Informacije

Izvori za uobičajene laboratorijske sojeve Saccharomyces?

Izvori za uobičajene laboratorijske sojeve Saccharomyces?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Navikla sam raditi s bakterijama – neki od uobičajenih laboratorijskih sojeva ponekad dolaze uz narudžbu od nekih dobavljača. Koji je najprikladniji izvor za naručivanje uobičajenih nizova Saccharomyces za laboratorijski rad?


The Saccharomyces Genome Database ima listu izvora ovdje. Jedan od njih je Japanski genetski centar za kvasac: Provjerio sam njihovu stranicu i otkrio da naplaćuju ¥390 po soju, što je oko 4 USD. Tu je i naknada od 5 USD za sve narudžbe. Tražio sam nekoliko standardnih sojeva, a ovi su bili u katalogu, tako da izgleda dobra mogućnost.

(Uzgred, ovdje sam koristio USD umjesto $ jer se čini da postoji greška pri kucanju tog simbola dvaput u postu - pokušajte i vidjet ćete na šta mislim.)


ATCC je mjesto na koje bih otišao, baš kao i za kupovinu ćelijskih ili bakterijskih linija. Referentni ATCC kataloški brojevi su također navedeni sa svakim od uobičajenih sojeva koje ste povezali. Ovisno o namjeni, možete jednostavno otići u lokalnu trgovinu po pekarski kvasac.


Jedan veoma važan resurs je EUROSCARF. http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/

To je jedno od veoma poznatih i posvećenih skladišta sojeva za sojeve kvasca (S. cerevisiae). Ovdje čak možete pronaći neke vrlo korisne plazmide kvasca.

Još jedan resurs koji bih preporučio bit će originalne laboratorije, koje su napravile mutantne sojeve/plazmide. Istraživači kvasca kao zajednica su veoma ljubazni, skoro uvek sam dobijao sojeve i plazmide koje sam tražio od originalnih laboratorija.

Nadam se da će pomoći, Živjeli!!


Upotreba kvasca u biologiji

Kvasac je jedan od najjednostavnijih eukariotskih organizama, ali mnogi bitni ćelijski procesi su isti kod kvasca i ljudi. Stoga je važan organizam za proučavanje kako bi se razumjeli osnovni molekularni procesi kod ljudi.

Pekarski ili pupavi kvasac (Saccharomyces cerevisiae) dugo je bio popularan model organizma za osnovna biološka istraživanja. U laboratoriji se njime lako manipuliše, može da se nosi sa širokim spektrom uslova okoline i kontroliše deobu ćelija na sličan način kao i naše ćelije. Godine 1996., to je bio prvi eukariotski organizam čiji je genom sekvenciran.

Kvasac je bio prvi eukariotski organizam čiji je genom sekvenciran.

Međutim, otkako je otkriven pekarski kvasac, otkriveno je da i drugi kvasci imaju jednako korisna svojstva.

Kromosomi kvasca dijele niz važnih karakteristika s ljudskim hromozomima.

fisijski kvasac (Schizosaccharomyces pombe) je postao popularan sistem za proučavanje rasta i diobe ćelija. Djelomično je koristan jer ga je lako i jeftino uzgajati u laboratoriji, ali i zato što njegove ćelije imaju pravilnu veličinu i rastu samo u dužinu, što ga čini vrlo jednostavnim za snimanje rasta stanica. Kromosomi fisionog kvasca dijele niz važnih karakteristika s ljudskim hromozomima što organizam čini vrlo korisnim modelom u ljudskoj genetici. Sekvenca genoma S. pombe objavljena je 2002. godine.

Fisijski kvasac
Kredit slike: David O'Morgan (The Cell Cycle. Principles of Control.) [Attribution], preko Wikimedia Commons


Izvori za uobičajene laboratorijske sojeve Saccharomyces? - Biologija

Saccharomyces cerevisiae

Naučno ime: Saccharomyces cerevisiae

Uobičajeno ime: Pivski kvasac/Pekarski kvasac

stanište: Saccharomyces kada se prevede znači "šećerna gljiva". To je ono što ovaj kvasac koristi za hranu. Nalaze se u divljini kako rastu na kožici grožđa i drugog voća.

Sredstva za klasifikaciju: Saccharomyces cerevisiae nalazi se u carstvu gljiva. Razlozi za ovu klasifikaciju su zato što ima ćelijski zid napravljen od hitina, nema peptidoglikana u svojim ćelijskim zidovima, a njegovi lipidi su esterski povezani. Takođe koristi DNK šablon za sintezu proteina i ima veće ribozome. Tada se smatra kvascem jer je jednoćelijski organizam pa ne može formirati plodište kao druge gljive.

Adaptacije: Saccharomyces cerevisiae prilagodio na nekoliko važnih načina. Jedna je činjenica da su u stanju razgraditi svoju hranu i putem aerobnog disanja i anaerobne fermentacije. Mogu da prežive u okruženju sa nedostatkom kiseonika neko vreme. Još jedna adaptacija koju imaju je njihova sposobnost da imaju i seksualnu i aseksualnu reprodukciju. Vrlo malo drugih Ascomycota može obaviti oba procesa. I vrlo mali broj organizama može obaviti sva četiri ova procesa. Ovo omogućava ovoj vrsti da živi u mnogo različitih okruženja. (Madigan, 457)

ishrana: Saccharomyces cerevisiae dobija energiju iz glukoze.

Životni ciklus: Saccharomyces cerevisiae ima i aseksualnu i seksualnu reprodukciju.

U aseksualnom razmnožavanju haploid kvasca podliježe mitozi i formira više haploidnih kvasaca. Postoji a i ά soj ovih haploida. Tada se ovi haploidni kvasci, po jedan iz svakog soja, mogu spojiti i postati na ćeliji. Tada se jezgra obe ćelije spajaju i ova ćelija je sada zigota. Ove diploidne ćelije mogu proći kroz mitozu, koju nazivaju pupanjem, i još četiri zigote ili mogu proći kroz mejozu i iz askusa koji će se podijeliti na četiri askospore. Ovi haploidi tada mogu proklijati i ponovo postati haploidni kvasac. (Madigan, 457)

Važnost: Saccharomyces cerevisiae jedna je od najvažnijih gljiva u istoriji svijeta. Ovaj kvasac je odgovoran za proizvodnju etanola u alkoholnim pićima i razlog je zašto se tijesto za kruh vaše majke diže u tiganju. Odatle potiču nazivi pivski i pekarski kvasac. Proces u kojem proizvodi etanol je jedan od načina na koji ovaj kvasac pretvara glukozu u energiju. Postoje dva načina Saccharomyces cerevisiae razgrađuje glukozu. Jedan od načina je aerobno disanje. Ovaj proces zahteva prisustvo kiseonika. Kada kiseonik nije prisutan, kvasac će tada proći kroz anaerobnu fermentaciju. Neto rezultat toga su dva ATP-a, a proizvodi i dva nusproizvoda ugljični dioksid i etanol. Dakle, ako se dozvoli da ovaj kvasac raste u posudi kojoj nedostaje kiseonik, on će proizvoditi etanol (alkohol). Ljudi su izolovali ovaj proces od početka istorije. Kvasac pomaže u dizanju kruha sa svojim drugim nusproizvodom ugljičnim dioksidom. Plin koji se proizvodi unutar tijesta uzrokuje da se diže i širi. Oba ova procesa koriste haploid ovog kvasca za ovaj proces. U industriji izoluju jedan soj, bilo a ili ά, haploida kako bi ih spriječili da se pare. (Madigan, 457) U pekarskom kvascu imaju soj jer je proizvodnja ugljičnog dioksida preovlađujuća od etanola i obrnuto za pivarstvo. (Tomvolkfungi.net) Još jedna važnost je da suplementacija živog kvasca mliječnim kozama u ranoj laktaciji značajno povećava proizvodnju mlijeka . (Stella, A.V.1)

Freeman, Scott. Biološka nauka. 2nd ed. Vol. 1. Upper Saddle River, NJ: Pearson Education, 2005.

