SDS ili urea, nakon čega slijedi ponovno savijanje u nativni oblik postupnim povlačenjem ovih agenasa.

Usporavanje brzine ekspresije također može poboljšati topljivost proteina, a to se može postići snižavanjem koncentracije inducirajućeg agensa (npr. IPTG) ili snižavanje temperature indukcije. Ovi pristupi se također mogu usvojiti kada je heterologni protein izražen u E. coli otrovan je za ćeliju.

Prisustvo obilnih, neobičnih kodona u genu u kojem se ekspresira E. coli može uzrokovati lošu translaciju zbog ribosomske pauze [12]. Jer su transkripcija i prijevod usko povezani E. coli, može doći do prijevremenog prekida transkripcije. The in vitro zamjena takvih kodona mutacijom kodonima koji se najčešće koriste E. coli može prevazići ovaj problem. Na translaciju proteina može uticati i prisustvo sekundarnih struktura u glasničkoj RNK, koje sprečavaju vezivanje ribosoma za mesto vezivanja ribosoma.


Nedostatak izražavanja u klon pQE30 - (17. jula 2008.)

Konačno sam klonirao svoju kodonom optimiziranu DNK sekvencu u SphI i HindIII restrikcijska mjesta u pQE30 ekspresijski vektor od strane Qiagena. Sekvenca je u okviru nakon sekvenciranja i transformisao sam se u M15 i JM109 E.coli radi izražavanja.

Također sam postavio pitanje na koje je odgovorio Andriy u vezi sa mojim klonom na forumu za molekularno kloniranje. Spomenuo je upit o korištenju SphI-a za koji je moj supervizor rekao da neće predstavljati problem.

Ali nakon preliminarne ekspresije u JM109 i M15, nije bilo intenzivnog izraženog pojasa jer su proteinski profili slični profilima korištenih sojeva koji su bili sojevi koji su u njega transformirali vektor pQE30. Koristio sam 1mM i inducirao ekspresiju na OD600nm 0,6.
Zatim sam ponovio ekspresiju u oba soja tako što sam smanjio koncentraciju IPTG-a na 0,5 mM i čini se da je profil isti.
Trebam li povećati svoju koncentraciju IPTG na 5 mM kako su neki predložili ili možda još smanjiti na 0,005 mM? Takođe mi je stariji rekao da smanjim temperaturu rasta na 25 stepeni Celzijusa. Ali mislio sam da je to samo u svrhu topljivosti?
Razmišljao sam o otkrivanju pomoću Western blota, ali bez 6xHis antitijela.

Konačno sam klonirao svoju sekvencu DNA optimiziranu kodonom u restrikcijska mjesta SphI i HindIII u vektor ekspresije pQE30 pomoću Qiagena. Sekvenca je u okviru nakon sekvenciranja i transformisao sam se u M15 i JM109 E.coli radi izražavanja.

Također sam postavio pitanje na koje je odgovorio Andriy u vezi sa mojim klonom na forumu za molekularno kloniranje. Spomenuo je upit o korištenju SphI -a za koji je moj nadzornik rekao da to ne bi predstavljalo problem.

Ali nakon preliminarne ekspresije u JM109 i M15, nije uočena intenzivna eksprimirana traka jer su profili proteina bili slični onima u korištenim kontrolama, a to su bili sojevi koji su transformirani pQE30 vektor u it0. Koristio sam 1mM i inducirao ekspresiju na OD600nm 0,6.
Zatim sam ponovio ekspresiju u oba soja tako što sam smanjio koncentraciju IPTG-a na 0,5 mM i čini se da je profil isti.
Trebam li povećati svoju koncentraciju IPTG na 5 mM kako su neki predložili ili možda još smanjiti na 0,005 mM? Takođe mi je stariji rekao da smanjim temperaturu rasta na 25 stepeni Celzijusa. Ali mislio sam da je to samo u svrhu topljivosti?
Razmišljao sam o otkrivanju pomoću Western blota, ali bez 6xHis antitijela.

Ovo je profil ekspresije ukupnog ćelijskog lizata

Kako su označene zelenom bojom su p11, crvenom su označene p14, a žuto ili c(0) ili c(3) su kontrole.
Oni sa [] zagradama su frakcije od 1 ml.
Osim [], ćelije su normalizirane na T = 0 h.

Sve kulture su indukovane ekspresijom na OD600nm = 0,7.
Kulture su uzgajane na 250 obrtaja u minuti, 37 stepeni Celzijusa.
Prvo sam pokušao sa 1mM IPTG-om, a onda sam to ponovio ponovo snizivši nivo IPTG-a na 0,5mM misleći da će biti nekih promjena, ali profili su slični.