Madigan, Michael T. i John M. Martinko. Biologija mikroorganizama. 11th ed. Vol. 1. Upple Saddle River, NJ: Pearson Education, 2006.

Osley, M A. i D Norris. "Dva para gena koji kodiraju H2A i H2B igraju različite uloge u životnom ciklusu Saccharomyces Cerevisiae." Molekularna i ćelijska biologija 7 (1987): 3473-3481. Biološke nauke. IIlumina. Murphy Library, La Crosse, WI. 25. april 2007.

Stella, A V., R Paratte, L Valnegri, G Cigalino, G Soncini, E Chevaux, V Dell'orto i G Savoini. "Uticaj primjene živih Saccharomyces Cerevisiae na proizvodnju mlijeka, sastav mlijeka, metabolite u krvi i fekalnu floru u ranih mliječnih koza u laktaciji." Istraživanje malih preživača 67 (2007): 7-13. Web of Science. ISI Web of Knowledge. Murphy Library, La Crosse, WI. 25. april 2007.

Stewart, Graham G. Biološka istraživanja industrijskih kvasaca. 1st ed. Vol. 3. Boca Raton, Fl: CRC P, 1987.


Ostali interspecifični hibridi

Integritet vrste unutar Saccharomyces sensu stricto kompleks je rezultat postzigotskih reproduktivnih barijera (et al. 1996 Hunter et al. 1996 Delneri et al. 2003 Greig et al. 2003). Međutim, kako je ova barijera postzigotska, diploidni ili poliploidni hibridi koji se formiraju putem međuvrsnih događaja parenja mogu se neograničeno razmnožavati putem mitotičke diobe. Ovaj fenomen nije ograničen samo na laboratorijske eksperimente i postoje brojni izvještaji o tome Saccharomyces interspecifični hibridi koji se povezuju sa hladnim fermentativnim okruženjima, kao što su oni uočeni u proizvodnji vina i piva u zemljama Sjeverne Evrope (Sipiczki 2008).

S. pastorianus

Već 1980-ih lager kvasac S. pastorianus je sugerirano da je rezultat relativno nedavnog (15.-16. vijek) događaja interspecifične hibridizacije između S. cerevisiae i barem još jedan Saccharomyces spp. (Martini i Kurtzman 1985). Inicijalna genomska analiza nekoliko lager genoma kvasca, korištenjem komparativne hibridizacije genoma zasnovane na mikromrežama (aCGH), koja je naknadno potvrđena sekvenciranjem genoma, sugerira da postoje dva različita S. pastorianus podloze, koje bi se grubo mogle kategorizirati prema njihovom geografskom porijeklu i tipovima Saaz i Frohberg (Dunn i Sherlock 2008 Nakao et al. 2009 Walther et al. 2014), te da ne-S. cerevisiae roditelj obe vrste S. pastorianus bio sličniji, ali ne i potpuno isti kao S. bayanus (S. bayanus var. bayanus), koji se i sam smatra mogućim hibridnim sojem (vidi dolje) (Nakao et al. 2009 Walther et al. 2014).

Misterija koja okružuje ne-S. cerevisiae roditelj od S. pastorianus je konačno riješen, kao što je gore rečeno, radom Libkinda et al. (2011) putem izolacije i identifikacije potpuno novog Saccharomyces vrste, S. eubayanus (Slika 1). Genomska sekvenca S. eubayanus bio veoma homologan sa ne-S. cerevisiae delovi S. pastorianus genoma, što sugerira da je događaj hibridizacije koji je doveo do S. pastorianus dogodio između S. cerevisiae i S. eubayanus, vjerovatno nakon slučajnog uvoza S. eubayanus u Evropu, iako je tačan izvor S. eubayanus roditelj ostaje kontroverzan (Libkind et al. 2011 Bing et al. 2014).

Bez obzira na pravo geografsko porijeklo roditeljskog soja, povećani podaci dobiveni sekvenciranjem genoma također su tačno pokazali da sojevi tipa Saaz S. pastorianus (npr., bivši S. carlsbergensis sojevi) su generalno triploidni (2n S. eubayanus, 1n S. cerevisiae), ali sa ∼3,5 Mb DNK nedostaje iz S. cerevisiae doprinos (uključujući cjeline hromozoma VI, XI i XII), dok Frohbergov tip S. pastorianus sojevi (npr., Weihenstephan soj WS34/70) su prvenstveno tetraploidni (2n, 2n) sa ograničenim gubitkom doprinosa bilo kojeg roditelja.

Osim toga, uprkos različitom hromozomskom sadržaju ova dva S. pastorianus grupe koje sugeriraju nezavisno porijeklo, analiza genetskih varijacija prisutnih širom S. eubayanus dijela genoma, u kombinaciji s prisustvom nekoliko uobičajenih genetskih preuređivanja između S. cerevisiae i S. eubayanus hromozoma u lozama Saaz i Frohberg, sugerira da su obje ove grupe nastale iz jednog zajedničkog događaja hibridizacije (Dunn i Sherlock 2008 Peris et al. 2014 Walther et al. 2014). Prema ovom modelu, pretpostavlja se da su diferencijalna mitotička rekombinacija, nejednaki roditeljski hromozomski gubitak i rekombinacija između homeolognih roditeljskih hromozoma divergentno djelovali na istog zajedničkog pretka kako bi proizveli ova dva S. pastorianus grupe, pri čemu se sumnja na fenotipski selektivni pokretač razlike u kriotoleranciji (Rainieri et al. 2006 Dunn i Sherlock 2008 Nakao et al. 2009 Libkind et al. 2011 Walther et al. 2014).

Hibridi vinskog kvasca

Poput situacije uočene u pivarstvu, fermentacijom vina koja se izvodi na toplim temperaturama (>20°) prirodno dominiraju S. cerevisiae. Međutim, postaje sve evidentnije da fermentacijom vina koja se izvodi na nižim temperaturnim rasponima lako dominiraju prirodni hibridi među vrstama, uključujući i one nastale između S. cerevisiae i bilo S. uvarum (González et al. 2006 Le Jeune et al. 2007) ili S. kudriavzevii (González et al. 2006 Erny et al. 2012). Pored prirodno prisutnih međuvrstnih hibrida, hibridi od S. cerevisiae i bilo S. paradoxus, S. kudriavzevii, ili S. mikatae su umjetno izazvani u svrhu komercijalizacije (Bellon et al. 2011, 2013). Kao i posmatrana situacija S. pastorianus, ovi hibridni sojevi često nisu potpuni i sadrže različite količine genoma svakog roditelja (Dunn et al. 2012 Erny et al. 2012).

Jedina sastavljena sekvenca genoma dostupna za hibridni soj vinskog kvasca je ona komercijalnog soja VIN7 (Borneman et al. 2012). Analiza je pokazala da je VIN7 alotriploid, koji je rezultat hibridizacije između heterozigotnog diploidnog soja nalik na vino. S. cerevisiae i haploidni, evropski izolat S. kudriavzevii (Slika 1C). Za razliku od lager kvasca i mnogih drugih hibridnih sojeva vina, čini se da je VIN7 gotovo potpuni hibrid i sa ograničenim genetskim preuređenjem između dva roditeljska genoma (samo tri slučaja rekombinacije između homeolognih parova kromosoma).