Mogu vam reći da se svi proteini ne mogu vidjeti u zamku kao inducirani u usporedbi s onima koji nisu inducirani.

Kao što ste rekli, ako niste sigurni, najbolje je koristiti W.B sa anti His oznakom Ab.

UR profil indukcije izgleda u redu (nemojte mijenjati konc. IPTG -a). U također treba produžiti vrijeme indukcije 6 sati ili preko noći indukciju.

Hvala na odgovoru.
Prilično sam nov u ovome.
Ne mogu se svi proteini vidjeti u Coomasieju? Predlažete li da radim Silver?

Mogu li pitati o IPTG -u? Ako ga povećam, da li bi to napravilo razliku? Pokušao sam ga povećati, ali profil je potpuno isti ! IPTG nije kvantitativan, zar ne?

Danas ću pokušati preko noći i vidjeti hoću li nešto dobiti.
Hvala vam puno =)

Ono što sam mislio kada sam rekao da se "ne mogu svi proteini vidjeti u Coomasieju" je da je ponekad teško vidjeti i identificirati

čisti pojas induciranog proteina kada ga uporedite s neinduciranom frakcijom (zbog kontaminiranih proteina ili samo

razmaz proteina). Kao što sam rekao, najbolji način da budete sigurni je da napravite Western blot (ne zaboravite pozitivnu kontrolu), ne znam kako

Što se tiče koncentracije IPTG-a - 1 mM je prihvatljivo kao "dovoljna koncentracija" za indukciju. Ne mislim da je tako

povećanje IPTG -a bi pomoglo u.

Ono što možete promijeniti je: 1) Indukcijski OD- 0,8-1 umjesto 0,6 2) koji međuspremnik koristite za testiranje uzoraka-frakcija 3) U

napuniti dovoljno kulture (ukupnih proteina) na agarozni gel? 4) da li uzimate OD na kraju indukcije (provjerite jesu li ćelije

Usput, JM109 nisu ekspresijske ćelije (koliko ja znam) koriste kao replikacijske stanice za plazmide.

Ono što sam mislio kada sam rekao da se "ne mogu svi proteini vidjeti u Coomasieu" je da je ponekad teško vidjeti i identificirati

čista traka induciranog proteina kada je uporedite sa neindukovanom frakcijom (zbog kontaminiranog proteina ili samo

razmaz proteina). Kao što sam rekao, najbolji način da budete sigurni je da napravite Western blot (ne zaboravite pozitivnu kontrolu), ne znam kako

Što se tiče koncentracije IPTG-1mM je prihvatljivo kao & dovoljna koncentracija & quot; za indukciju. Ne mislim da je tako

povećanje IPTG -a bi pomoglo u.

Ono što možete promijeniti je: 1) Indukcijski OD- 0,8-1 umjesto 0,6 2) koji međuspremnik koristite za testiranje uzoraka-frakcija 3) U

napuniti dovoljno kulture (ukupnih proteina) na agarozni gel? 4) da li uzimate OD na kraju indukcije (provjerite jesu li ćelije

Usput, JM109 nisu ekspresijske ćelije (koliko ja znam) koriste kao replikacijske stanice za plazmide.

Takođe bih hteo da proverim Western. Moj problem je što ne mogu identificirati inducirani protein.
Hvala vam na pojašnjenju koncentracije IPTG -a. Zaista cijenim vaš dosadašnji doprinos. Zaista ste bili od velike pomoći =)

1) Danas sam promijenio indukciju i još uvijek nema razlike.
2) Koristim SDS-PAGE 1x pufer za disocijaciju na isprane ćelijske pelete i stavljam 14 uL u svaku jažicu.
3) Kao gore. Ja normalizujem ćelije na T=o hr indukcije jer su moji stariji imali problema da odgovore na upit o sadržaju proteina u svojim Viva's. Dakle, moj supervizor mi je predložio da to učinim kao referencu za proizvodnju 'pojedinačnih' ćelija.
4) Uzimam OD na svakih sat vremena kako bih normalizovao ćelije. Dostiže stacionarnu fazu bez nestabilnog rasta.

Koristim JM109 da uporedim ekspresiju i profil proteina koji će biti napisan u mojoj tezi. Razlika između upotrebe ćelije domaćina za kloniranje i ćelije domaćina ekspresije kako bi se 'podebljala' moja diskusija.

Što se tiče vašeg prethodnog prijedloga, uzeo sam OD i uzorak u T=6 sati i sutra ujutro u T=20 sati jer je laboratorija zatvorena između. S obzirom na to da je ampicilin nestabilan, bi li moj profil proteina bio u redu? Također se pitam, s obzirom na to da je umetak kodon optimiziran za ekspresiju, moj klon je prilično beskorisan s obzirom na to da se gotovo ne izražava, a ako to čini nakon toliko dugih sati, zar ne?

Ono što sam mislio kada sam rekao da se "ne mogu svi proteini vidjeti u Coomasieju" je da je ponekad teško vidjeti i identificirati

čista traka induciranog proteina kada je uporedite sa neindukovanom frakcijom (zbog kontaminiranog proteina ili samo

razmaz proteina). Kao što sam rekao, najbolji način da budete sigurni je da uradite western blot (ne zaboravite pozitivnu kontrolu), ne znam kako

Što se tiče koncentracije IPTG-a - 1 mM je prihvatljivo kao "dovoljna koncentracija" za indukciju. Ne mislim to

povećanje IPTG -a bi pomoglo u.

Ono što možete promijeniti je: 1) Indukcijski OD- 0,8-1 umjesto 0,6 2) koji međuspremnik koristite za testiranje uzoraka-frakcija 3) U

napuniti dovoljno kulture (ukupnih proteina) na agarozni gel? 4) da li uzimate OD na kraju indukcije (provjerite jesu li ćelije

usput JM109 nisu ekspresione ćelije (koliko ja znam) oni koriste kao ćelije za replikaciju za plazmide.

Htio bih i Western da provjerim. Moj problem je što ne mogu identificirati inducirani protein.
Hvala vam na pojašnjenju o koncentraciji IPTG. Zaista cijenim vaš doprinos do sada. Zaista ste bili od velike pomoći =)

1) Danas sam promijenio indukciju i još uvijek nema razlike.
2) Koristim SDS-PAGE 1x disocijacijski pufer za opranu ćelijsku kuglicu i ubacim 14 ul u svaku jažicu.
3) Kao gore. Normaliziram ćelije na onu T = o hr indukcije jer su moji stariji imali problema s odgovaranjem na upit o sadržaju proteina u svojim Viva modelima. Ergo, moj nadzornik mi je predložio da to učinim kao referencu na proizvodnju#ćelija za jednokrevetne ćelije.
4) Uzimam OD na svakih sat vremena kako bih normalizovao ćelije. Dostiže stacionarnu fazu bez nestabilnog rasta.

Koristim JM109 da uporedim ekspresiju i profil proteina koji će biti napisan u mojoj tezi. Razlika između upotrebe ćelije domaćina za kloniranje i ćelije domaćina ekspresije kako bi se 'podebljala' moja diskusija.

Što se tiče vašeg prethodnog prijedloga, uzeo sam OD i uzorak u T = 6 sati, a sutra ujutro u T = 20 sati laboratorija je zatvorena između. S obzirom da je ampicilin nestabilan, da li bi moj proteinski profil bio u redu? Također se pitam, s obzirom na to da je umetak optimiziran za kodone za izražavanje, moj klon je prilično beskoristan s obzirom da se teško izražava, a ako to učini nakon toliko sati, zar ne?

ALI, zašto je protein veći od mog očekivanog pojasa. To je oko 20 kDa, dok bi moj protein trebao biti 18 kDa, a 6x His tag protein 0,84 kDa.
Ima li neko pojma?

Ako nekoga pitate, reći će vam da "uvijek" dobijete protein koji nije u očekivanoj veličini (obično je nekoliko kDa veći)

možete istovremeno trčati dvije proteinske ljestvice i vidite razliku u njihovom trčanju

Čestitam na izrazu, zapamtite da cijenite ovaj trenutak.

Ako nekoga pitate, oni će vam reći da u & količinski & "unosite proteine ​​koji nisu u očekivanoj veličini (obično je nekoliko kDa veća)

možete istovremeno trčati dvije proteinske ljestvice i vidite razliku u njihovom trčanju

Čestitam na izrazu, ne zaboravite da cijenite ovaj trenutak.

U redu. Heehee Hvala ti još jednom, Amtash.
Postoji li poseban razlog zašto se izražava malo većim? E.coli ima niske post-translacijske modifikacije ako nisu blizu nijednoj, zar ne?

Uradio sam upravo to, trčao sam marker sa 7 do 175 kDa unaprijed zajedno sa svojim markerom od 2 - 212 kDa danas. Proveriću pa videću ponovo ..