Međutim, umjesto da pruža samo prednost u rastu otpornom na hladnoću, čini se da prisustvo S. kudriavzevii genom je možda slučajno omogućio da VIN7 otpusti mnogo veće količine (često duplo) voćnog isparljivog tiol 4-merkapto-4-metilpentan-2-ona (4MMP) iz neisparljivih prekursora dobijenih od grožđa tokom fermentacije nego S. cerevisiae sojevi vinskog kvasca, koji pružaju osnovu za stalnu genetsku selekciju u okruženju za proizvodnju vina putem ljudske intervencije (González et al. 2007 King et al. 2008 Swiegers et al. 2009).


Nekonvencionalni domaćini – implikacije ekoloških niša i arhitekture genetske mreže

Mezofilni organizmi kao npr E. coli i S. cerevisiae imaju inherentna svojstva koja ograničavaju njihovu upotrebu u određenim aplikacijama, npr. procesi visoke temperature. Stoga, nekonvencionalne mikrobne vrste igraju važnu ulogu u biotehnologiji [164–168].

Trenutno, ograničeni podaci o fiziologiji takvih organizama i dalje predstavljaju značajnu prepreku racionalnom inženjeringu ćelije domaćina. Iako postoje mnoge sličnosti u biokemijskim mrežama kod većine mikrobnih domaćina, dobro je dokumentirano da su se razvile razlike specifične za vrste i okoliš. Dok jezgre podmreže i putevi imaju tendenciju da budu dobro očuvani, uzvodne i nizvodne veze sa drugim ćelijskim mrežama značajno variraju među različitim vrstama i dovode do specifičnih razlika u otpornosti na stres u nepovoljnim okruženjima [169, 170] (Slika 2) . Evolucijski mehanizmi opisani u prethodnim odjeljcima su ključni za razvoj takvih specijalizacija [130, 156, 171]. Oni omogućavaju anticipativno i traženje hrane u pro- i eukariotskim mikrobnim ćelijama [172–174]. Zapravo, nedavna studija u S. cerevisiae naznačili su da se anticipativni obrasci regulacije gena mogu razvijati u uslovima ciklične soli i oksidativnog stresa na laboratorijskoj vremenskoj skali unutar 300 generacija i da je zaštita od unakrsnog stresa od soli i oksidativnog stresa upadljivo asimetrična, pri čemu oksidativni stres štiti od stresa soli, ali ne obrnuto[120]. Još jedno nedavno istraživanje u E. coli pokazala je da se korištenjem povećane genotipske raznolikosti koju koristi biblioteka transpozona, evolucijski 'stari' anticipativni odgovori mogu brzo odvojiti [172].

Specifične razlike u genskim regulatornim mrežama. Mrežne osobine specifične za vrstu omogućavaju anticipativno ponašanje okoline i posljedično kompenzacije specifične za vrstu, u slučaju da se ekološki stresovi ne javljaju kao u njihovom prirodnom poretku. Na kraju, ova svojstva mreže mogu dovesti do različitih kompromisa među nekonvencionalnim organizmima domaćinima tokom laboratorijske evolucije.

Određene funkcije kao što je prelijevanje metabolizma u S. cerevisiae možda evoluirao kako bi pružio evolucijsku prednost u specifičnim sredinama i zaštitio resurse ugljika od drugih konkurentskih vrsta [175]. Posljedično, postoje razlike u regulatornim nacrtima različitih vrsta [169, 176, 177], što u konačnici može dovesti do različitih evolucijskih kompromisa stresa tokom selekcije. U tom cilju, nedavno je istraživanje sa S. cerevisiae i Saccharomyces paradoxus pokazala je da je frekvencija evolucionog spašavanja (ER) bila u pozitivnoj korelaciji s koncentracijom stresa tokom 100 generacija evolucije u S. cerevisiae ali u negativnoj korelaciji S. paradoxus[44].

Može se zaključiti da uvid u adaptivne unakrsne ovisnosti o stresu jednog organizma ne može zaključiti ovisnosti u drugom organizmu s jasnom evolucijskom pozadinom. Kao takvi, biotehnolozi moraju biti svjesni da će različiti (evoluirani) mikrobni domaćini vjerovatno pokazati različite kompromise tokom izlaganja stresu vezanom za proces.


Popratne informacije

S1 Fig

Nazivi sojeva sa sekvenciranim genomima prikazani su na žutoj pozadini. Broj generacija se računa kao broj mejotičkih događaja između dva soja. MAT a sojevi su prikazani s lijevom pupoljkom i MAT su desni pupoljci. Diploidi su nepupani. Zakrivljena strelica označava samooplodnju. Isprekidane strelice označavaju genetske manipulacije bez ukrštanja. 25-25-2V-P3982 (pun naziv soja je 25-25-dU8-132-L28-2V-P3982) je auksotrofni i supresorski mutantni derivat 2V-P3982 [28, 29]. 6P-33G-D373 je derivat 33G-D373 u kojem SUP35 je zamijenjen svojim homologom iz Pichia metanolica [25].

S2 Fig

(A) Populaciona struktura od 101 soja uključujući 15V-P4 procijenjena sa tri seta od 1210 varijabilnih pozicija sa otprilike ujednačenom distribucijom frekvencije manjeg alela. Uokvirene su populacije ili grupe sličnih populacija. 15V-P4 i S288C su označeni crvenom bojom. (B) Filogenetsko stablo spajanja susjeda od 97 sojeva uključujući 15V-P4, RedStar i YS9 zaključeno iz poravnanja konzervativnih hromozomskih regija. Pekarski sojevi (RedStar i YS9) su označeni ljubičastom bojom, 15V-P4 i S288C crvenom bojom.

S3 Fig

Kratka očitavanja za genom 15V-P4 su usklađena sa spojenim genomima S. sensu stricto vrste sa leptir mašnom2. S288C i YJM248 korišteni su kao negativna i pozitivna kontrola za introgresiju, respektivno. Port, S. kudriavzevii ZP 591. Sbay, S. bayanus var. uvarum CBS 7001. Scer, S. cerevisiae S288C. Skud, S. kudriavzevii IFO1802 T . Smik, S. mikatae IFO1815 T . Spar, S. paradoxus CBS432. Seub, S. eubayanus FM1318. Sarb, S. arboricolus H-6.

S4 Fig

(A) 1B, (B) 74. Isprekidane linije označavaju granice hromozoma.

S5 Fig

Desno su prikazani brojevi SNV-a u poređenju sa S288C (naglašeno različitim nijansama zelene sa intenzitetom boje proporcionalnim broju SNV-a) ili sa 15V-P4 (slično istaknuto nijansama ljubičaste).

S6 Fig

(A) Poravnanje kratkog čitanja. (B) Sangerovo ponovno sekvenciranje. Crveni okvir, TAA besmislena mutacija koja se pojavljuje na kodonu 161. (C) 33G-D373 postavljen na selektivni medij odmah nakon transformacije s prikazanim plazmidom s malim brojem kopija PHA2 alela. Vektor, pRS316. (D) Asp + i Asp - varijante 6P-33G-D373 uočene za suzbijanje besmislica i otpornost na bakar. Prikazane su serije 5-strukih razblaženja.

S7 Fig

Uvođenje centromernog plazmida divljeg tipa MSN4 alel ne utiče na termotoleranciju u 74-D694 ([psi - ]) i P-74-D694 ([PSI + ]). Prikazane su serije 5-strukih razblaženja. Vektor, pRS316.