Hvala ti. Zaista se isplati jer pokušavam 8 mjeseci da kloniram i mjesec dana da se izrazim, a ovo je samo moj dodiplomski istraživački projekat =s

Ovdje sam priložio fotografiju gela na kojoj je M oznaka 2 - 212 kDa proteina, a druga s donje strane traka 20 kDa. staze 1-3 su ćelijski lizat iz M15 ćelija, dok su ostaci ćelije JM109. Svi su od 6. do 7. sata nakon uvođenja


Kako funkcionišu X gal i IPTG?

Kliknite da biste pročitali detaljan odgovor. S tim u vezi, šta X gal radi?

X-Gal je široko korišteni kromogeni supstrat za beta-galaktozidazu. Daje tamnoplavi talog na mjestu enzimske aktivnosti. X-Gal koristan je za brojne histokemijske i molekularne biološke aplikacije, uključujući otkrivanje aktivnosti lacZ u stanicama i tkivima.

Može se postaviti i pitanje kako mogu nabaviti Iptg X gal ploče? (ili 2 & mikrol X-Gal Rastvor (100 mg/ml) po 1 mL medija). Dodajte 10 & mikrol IPTG (100mM) po 1 mL medija za konačnu koncentraciju od 1mM. Dodajte skrining antibiotik po izboru (Ampicilin, Kanamicin, Karbenicilin itd.). Pour ploče i ostavite da se ohladi na sobnu temperaturu (obično najmanje 30 minuta) prije upotrebe.

Treba znati i koje su uloge IPTG -a i X gal -a kada se izvrši plavo bijela selekcija?

Za skrining klonovi koji sadrže rekombinantnu DNK, kromogeni supstrat poznat kao X-gal dodaje se na ploču agar. Izopropil i beta-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) se koristi zajedno sa X-gal for plava-bela skrining. IPTG je analog galaktoze koji se ne može metabolizirati i inducira ekspresiju gena lacZ.

Koliko IPTG ploče dodaju?

Dodati 40 & mikrol 100mM IPTG i 120 mikrol X-Gal (20 mg/ml) na površinu svakog ploča i prostiru se po cijeloj površini.


REZULTATI I DISKUSIJA

Generacija Tn5P, a Tn5 transposon sa promotorom okrenutim prema van. Jedno genetsko oruđe za koje je ostalo da se razvije V. fischeri je metoda za nasumično ubacivanje inducibilnog promotora u genom. Za razvoj ovog alata, odlučili smo koristiti LacI-represivni promotor A1/34 [1]. Ovaj promotor sadrži dva mjesta vezanja LacI, jedno između mjesta -35 i -10 i drugo koje se preklapa sa startnim mjestom transkripcije (Sl. ​ 1 1 ), a ranije se pokazalo da funkcionira kao snažan promotor u V. fischeri kada je umetnut direktno uzvodno od operona [1]. Zatim smo konstruisali mini-Tn5 vektor isporuke pEVS170 [31] koji sadrži ovaj promotor unutar transpozibilnog elementa u položaju okrenutom prema van, umetanje promotora je potvrđeno sekvenciranjem. Ovaj transpozon će se nazivati ​​Tn5P, za Tn5 plus P promotor.

Konstrukcija transpozona Tn5P. A) Tn5 iz pEVS170 sadrži gen otpornosti na eritromicin i početak replikacije (plava strelica i okvir) unutar krajeva Tn5 (crveni pravokutnici). pEVS170 je modificiran tako da sadrži promotor okrenut prema van, LacI-represivan/IPTG-induciran, PA1/34 (zelena strelica) [1]. (B) PA1/34 promotorska regija (kurziv) sadrži dva LacI vezujuća mjesta (podebljano). Vezivanje LacI za ove lokacije ometa pristup lokacijama -35 i -10 (zeleno), čime se potiskuje transkripcija. Kraj Tn5 (crveni) sadrži početni kodon (podvučen).

Umetanje lacI gen u V. fischeri i fenotipska procjena. V. fischeri ne sadrži lac operon ili lacI represorski gen. Stoga, za kontrolu ekspresije od promotora unutar Tn5P, bilo je potrebno uvesti lacI gen into V. fischeri. Jedna lokacija koja se tradicionalno koristi za umetanje gena u V. fischeri genom je Tn7 web mjesto, koje se nalazi između yeiR i glmS (Sl. ​ 2 2 ) [15, 33]. Međutim, budući da se ova stranica uvelike koristi za dopunu jedne kopije (npr., [34]), odlučili smo ostaviti ovu web lokaciju netaknutom za buduće manipulacije. Umjesto toga, ciljali smo na umetanje lacI q , visoko transkribirani alel lacI gen, u područje neposredno uz Tn7 web mjesto (između god i Tn7 lokacija) (sl. ​ 2 2 ). Rezultat je soj, KV6576, koji sadrži lacI q , zadržava netaknuti Tn7 mjesto, i ostaje neoznačeno, što omogućava korištenje markera otpornosti na antibiotike u budućim manipulacijama.

Sa generacijom lacI q -koji sadrži V. fischeri, pojavila su se dva pitanja: (i) Je li lacI q funkcionalan alel (npr., kontrolira li ekspresiju gena u V. fischeri?) i (ii) je Tn7 web mjesto koje se nalazi uz mjesto umetanja lacI q gen, još uvijek dozvoljen za događaje umetanja? Da bi se procenilo da li je lacI q alel u KV6576 je bio funkcionalan, istražili smo sposobnost ovog soja da utiče na ekspresiju a lac gen kontrolisan promotorom. Konkretno, u KV6576 smo uveli plazmid, pCLD46, koji sadrži rscS gen koji pokreće lac promotor, ili pVSV105, prazan vektor iz kojeg je izvedeno pCLD46. Kada se pCLD46 unese u divlji tip V. fischeri, RscS protein nastaje i inducira stvaranje biofilma [13]. Jedan fenotip biofilma koji se može lako procijeniti je stvaranje naboranih kolonija. Očekivali smo da će, ako lacI q alel u KV6576 je funkcionalan, tada bi LacI potisnuo izraz rscS, što rezultira sojem koji ili ne uspijeva formirati naborane kolonije ili to čini nakon kašnjenja. Zaista, otkrili smo da se ovaj soj nije uspio naborati nakon 24 sata rasta u odsustvu IPTG-a (Sl. ​ 3 3 ). Štoviše, kada smo uzgajali soj u prisutnosti IPTG -a, koji bi trebao inaktivirati LacI, razvile su se naborane kolonije s vremenom koje se ne razlikuje od kontrole (Sl. ​ 3 3 i podaci nisu prikazani). Ovi podaci ukazuju na to da je napravljen funkcionalni LacI i da je reagirao na IPTG. Napominjemo, međutim, da je represija nad rscS ekspresija iz pCLD46 nije bila potpuna: kasnije je soj pokazivao skroman fenotip bora u odsustvu IPTG (Sl. ​ 3 3 ). Ovaj rezultat pripisujemo nesposobnosti LacI eksprimiranog iz kromosoma da u potpunosti potisne promotor prisutan na višekopijskom plazmidu.

lac formiranje biofilma na bazi promotora od strane WT-a i lacI izražavaju sojeve. Kulture divljeg tipa (ES114) i lacI q (KV6576) sojevi koji sadrže ili prazan vektor pVSV105 ili RscS ekspresijski plazmid pCLD46 uzgajani su u LBS koji sadrži Cm. Alikvoti su razrijeđeni u OD600 od 0,2, uočen na LBS-Cm medijum koji sadrži ili nedostaje 1,75 mM IPTG, i inkubiran na sobnoj temperaturi. Formiranje naboranih kolonija procijenjeno je 20 i 50 h nakon inokulacije.

Da bi se potvrdilo da je Tn7 lokacija u blizini lokacije lacI q umetanje u KV6576 ostalo je podložno manipulaciji, koristili smo pEVS107, Tn7 vektor isporuke koji cilja na Tn7 lokacija [15], uvesti Erm kasetu otpora na toj lokaciji. pEVS107 sadrži kasetu otpornu na Erm unutar Tn7 krajevi i kaseta za otpornost na kanamicin izvana. Sojevi otporni na eritromicin lako su izolirani i pokazali su osjetljivost na kanamicin, što se očekivalo kada je Tn7 kasetni umetci na Tn7 web mjesto (podaci nisu prikazani).