S8 Fig

(A) SNV u GAL lokus u poređenju sa S288C. Gornji znak, referentni nukleotid donji karakter, varijantni nukleotid. Nukleotidi Watsonovog lanca su naznačeni. C287T zamjena u GAL10 od 1B je označeno plavim krugom. (B) Kompletan GAL lokus ili njegov GAL10-sadrži fragment, ali ne GAL1 sama kompenzira nemogućnost rasta 1B na mediju koji sadrži galaktozu. 1B je transformisan plazmidima sa više kopija koji sadrže kompletan GAL lokus (GAL7+GAL10+GAL1) ili njegovih fragmenata koji sadrže samo jedno i drugo GAL1 ili GAL7+GAL10. Prikazane su serije desetostrukih razblaženja uočenih na sintetičkim medijima kojima nedostaje leucin sa glukozom ili galaktozom/rafinozom kao izvorom ugljenika. Vektor, YEp351. (C) Poravnanje konzervativnog dijela homologa UDP-galaktoze-4-epimeraze (Gal10 od S. cerevisiae S288C i 1B sojevi i GalE proteini drugih vrsta). U plavom okviru, zamjena Ala96Val u 1B. U crvenom okviru, 94Val u ljudskom GALE.

S1 Tabela

S2 Tabela

Pozicije su naznačene prema S288C SUC2 sekvenca. Varijante se pozivaju prema kratkom poravnanju čitanja za sekvencionirane PGC sojeve i prema višestrukom poravnanju bez razmaka za poznate SUC geni (NCBI pristupni brojevi su dati u zagradama).

S3 Table

Prikazani su rezultati BLAST pretrage (izlazni format 6) u genomu 15V-P4 i genomu YJM248.

S4 Tabela

S5 Table

Geni koji su klasifikovani kao pojačani jer imaju bliske paraloge ili slične sekvence negdje drugdje u genomu su označeni bež bojom, oni koji se nalaze u amplificiranim hromozomima sivom, uobičajeni izbrisani geni narandžastom, a poznate genotipske promjene zelenom.


Biology Bootcamp

Dobrodošli u mikrosvijet! Na ovom času ćete raditi sa mikroorganizmima. To uključuje kvasac i bakterije, od kojih bi milioni stali u period na ovoj stranici. Takođe ćete raditi sa skupim reagensima, kao što su plazmidi i enzimi. Stoga, u svakom eksperimentu, od vas će se tražiti da precizno izmjerite zapremine od samo nekoliko mikrolitara (μL). Mikropipete će vam omogućiti da to učinite precizno i ​​precizno.

Ciljevi

Na kraju ove laboratorije studenti će moći:

  • odaberite i podesite najprikladniju mikropipetu za prijenos date zapremine.
  • precizno prenijeti mikrolitarske zapremine.
  • koristite spektrofotometar za mjerenje apsorpcije svjetlosti.
  • objasniti kako eksperimentalne greške utiču na mjerenja.

Upoznajte mikrobe

Ćelije i mikroorganizmi su premali da bi se mogli vidjeti golim okom, pa biolozi koriste mikroskop da ih vide. U ovoj laboratoriji naučit ćete podesiti svjetlosni mikroskop koristeći razmaz ljudske krvi kao uzorak. Zatim ćete koristiti mikroskop za analizu kultura kvasca koji pupaju, Saccharomyces cerevisiae, i crvena plijesan, Neurospora crassa. Budući da su se ova dva kvasca odvojila od zajedničkog pretka, razvili su različite morfologije i kontrole diobe stanica koje ćete biti vidljive pod mikroskopom. Također ćete primijetiti mnogo manju bakteriju, Escherichia coli, koji je jedan od radnih konja molekularne biologije.

Ciljevi

Na kraju ove laboratorije studenti će moći:

  • identificirati komponente složenog svjetlosnog mikroskopa.
  • opisuju vrste ćelija koje se nalaze u razmazu ljudske krvi.
  • podesite svjetlosni mikroskop za promatranje kultura bakterija i kvasca.
  • bojite mikrobne uzorke jodom kako biste poboljšali njihov optički kontrast.
  • razlikovati E. coli i kvasac po njihovoj veličini.
  • razlikovati S. cerevisiae i N. crassa po njihovim morfološkim karakteristikama.

Rad sa kvascem

Ova laboratorija će vas upoznati sa standardnim tehnikama koje se koriste u mikrobiologiji. Vrlo slične tehnike se koriste za uzgoj kvasca i bakterija, iako su uvjeti uzgoja optimizirani za svaki organizam. U ovoj laboratoriji naučit ćete sterilne tehnike potrebne za održavanje integriteta sojeva kvasca u laboratoriji, kao i metode za uzgoj stanica i procjenu broja ćelija.

Ciljevi

Na kraju ove laboratorijske vježbe studenti će moći:

  • definirati i opisati odnos između vrsta, sojeva i genotipova.
  • koristiti sterilne tehnike za uzgoj sojeva kvasca na agar pločama.
  • opisati faze rasta mikroba.
  • procijeniti gustinu ćelija u tečnoj kulturi koristeći spektrofotometriju i tačku.

Uvod u baze podataka

Računar pripada klupi u modernoj biološkoj laboratoriji, zajedno sa ostalom neophodnom opremom. Mreža onlajn baza podataka omogućava istraživačima brz pristup informacijama o genima, proteinima, fenotipovima i publikacijama. U ovoj laboratoriji ćete prikupiti informacije o MET genu iz raznih baza podataka.


Priznanja

Zahvaljujemo Stefaniji Kapsetaki, Guyu Cooperu, Jacobusu Boomsmi i dvojici anonimnih recenzenata na komentarima.

Glossary

Kada je više pojedinačnih ćelija u kontaktu. To uključuje stanice koje se prolazno lijepe zajedno kroz proizvodnju ljepljive tvari, koordinirane grupe stanica koje pokazuju kooperativno ponašanje kao što je proizvodnja javnih dobara i obavezne grupe stanica koje formiraju višećelijske organizme kakve vidimo kod životinja i biljaka.

Kada su pojedinačne ćelije obavezno dio višećelijskog tijela i ne mogu preživjeti i razmnožavati se izvan višećelijskog tijela. Obavezna višećelijska je razvojno određena, a ne odgovor na uslove okoline.

Kada pojedinačne ćelije mogu postati dio višećelijskog tijela kao odgovor na uvjete okoline, a zatim se ponovo mogu vratiti u jednoćelijsko. Oni se ne oslanjaju na to da su višećelijski da bi preživjeli i razmnožavali se. Fakultativna multicelularnost uključuje oba jednostavna oblika, gdje se stanice lijepe jedna za drugu kako bi formirale nakupine (npr. neki bakterijski biofilmi) do složenijih oblika s diferenciranim stanicama (npr.

Velika evolucijska tranzicija u individualnosti događa se kada pojedinačne jedinice (npr. geni, ćelije ili jedinke) sarađuju i formiraju novu, složeniju jedinku, koja se kasnije može razmnožavati samo kao cjelina.

Obavezno višećelijska vrsta koja je prošla kroz veliku evolucijsku tranziciju u individualnosti.


Rezultati i diskusija

Fiziologija ćelije u uslovima bogatim nutrijentima i ograničenim uslovima

Da bismo procijenili efekte brisanja Snf1 i TORC1 na rast stanica, okarakterizirali smo osnovnu fiziologiju mutantnih sojeva snf1Δ, tor1Δ i snf1Δtor1Δ zajedno sa referentnom sojom CEN. PK113-7D (Dopunska tabela S1) uzgojem ih prvo u serijama, a zatim prebačeni na kemostat, oba koristeći definirani minimalni medij s glukozom kao jedinim izvorom ugljika. Hemostatske kulture korištene su iz nekoliko razloga. Prvo, moguće je povezati opažanja sa ograničavajućim nutrijentom. Drugo, budući da mutanti imaju različite maksimalne specifične stope rasta, hemostati nude platformu za poređenje različitih sojeva pri istoj stopi rasta, čime se eliminišu svi efekti povezani s rastom (Fazio et al, 2008). Konačno, od mutantnog soja snf1Δ ne može rasti na nefermentirajućim izvorima ugljika (kao što su etanol i glicerol), hemostat ograničen glukozom je jedina opcija da se osigura aktivnost Snf1 u uporedivim uvjetima rasta. Postoji nekoliko dobrih izvora azota za kvasac, kao što su glutamin i amonijum (Zaman et al, 2008), međutim, glutamin se također može koristiti kao izvor ugljika i stoga je neprikladan za kulture s ograničenim nutrijentima.