Identifikacija pokretnih mutanata. Naši gore navedeni podaci ukazuju da je lacI gen umetnut u hromozom je funkcionalan da potiskuje transkripciju a lac gen kontrolisan promotorom. Međutim, ostalo je pitanje, da li lacI q kontrolna transkripcija alela iz PA1/34 promotor sadržan u Tn5P? Konkretno, pitali smo se možemo li inducirati ili potisnuti urođenike V. fischeri geni u KV6576 koji sadrže insercije Tn5P. Da bismo odgovorili na ovo pitanje, odlučili smo da procijenimo fenotip koji se lako može procijeniti, pokretljivost. V. fischeri sadrži brojne gene za koje je poznato da [35-38] ili su predviđeni [39] da utječu na pokretljivost. Pretpostavili smo da je Tn5Umetanje P uzvodno od takvih gena moglo bi rezultirati sojevima s inducibilnom ili represivnom pokretljivošću. Tako smo uveli Tn5P u KV6576 i procijenili pokretljivost mutanta na mekim agar pločama koje su sadržavale ili nisu imale IPTG. Na ekranu od oko 2000 mutanata identifikovali smo oko 20 sojeva sa potencijalnim fenotipima pokretljivosti zavisnim od IPTG i potvrdili fenotipe podskupa ovih mutanata. Od njih, naš fokus je bio privučen na dva soja sa suprotnim fenotipovima (Sl. ​ 4 4 ). Jedan soj, KV7432, imao je pokretljivost potisnutu IPTG-om: pokazivala je pokretljivost skoro divljeg tipa u odsustvu IPTG-a, ali je znatno smanjena pokretljivost u prisustvu IPTG-a (Sl. ​ 4B 4B ). Nasuprot tome, IPTG nije utjecao na pokretljivost kontrolnog soja (Sl. ​ 4A 4A ). Drugi interesantni soj, KV7433, imao je IPTG-inducibilnu pokretljivost: bio je nepokretan u nedostatku IPTG-a, ali je u prisutnosti IPTG-a povratio fenotip pokretljivosti divljeg tipa (Sl. ​ 4C 4C ). Zbog njihovih snažnih, ali suprotnih fenotipova, odabrali smo ova dva soja za dodatnu karakterizaciju.

Migracija mutantnih sojeva na mekom agaru. KV6576 (A), KV7432 (B) i KV7433 (C) uzgajane su preko noći u LBS. Kulture su razrijeđene do OD600 od 0,4 prije inokulacije na TB-SW podlogu za pokretljivost koja sadrži ili nema 1,75 mM IPTG. Slike prikazuju migraciju nakon 5,5 sati inkubacije na 28 ଌ.

We first identified the sites of insertion of Tn5P as described in Materials and Methods. The mutant with IPTG-repressible motility, KV7432, contained an insert within the intergenic region between VF_A0340 i VF_A0341, with the promoter of Tn5P oriented toward VF_A0341 (Sl. ​ 5A 5A ). In this orientation, the promoter appears positioned to drive expression of the nearby three-gene operon consisting of VF_A0342, VF_A0343, i VF_A0344. These three genes are predicted to encode proteins with GGDEF or EAL domains. These domains are found in diguanylate cyclase and phosphodiesterase proteins, which synthesize and degrade, respectively, the second messenger cyclic-di-GMP (c-di-GMP) [40]. High levels of cellular c-di-GMP inhibit motility in a variety of bacteria [41]. Therefore, we hypothesize that IPTG-mediated expression from the transposon promoter increases the levels of c-di-GMP in the cell and thus, inhibits motility. It also remains possible that expression from the Tn5P promoter decreases the expression of VF_A0341, which encodes a hypothetical protein with no conserved domains.

The location and orientation of the Tn5P insertions in two motility mutants. The insertion in KV7432 is located in the intergenic region between VF_A0340 i VF_A0341 with the A1/34 promoter oriented toward VF_A0341 (A). The insertion in KV7433 is located within the 5’ end of cheZ with the A1/34 promoter oriented toward cheA (B).

The mutant with IPTG-inducible motility, KV7433, carried the Tn5P insertion within the cheZ gene, with the transposon’s promoter oriented with the che operon (Fig. ​ 5B 5B ). In the absence of IPTG, the transposon insertion should interrupt transcription of cheZ as well as the downstream che genes which coordinate chemotaxis and are required for motility in V. fischeri [38]. Thus, it was not surprising that, in the absence of IPTG, this mutant exhibited a motility defect. Given that the Tn insertion was within the cheZ gene, however, it was unexpected that the addition of IPTG would restore near wild-type motility (Fig. ​ 4 4 ). Upon closer investigation of the insertion site, we noted that (1) the Tn is inserted near the beginning of cheZ, and (2) an ATG start codon within the Tn5P transposon end is in frame with the cheZ open reading frame (Fig. ​ 1B 1B and data not shown). Based on these observations, we hypothesize that expression from the transposon’s promoter and translation from the ATG within the transposon end results in the production of a hybrid CheZ protein with an altered N-terminus that is functional to promote motility.

Assessment of IPTG Induction. Our previous experiments used a single concentration of IPTG, 1.75 mM, to induce transcription from the Tn5P promoter. However, it was unclear whether this high amount of IPTG was necessary to obtain full repression/induction of motility by our strains. Thus, to determine the sensitivity of the Tn5P promoter to IPTG, we assessed the mutants’ motility phenotypes in the presence of a range of IPTG concentrations. KV7433 exhibited a dose-dependent increase in motility within a wide range of IPTG concentrations between 3.5 µM and 175 µM IPTG that was not further increased with additional IPTG (Fig. ​ 6 6 ). The other mutant, KV7432, similarly exhibited a dose-dependent change. In this case, the impact on motility required higher IPTG concentrations, above 35 µM at the highest amount tested, 1.75 mM, motility was not fully repressed (Fig. ​ 6 6 ). These data further support our conclusion that expression from the Tn5P promoter is induced by the addition of IPTG. Additionally, because we obtained different ranges of IPTG addition required for a transition from the motile to non-motile phenotype in the two strains, we conclude that it may be necessary to experimentally determine the optimal expression of a particular gene obtained using this experimental set-up (lacI q /Tn5P) by titrating the concentration of IPTG in the medium against the phenotype being tested.

Dependence of mutant motility phenotypes on IPTG. Motility mutants KV7432 and KV7433 were grown at 28ଌ in TB-SW motility medium containing the indicated concentrations of IPTG. The average diameter of migration of triplicate samples after 5 hours is shown. Standard deviation is indicated by error bars. Error bars smaller than the plotted points are occluded by the points and not visible.


IPTG (dioxane free)

IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) induces the transcription of genes from the lac i tac operons in bacteria, notably the hydrolase enzyme beta-galactosidase (ß-Gal). Once expressed, ß-Gal hydrolyzes beta-galactoside and lactose sugars into monosaccharides. IPTG is commonly used in the beta-galactosidase assay, wherein cells transfected with vector carrying the E. coli-derived lacZ gene, which encodes ß-Gal, are lysed and analyzed via the reaction substrate O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG). The ONPG substrate used in the beta-galactosidase assay turns yellow upon cleavage by ß-Gal, allowing quantitation of the transfected ß-Gal in cells and its use as a transfection control.

IPTG (isopropyl beta- D -1-thiogalactopyranoside) induces the transcription of genes from the lac i tac operons in bacteria, notably the hydrolase enzyme beta-galactosidase (ß-Gal). Once expressed, ß-Gal hydrolyzes beta-galactoside and lactose sugars into monosaccharides. IPTG is commonly used in the beta-galactosidase assay, wherein cells transfected with vector carrying the E. coli-derived lacZ gene, which encodes ß-Gal, are lysed and analyzed via the reaction substrate O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG). The ONPG substrate used in the beta-galactosidase assay turns yellow upon cleavage by ß-Gal, allowing quantitation of the transfected ß-Gal in cells and its use as a transfection control.

IPTG is also commonly used in blue/white screening experiments to determine the presence or absence of bacterial recombinant vectors following transformation. If the insert of interest is cloned into the vector's lacZ gene, it disrupts ß-Gal and prevents its expression. Bacterial colonies are grown on media containing X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside), a substrate for ß-Gal that turns into an insoluble blue product upon being cleaved by the enzyme. Without ß-Gal, bacterial colonies exposed to X-gal cannot process the substrate and remain white, evidence that they are transformed with recombinant vector and not non-recombinant vector. These white bacterial colonies can be selected for subsequent recombinant vector amplification.

Many regulatory elements of the lac operon are used in inducible recombinant protein systems IPTG is an effective inducer when used in the concentration range of 100 micromolar to 1.5 millimolar. Inducer concentration depends on the required strength of induction as well as the cell or plasmid genotype for example, if the organism genotype includes lacI q , a mutation that results in the overproduction of the lac repressor, then a higher concentration of IPTG may be necessary.


IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside), Dioxane-Free ≥ 99% (HPLC), ≤ 0.1% Dioxane, Crystalline Powder, Non-Ionic, Molecular Biology Grade

IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) is a non-metabolizable analog of galactose that is commonly used as a molecular biology reagent during cloning procedures that require induction of β-galactosidase activity. IPTG mimics the lactose metabolite allolactose, which triggers transcription of the lac operon by inactivation of the tetrameric lacl repressor by allosterically altering its conformation which prompts the synthesis of β-galactosidase, a hydrolase enzyme that catalyzes the hydrolysis of β-galactosides into monosaccharides. It is utilized in sync with X-Gal or Bluo-Gal for the purpose of blue-white screening of recombinant bacterial colonies that induce expression of the lac operon in E. coli and also Magenta-Gal for red-white colony screening of bacterial colonies. Allolactose is hydrolyzable by β-galactosidase, but cannot hydrolyze IPTG due to the chemical bond formed with the sulfur atom and as a result it's concentration remains constant during experimentation.