Svi mutantni sojevi rasli su sporije (za 12-22%) koristeći glukozu kao jedini izvor ugljika i amonijum kao jedini izvor dušika, u poređenju sa referentnim sojem, što ukazuje na doprinos Snf1 i TORC1 tokom eksponencijalnog rasta i brisanje bilo kojeg proteina smanjuje ćeliju rast na definisanom minimalnom mediju (Tabela I). Međutim, zapažanje ekvivalentnog smanjenja (oko 20% niže) maksimalne specifične stope rasta za snf1Δtor1Čini se da je Δ soj u suprotnosti s hipotetičkom genetskom interakcijom između Snf1 i TORC1 u ovim uvjetima, jer bi se očekivalo ozbiljnije fenotipske promjene u dvostrukom mutantnom soju ako je prisutna genetska interakcija (Boone et al, 2007). Brisanje Snf1 (snf1Δ i snf1Δtor1Δ) rezultiralo je značajnim smanjenjem (∼25%) prinosa biomase u poređenju sa referentnim sojem u hemostatskim kulturama ograničenim na glukozu (Tabela I). Naprotiv, uočili smo mali porast prinosa biomase za tor1Δ pod ovim uslovima. Dvostruki mutant proizvodi acetat i glicerol, čak i pod potpuno respiratornim uslovima. Zanimljivo je da nismo uočili nikakvu bitnu razliku u prinosu biomase u uslovima N-ograničenim.

Srednje Procijedite μmax YSX YSAc
h −1 g g −1 Cmol Cmol −1
C-ograničeno Referenca 0.37±0.01 0.515±0.007 <0,002
snf1Δ 0.29±0.00 0.384±0.003 0.007±0.004
tor1Δ 0.33±0.01 0.534±0.003 <0,002
snf1Δtor1Δ 0.30±0.00 0.382±0.002 0.028±0.003
N-ograničeno Referenca 0.097±0.002 0.006±0.000
snf1Δ 0.102±0.000 0.008±0.000
tor1Δ 0.095±0.000 0.008±0.001
snf1Δtor1Δ 0.107±0.001 0.009±0.000
  • Sve vrijednosti su prosječne±s.e.m. iz najmanje tri biološke replike. μmax, maksimalna specifična stopa rasta glukoze u šaržnim kulturama YSX, prinos biomase na glukozu u hemostatskim kulturama YSAc, prinos acetata na glukozu u hemostatskim kulturama. μmax za svaki soj određen je na osnovu CO2 emisija tokom šaržne faze kulture.

Efekti brisanja Tor1 bili su relativno umjereni, s obzirom da je TORC1 glavni regulator rasta i proliferacije ćelija (Schmelzle i Hall, 2000). To bi moglo biti zbog kompenzacijske uloge Tor2, koji također može formirati TORC1. Da bismo procijenili ovu hipotezu, ispitali smo osjetljivost reference i tor1Δ sojevi u prisustvu rapamicina. Dok je referentni soj mogao tolerirati do 2 nM rapamicina u mediju za rast, nije bilo vidljivog rasta tor1Δ soj pri bilo kojoj koncentraciji rapamicina (dodatna slika S1). Povećana osjetljivost na rapamicin uzrokovana gubitkom Tor1, što je bilo u skladu s prethodnim nalazima (Chan et al, 2000 Reinke et al, 2004 Xie et al, 2005), predložio je brisanje TOR1 gen izazvao značajno smanjenje TORC1 signalizacije ili kompleksne aktivnosti i Tor2 stoga nije mogao u potpunosti nadoknaditi gubitak Tor1 funkcije. Budući da rapamicin inhibira TORC1 fizičkim vezanjem za kompleks, ovi rezultati jasno pokazuju da je Tor1 odgovoran za većinu aktivnosti TORC1 i tor1Δ deformacija, stoga, predstavlja obaranje, ali ne nužno i potpuni gubitak funkcije, TORC1.

Globalne promjene transkriptoma zbog gubitka SNF1 ali ne TOR1

Koristili smo platformu Affymetrix DNA microarray za mjerenje nivoa ekspresije svih gena i procjenu globalnog efekta uzrokovanog brisanjem gena. SNF1 i TOR1 gena u uslovima ograničenim nutrijentima. Podaci o transkriptomu su dekomponovani korišćenjem analize glavnih komponenti (PCA). Prva glavna komponenta (PC1), koja je činila oko 40% ukupnih varijacija u podacima (dodatna slika S2A), prvenstveno je razlikovala uticaj ograničenja nutrijenata (slika 1A), što se očekivalo jer su ćelije disale na C- ograničenom stanju dok su respiro-fermentirali u N-ograničenom stanju. Druga glavna komponenta (PC2) predstavlja uticaj SNF1 brisanje. Takođe je evidentno da je razlika između snf1Δ i referenca (predstavljena rastojanjem između referentne i snf1Δ na slici 1A) je mnogo veći u stanju ograničenom C u poređenju sa stanjem ograničenim na N, što potvrđuje da Snf1 ima veću ulogu u stanju ograničenom glukozom. Iznenađujuće, naši podaci nisu otkrili nikakvu transkripcijsku ulogu za TOR1 gena, naznačeno preklapanjem od tor1Δ i referentni soj pri svim ograničenjima nutrijenata (Slika 1). Nadalje, TOR1 Čini se da brisanje nije imalo veliki uticaj čak ni u snf1Δ pozadine, što je vidljivo iz neposredne blizine snf1Δtor1Δ sa snf1Δ pod svim proučavanim uslovima. Ovaj rezultat sugerira da je Tor1 neophodan u bilo kojem od uvjeta ograničenih nutrijentima. Nije jasno da li do neupotrebljivosti dolazi zbog njegove djelimične redundancije sa Tor2 ili zbog potiskivanja funkcije Tor1 u ovim uslovima. Da bismo dalje ispitali stepen promjena u svakom mutantnom soju, izvršili smo poređenje u parovima. U C-ograničenom stanju, ekspresija gena 519 i 603 je značajno promijenjena (prilagođena str<0,001) in snf1Δ i snf1Δtor1Δ, respektivno, u odnosu na referentnu deformaciju. Analiza pojmova genske ontologije (GO) otkrila je da transkripcija gena uključenih u metabolizam dušika, metabolizam etanola i transdukciju signala zavisnu od feromona izgleda specifično kontrolira Tor1, a drugi procesi kao što su odgovor na stres i biosinteza ergosterola i glutamata upravlja Snf1 ( Slika 1B).

Mjerenje globalne ekspresije gena dalo je jasan uvid u metaboličke razlike između sojeva. Povećana proizvodnja acetata (Tabela I) bila je u skladu sa manjom ekspresijom ACS1 (kodiraju acetil-CoA sintetazu) u snf1Δ i snf1Δtor1Δ sojevi (dodatna slika S3). Ekspresija druge acetil-CoA sintetaze (kodirana od ACS2) koji nije podložan represiji glukoze blago povećan u snf1Δ soj, što je u skladu s prethodnim nalazima (van den Berg et al, 1996.). Dva druga gena u metabolizmu acetata, ADY2 (kodira acetatni transporter) i ALD4 (encodes a mitochondrial aldehyde dehydrogenase), showed similar expression patterns (Supplementary Figure S3). The change in gene expression for both ACS1 i ADY2 was more prominent in the snf1Δtor1Δ strain compared with the snf1Δ strain. However, the expression of these genes being unchanged in the tor1Δ strain indicates that the role of TORC1 in acetate metabolism relies on Snf1 activity, or in other words it seems like TORC1 has a role in the metabolism of alternative carbon sources through an active Snf1 kinase.