Uptake by E. coli may be independent of lactose permease depending on the concentration of IPTG as there are other transport pathways. At high concentrations which are typically established for protein induction, IPTG enters the cell independent of lactose permease while at low concentrations IPTG enters the cell via lactose permease. Though different concentrations may be utilized depending on the specific use case, IPTG is commonly used with a final concentration ranging from 100 uM - 3 mM. We recommend preparing a stock solution by dissolving IPTG in water and then utilizing a 0.22 um (micron) sterile filter to prepare a 0.1 M IPTG stock solution. The final concentration of IPTG for use in indicator plates should be 0.2 mM. The required induction strength and cell genotype may serve as a key factors in determining the final concentration. IPTG is commonly utilized for its induction efficacy associated with protein expression where a protein of interest is encoded downstream in association with the IPTG and subsequently induced in cell culture which can then be lysed and the resulting protein purified via His-Tag or FST purification systems for proteins with ligand tags. IPTG also has widespread use in blue-white and red-white screening of bacterial colonies.

Redoxica's IPTG is manufactured with high quality materials, the latest instrumentation and manufacturing best practices to ensure an ultrahigh purity end product with reliability and reproducibility at the center of our quality assurance processes. Redoxica's IPTG is manufactured synthetically, from non-animal origin, dioxane-free.

Specifikacije

Unit of Measure G
Shelf Life 60 MONTHS
InChI Key BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N
Empirical Formula C9H18O5S
Molecular Weight 238.3
CAS# 367-93-1
Funkcionalnost Inducer
Izgled White to off-white, powder
Miris Odorless
Forma Solid, fine crystalline powder
Ocena Molecular Biology Grade
Voda ≤ 2.00 %
Melting Point (MP) 121°C
Izvor Synthetic, Animal-Free
Čistoća ≥ 99% (HPLC)
MDL Number MFCD00063273
PubChem CID 656894
Suitability Suitable for recombinant protein expression and analysis of bacterial induction behavior.
EC Number 206-703-0
UNII X73VV2246B
Isomeric SMILES CC(C)S[[email protected]]1[[email protected]@H]([[email protected]]([[email protected]]([[email protected]](O1)CO)O)O)O
Canonical SMILES CC(C)SC1C(C(C(C(O1)CO)O)O)O
Formulation 1S/C9H18O5S/c1-4(2)15-9-8(13)7(12)6(11)5(3-10)14-9/h4-13H,3H2,1-2H3/t5-,6+,7+,8-,9+/m1/s1
Sastojci (2R,3R,4S,5R,6S)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol
Microbial Sterility Test -1.26
0 Da
1 115 A2
2 AAADceBwOABAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAkAAAAAAAAAAAAAAAAGgQACAAACBSkwAKCAAAABggAAAAAAAAAAAAAABAAAAAAAAABEAIgAAACQAAFAAAjAAHAYAQAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA==
3 Voda
4 4631
5 Dioxane (≤ 0.1%)
6 Clear, colorless
Synonyms IPTG, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropyl β-D-thiogalactoside, 1-Thio-beta-D-galactopyranoside Isopropyl, Isopropyl 1 Thio beta D galactopyranoside, Isopropyl 1-Thio-beta-D-galactopyranoside, Isopropyl Thiogalactoside, Thiogalactoside Isopropyl,

Q. How much is shipping and handling? A. US customers receive free ground shipping! If you are located outside of the United States, shipping and handling costs will vary based on location and order size. Additional customs/duties/VAT charges may be incurred for international orders.

Q. How do I place an order? A. All Redoxica products are fulfilled by our exclusive global distribution partner, Labscoop. You can place an order via Labscoop.com, submit your PO by email to [email protected], by fax at 1.800.316.3081 or by phone at 1.800.316.3081.

Q. How do I find pricing and availability? A. The latest pricing and availability is displayed on our website. This is updated in real-time and is the exact same information that our support team and distributors have access to. If you need a formal quotation, please submit a quote request.

Q. Do you offer any discounts? A. We conduct an extensive price analysis on each product we release, so you can be confident that you are getting a great price when comparing the quality of our products, the quantity, and S&H charges. For bulk orders (quantities over 5), please submit a bulk quote request and in most cases we will be able to offer some discounts. For quantities under 5, unfortunately we do not offer any additional discounts.


Pogledajte video: IPTG: Use. lac Operon induction. CSIR NET LIFE SCIENCE. GATE. Dr. Jitendra Kr. (Decembar 2022).