To identify transcriptional regulation of metabolism in response to deletion of SNF1 i/ili TOR1, we overlaid the transcriptome onto a genome-scale metabolic model of S. cerevisiae. This method ( Patil and Nielsen, 2005 Oliveira et al, 2008 ) allows identifying the so-called reporter features (metabolites, TFs, etc) around which significant transcriptional activity occurred and also subnetworks of coordinated transcriptional changes. On C-limited condition, deleting SNF1 (snf1Δ i snf1Δtor1Δ) resulted in an extensive transcriptional reprogramming around redox cofactors (NAD(P) + /NAD(P)H), Coenzyme A, several amino acids and α-ketoglutarate (Z-score >1.5) (Supplementary Table S2). These differences were identified primarily though global TFs such as Msn2/4, Cat8, Ino2/4, Oaf1/Pip2, and Hap1 that regulate stress response, aerobic respiration, as well as glucose and sterol metabolism (Supplementary Table S2). Although deleting TOR1 alone did not have any significant transcriptional response, deleting TOR1 u snf1Δ background resulted in an altered expression for a small subset of genes (involved in several processes including stress response, tRNA methylation, protein targeting to vacuole, ammonium transport, intracellular protein transport), indicating that these processes might be co-regulated by Snf1 and TORC1. Overall transcriptome data from glucose limitation contradict the hypothesis that Snf1 inhibits TORC1.

TOR1 deletion had no distinct phosphorylation response

Since both Snf1 and TORC1 are kinase complexes and regulate several processes mainly through phosphorylation of their respective target proteins ( Zaman et al, 2008 Smets et al, 2010 ), we measured the level of phosphorylation of various proteins for all strains under C- and N-limited conditions. As with the transcriptome data, the phosphoproteome data were also analyzed using PCA. The analysis revealed that the TOR1 deletion did not lead to a distinct phosphoproteome profile compared with the reference strain, irrespective of the nutrient limitation. Under all conditions studied, the phosphoproteome profile of tor1Δ always clustered with that of the reference and the phosphoproteome profile of snf1Δtor1Δ always clustered with that of snf1Δ (Figure 2). The reference and tor1Δ strains on C-limited were separated farthest from the other strains/conditions (Figure 2), indicating that the deletion of Snf1 has a dominant response irrespective of the limiting nutrient. Out of the 1714 phosphopeptides that were detected and identified, 399 and 206 peptides had significantly changed phosphorylation level in at least one mutant compared with the reference strain, on C- and N-limited conditions, respectively.

We observed a clear Snf1-dependent pattern of phosphorylation (lower phosphorylation level in snf1Δ i snf1Δtor1Δ but not tor1Δ) for transcription repressor Cyc8 and its co-component Tup1 (Supplementary Figure S4). Since the Cyc8–Tup1 complex generally represses the transcription of many genes through different modes ( Smith and Johnson, 2000 ), it may be responsible for upregulation of a subset of genes in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains. This further supports that the transcriptome profile for snf1Δ i snf1Δtor1Δ was significantly changed directly due to the role of Snf1 in the regulation of transcription. This is supported by findings that several other proteins involved in regulation of transcription by histone modification (Bdf1, Eaf1, Leo1, Rph1 and Sin3) were also found to be differentially phosphorylated only in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains. Significantly changed expression of ACS1 in snf1Δ i snf1Δtor1Δ might also contribute to changes in histone acetylation and global changes in transcription observed in these mutants ( Takahashi et al, 2006). These results are in complete consistence with the important role of Snf1 in the regulation of gene transcription ( Usaite et al, 2009 ).

Mammalian TORC1 (mTORC1) is repressed by AMPK ( Dennis et al, 2001 Bolster et al, 2002 Inoki et al, 2003 ), and several lines of evidence suggest direct or indirect interaction between Snf1 and TORC1 ( Bertram et al, 2002 Orlova et al, 2006 ) in yeast. However, in our analysis, we did not find any change in the phosphorylation level of TORC1 due to loss of Snf1 kinase or obrnuto (Supplementary Figure S5). Only Tco89 (a non-essential component of TORC1) was identified as differentially phosphorylated in a Tor1-dependent manner. Despite the state-of-art methods used in identifying phosphoproteins, it is likely that some phosphopeptides have not been identified due to low abundance, inefficient purification, poor ionization, etc. Considering this limitation, the absence of all components of the Snf1 and TORC1 pathways in our phosphoproteome analyses compels us to conclude that Snf1 and TORC1 do not regulate the phosphorylation of each other under the conditions studied. It has been shown that phosphorylation of residual T210 on Snf1 is regulated by the nitrogen source or rapamycin through TORC1 ( Orlova et al, 2006 ), which raised the possibility that TORC1 negatively regulates Snf1. However, both transcriptome and phosphoproteome data revealed a negligible role for Tor1 irrespective of Snf1 deletion, suggesting that TORC1 was mainly repressed at C-limited condition and this repression may be independent of Snf1. Based on these inferences, we propose that the Snf1 and TORC1 pathways only crosstalk via intermediate(s) under nutrient limitation. Such an intermediate would operate at the upstream of Snf1 and TORC1 and switches between the Snf1 and TORC1 activity (i.e., either Snf1 or TORC1, but not both, could be active under nutrient-limited conditions). One such intermediate could be the PKA/RAS pathway, which together with Snf1 can be perceived as a switch that senses the glucose concentration and regulates the cell metabolism accordingly ( Zaman et al, 2009). The identification of significantly decreased phosphorylation of Bcy1, the regulatory subunit of PKA pathway, in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains suggests a possible link between the Snf1 and PKA pathways (Supplementary Figure S5). PKA interacts with TORC1 in the regulation of protein translation and cell cycle ( Martin et al, 2004 Wanke et al, 2005 ), and it may therefore bridge the Snf1 and TORC1 pathways. Since PKA and TORC1 are active in nutrient excess, while Snf1 is only fully active under glucose limitation or stress conditions, the media and growth conditions are essential for studying the regulatory pathways involved in nutrient sensing, because a shake flask cultivation using a rich medium (typically the YPD medium supplemented with 2% of glucose) is a completely different scenario from the chemostat culture fed with C- or N-limited medium.

Convergence of Snf1 and TORC1 onto amino-acid biosynthesis

Neither the transcriptome nor the phosphoproteome data supported a direct link between Snf1 and TORC1 or the pathways they regulate. However, integration of these data using a metabolic model revealed extensive regulation around biosynthesis of amino acid and lipid (Supplementary Table S2). To investigate the regulation of amino-acid biosynthesis by Snf1 and TORC1, we quantified the intracellular level of 17 proteinogenic amino acids in all strains grown under both nutrient-limited conditions (Supplementary Table S3). Serine and arginine cannot be measured using the method applied and the cysteine level was below detection threshold. The free amino-acid pool under C-limited condition was 2- to 4.5-fold higher compared with that for N-limited condition for all the strains. During glucose limitation, the tor1Δ strain had about 17% higher level of free amino-acid pool, while the snf1Δ strain had a level about 29% lower compared with the reference strain (Figure 3A). During ammonium limitation, the strain snf1Δ had a similar level as the reference, while the tor1Δ i snf1Δtor1Δ strains had 170 and 93% higher total amino-acid level compared with the reference, respectively (Figure 3A). A substantial part of these differences was due to changes in glutamate and glutamine, which accounted for 60–75% of the total amino acid (Figure 3B and C).

To identify transcriptional regulation of amino-acid metabolism, we correlated the amino-acid levels with the expression of genes involved in their biosynthesis. Surprisingly, many genes responsible for the amino-acid biosynthesis were negatively correlated with the amino-acid levels (Figure 3 Supplementary Figure S6), indicating that the changes in the amino-acid abundance were not due to differential expression of corresponding amino-acid biosynthetic genes. We speculate that it may be due to that TORC1 senses a low level of glutamine (Figure 3B Crespo et al, 2002 ) and consequently, the inhibition on Gcn4 is relieved ( Valenzuela et al, 2001). Next, we studied the drain from the central carbon metabolism into the amino-acid biosynthesis. Since the expression of genes in TCA cycle is highly regulated by the nature and availability of carbon sources in an Snf1-dependent manner ( Young et al, 2003 ), one may speculate if the lower level of Glx and other amino acids was due to the generally downregulated TCA cycle in the snf1Δ strain on C-limited and hence shortage of α-ketoglutarate, the direct precursor for amino acids of the glutamate family. However, a clear retrograde signaling response in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains, reflected by both an induction of CIT2 (about 4-fold) and genes responsible for the early steps in the TCA cycle (CIT1, ACO1/ACO2, IDH1/IDH2) ( Liu and Butow, 2006 ), confirmed that the amino-acid biosynthesis was not limited by the supply of α-ketoglutarate. Instead, a plausible explanation for the lower level of amino-acid pool in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains would be that the expression of GDH3, which encodes one of the isoforms of glutamate dehydrogenase when cells are grown under derepressive conditions ( DeLuna et al, 2001 ), was transcriptionally downregulated by >4-fold in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains. The amino-acid biosynthesis was, therefore, likely limited by the inefficient conversion of α-ketoglutarate to glutamate, which is the main nitrogen source for cell growth. This phenomenon is similar to the one that was previously reported, where simply overexpression of GDH2 in the mutant strain gdh1Δ grown on batch culture (where the Gdh1 is the major isoform of glutamate dehydrogenase) changed the overall amino-acid pool significantly ( Villas-Boas et al, 2005.). On the other hand, the increased level for amino acids in tor1Δ could be attributed to an impaired balance between protein synthesis and degradation as a consequence of TOR1 deletion ( Inoki et al, 2005 ).

We also found that amino-acid biosynthesis is regulated at the post-translational level. For example, homocitrate synthase (encoded by LYS20 i LYS21), which catalyzes the condensation of acetyl-CoA and α-ketoglutarate to form homocitrate, was found to be significantly more phosphorylated in the snf1Δ strain and to a lesser extent in the snf1Δtor1Δ strain. However, the phosphorylation of only LYS20 decreased in the tor1Δ strain (by ∼2-fold Supplementary Figure S7). Since the intracellular lysine level significantly increased in all mutant strains (being highest in tor1Δ) at C-limited condition (Figure 3C), we could conclude that the homocitrate synthase isoenzymes (Lys20 and Lys21) are not only regulated through feedback inhibition by lysine, but could also be regulated through phosphorylation of these enzymes in an Snf1/TORC1-dependent manner. Collectively, we propose that Snf1 and TORC1 regulate the amino-acid biosynthesis via two independent mechanisms.

TORC1 may have a role in the regulation of FAs

To unravel the role of Snf1 and TORC1 in the regulation of FA metabolism, we measured the relative abundance of FAs, including the free and ester form (e.g., in triacylglycerol), in the reference and mutant strains on both C- and N-limited conditions. Since Snf1 regulates FA biosynthesis by inhibiting acetyl-CoA carboxylase (Acc1) under derepressive conditions ( Woods et al, 1994 ), the significant increase of total FA in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains on C-limited condition was expectable (Figure 4). However, there was a significant variation in the FA species between different strains and the two growth conditions. The most abundant species was C18:1, where the largest differences between strains were observed (Figure 4E). The snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains had higher levels of C18 (i.e., both C18:0 and C18:1) and longer FAs, on both C- and N-limited conditions, compared with the reference strain (Figure 4D–F), except for C14 where the result was contrary (Figure 4A). The snf1Δtor1Δ strain had higher amounts of C18 compared with the snf1Δ strain irrespective of the growth condition. The tor1Δ strain had higher C14 and C16 on N-limited condition, but the levels were lower on C-limited condition, compared with the reference strain.

However, this was only observed for C18 and longer FAs in these two strains (Figure 4D and E), while the abundance of C14 was reduced in the mutant strains in which SNF1 was deleted. There may be two mechanisms that can explain the different patterns between the FAs with different length. One possibility could be that while the inhibition of acetyl-CoA carboxylase by Snf1 was relieved, and the FA synthetase (encoded by FAS1 i FAS2) is constitutively functional and steadily converting short chain FAs to synthesize up to C16. Consistently, the elongase I (encoded by ELO1) that convert C12–16 to C18 was also found to be transcriptionally upregulated in snf1Δ i snf1Δtor1Δ therefore, C16 was not accumulated in the strain snf1Δ i snf1Δtor1Δ (Figure 4B and C). It could also be that a lower peroxisome biogenesis due to the loss of Snf1 leads to a lower level of β-oxidation of the long chain FAs ( Ratnakumar and Young, 2010 ), therefore not only the biosynthesis, but also the degradation of FAs is regulated by Snf1. We also observed that the deletion of TOR1 had some effect on the abundance of FAs, although to a lesser extent compared with those for SNF1 deletion (Figure 4D and E). The deletion of TOR1 u snf1Δ background strengthened the changes caused by the deletion of SNF1 for C18:0, but rather dampened the changes for C18:1 (the most abundant FA species). The FA data support the hypothesis that Tor1 has a role in the regulation of FAs. However, TORC1 is unlikely involved in the regulation of acetyl-CoA carboxylase, and we suspect that the TORC1 may have a role in the regulation of peroxisome and β-oxidation of FAs. It is also interesting to notice that although deletion of TOR1 had not caused an evident change to the transcription and phosphorylation, many amino acids and FA species had changed significantly (Figures 3 and 4). This observation further supports the ideas that the intermediate metabolites are much more sensitive to mutations, while metabolic fluxes are rather robust ( Cornish-Bowden and Cardenas, 2001 Raamsdonk et al, 2001 ).

Regulation of translation and cell growth

Since TORC1 promotes biosynthesis of ribosome and protein ( Wullschleger et al, 2006 ), while Snf1 represses the energetically expensive processes such as biosynthesis of lipid and proteins ( Hardie, 2007 ), we looked at the Snf1 and TORC1 regulation of protein translation, both at the transcriptome and at the phosphoproteome levels. Surprisingly, the deletion of SNF1 led to a significantly (despite <2-fold) increased expression of many genes involved in translation initiation or elongation, while the deletion of TOR1 alone did not cause any changes (Figure 5A). This held true even for the translation initiation or elongation factors (with only a few exceptions) that were found to be differentially phosphorylated in the mutant strains compared with the reference strain (Figure 5C). The observation that protein synthesis being primarily regulated by Snf1 instead of TORC1 seems to contradict the common knowledge that TORC1 is the main regulator for ribosomal translation ( Inoki et al, 2005.). However, taken the growth conditions (i.e., glucose limitation) into account it is actually consistent with the role of Snf1 as a global regulator of energy homeostasis and a repressor of anabolic processes ( Hardie, 2007 ). The relative small changes in the snf1Δtor1Δ strain compared with the snf1Δ strain may advocate an inhibition of TORC1 under C-limited condition, as the TORC1 activity may require a high level of both ammonium and glucose (Figure 6). Interestingly, many genes involved in the mitochondrial ribosome and protein translation also had a similar pattern of expression where it was increased in the snf1Δ i snf1Δtor1Δ strains, and deletion of TOR1 had either no effect or similar effect with a lower magnitude (Figure 5B). Collectively, we conclude that the Snf1 has a major role in cell the mitochondrial proteome under C-limited condition.


Kvasci

Yeasts are fungi that grow as single cells, producing daughter cells either by budding (the budding yeasts) or by binary fission (the fission yeasts). They differ from most fungi, which grow as thread-like hyphae. But this distinction is not a fundamental one, because some fungi can alternate between a yeast phase and a hyphal phase, depending on environmental conditions. Such fungi are termed dimorphic (with two shapes) and they include several that cause disease of humans.

Here we consider several examples of yeasts and dimorphic fungi:

  • the common baker's yeast, Saccharomyces cerevisiae
  • the genus Cryptococcus, which includes C. neoformans, a pathogen of humans
  • the dimorphic fungus Candida albicans which can be a significant pathogen of humans
  • some of the common leaf surface yeasts.

For further information, see " Dr Fungus " ( not on this server )

Yeasts grow typically in moist environments where there is a plentiful supply of simple, soluble nutrients such as sugars and amino acids. For this reason they are common on leaf and fruit surfaces, on roots and in various types of food. With few exceptions, they are unable to degrade polymers, such as starch and cellulose which are used by many hyphal fungi.


Saccharomyces cerevisiae ( Figure A ) is the budding yeast used for bread-making, where the carbon dioxide produced by growth in the dough causes the bread to rise. Essentially similar yeasts, but now given different species names, are used for production of beers, wines and other alcoholic drinks. This phase-contrast micrograph shows cells in various stages of budding. The buds are small at first, but enlarge progressively and eventually separate from the mother cell by formation of a septum (cross wall).

Few of the cellular organelles can be seen by light microscopy, unless they are stained specifically. The only conspicuous organelle seen in Fig. A is the large central vacuole which contributes to cell expansion. S. cerevisiae is a member of the fungal group Ascomycota (the ascus-forming fungi).

Cryptococcus albidus ( Figure B ) is another budding yeast, shown here by phase-contrast microscopy but also with negative staining (the cells are suspended in India ink). Various stages of bud development are seen. The cells are surrounded by a rigid polysaccharide capsule, typical of the genus Cryptococcus, and seen as distinct haloes where the India ink particles have been excluded.

Cryptococcus species are common on leaf surfaces. But the most important species from the human standpoint is C. neoformans, a significant pathogen of immunocompromised people, causing the disease termed cryptococcosis. This disease occurs in about 7-8% of AIDS patients in the USA, and a slightly smaller percentage (3-6%) in western Europe. The capsule is a significant virulence determinant of C. neoformans because it helps to prevent the cells from being recognised and engulfed by white blood cells. Osim toga, C. neoformans is unique among Cryptococcus species in producing a phenoloxidase. This enzyme acts on phenolic compounds to produce melanin, which might help to protect the cells against the antimicrobial effects of oxidants in host tissues.

C. neoformans grows commonly on old "weathered" bird droppings in cities, but does not compete well with bacteria in wet droppings. It infects through the lungs, where it causes a mild or chronic, persistent pneumonia, depending on the person's degree of immunity. Random testing of people for skin reactions to C. neoformans antigens in Britain, Australia and the USA indicates that many people have unknowingly been exposed to the fungus with no serious effect. However, in a small proportion of the population the fungus can disseminate "silently" in the central nervous system, causing fatality.

For many years it was assumed that yeast cells inhaled in dried, powdered bird droppings were the source of lung infection. But a sexual stage of the fungus has now been discovered in laboratory culture it is typical of the fungal group Basidiomycota (which includes the mushroom fungi) but is microscopic, and it leads to the release of small (about 3 micrometre) airborne basidiospores. These are the ideal size for deposition in the lungs (see Airborne Microbes ). They are thought to be the main means of infection, but their environmental source is unknown - perhaps a yeast stage growing on vegetation.

Candida albicans is a dimorphic fungus that grows at 37 o C. Its normal habitat is the mucosal membranes of humans and other warm-blooded animals, where it grows as a yeast (Fig. C) and causes little or no damage. In fact, it can be isolated from the mucosa of up to 50% of humans - from the mouth, the gut, the vagina or, less often, from the surface of the skin.

In some circumstances, however, the same strains of C. albicans that grow as harmless commensals can become pathogenic, invading the mucosa and causing significant damage. This usually happens when a variety of predisposing factors cause the yeast population to multiply, escaping the normal competition from resident bacteria which keep the yeast population in check. Then the yeast cells sprout a hyphal outgrowth (Fig. D) which locally penetrates the mucosal membrane, causing irritation and shedding of the tissues.

One of the best examples of this is the disease termed thrush - a white speckling of the tongue and the back of the throat, resembling the speckling on the bird's chest. This is common in newborn babies, perhaps resulting from passage through an infected birth canal. It is also common in AIDS patients and people who have had a prolonged course of antibacterial therapy, reducing the normal resident bacterial population.

C. albicans also causes vaginitis - inflammation and invasion of the vaginal mucosa, especially during the third trimester of pregnancy and in women who take the pill. The predisposing factors seem to be hormonal, associated with changes in the balance of cell types in the lining epithelium of the vagina. A similar condition termed stomatitis is common in people who wear dentures. Candida can adhere to denture resin, and high sugar levels in the diet can also increase the adhesion by enhancing the production of a mannoprotein adhesive on the yeast cell surface. Systemic candidosis is a more serious condition, when yeast cells proliferate in the circulatory system. This can occur after invasive surgical techniques, including the insertion of intravenous catheters to which the yeast cells adhere, providing a base from which the cells can bud and be disseminated.

All these examples illustrate that C. albicans is a classic opportunistic pathogen, normally kept in check but capable of flaring up in specific, predisposing conditions. It can be identified quite readily from clinical specimens by its ability to sprout hyphae when yeast cells at 37 o C are transferred to tubes of horse serum and incubated for 3-5 hours (Fig. D). Samo C. albicans and a few related pathogenic Candida species do this. But the fungus has a strong tendency to revert to the yeast phase after only a short period of hyphal growth. Figures E i F show this for horse serum incubated for 24 hours - the hyphae themselves have a beaded appearance, and they give rise to budding yeast cells at the sites where the hyphae of other fungi would form branches.

The common occurrence of yeasts on leaf surfaces can be shown by the method in Slika G, where a healthy leaf (in this case from a birch tree) is pressed against the surface of an agar plate for several hours, then removed and the plate is incubated at room temperature. In this example, almost the whole of the leaf print consists of colonies of a single Candida-like dimorphic fungus. The centres of the colonies consist of a mass of yellow-coloured yeast cells, but the fungus is extending across the agar as hyphae at the colony margin (arrowhead). Figures I-K show one of these colonies at increasing magnifications. Instead of branching, the hyphae produce clusters of budding yeast cells at the septa (hyphal cross walls). Older and fallen leaves often have a more diverse fungal community, shown for a fallen oak leaf in Figure H . Again, there are dimorphic fungi (arrowhead) but colonies of Mucor (m) and some darkly pigmented fungi (centre of the leaf print) are also present. The darkly pigmented fungi commonly include Cladosporium species (not shown) and one of the dimorphic "black yeasts", Aureobasidium pullulans (Slika L).

Medical aspects:

KJ Kwon-Chung & JE Bennett (1992) Medical Mycology. Lea & Febiger, Philadelphia.

NH Georgopapadakou & TJ Walsh (1994) Human mycoses: drugs and targets for emerging pathogens. Nauka 264, 371-3.


Pogledajte video: Saccharomyces yeast life cycle, structure. (Decembar 2022).