Informacije

Kako mRNA pronalaze ribozome?

Kako mRNA pronalaze ribozome?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Nakon što se mRNA oslobodi iz jezgra, sljedeći proces je njeno prevođenje ribozomima. Kojim fizičkim, hemijskim ili biohemijskim procesom mRNA stiže do ribozoma u citoplazmi?


pogledajte ovaj članak i njegove slike.

R. J. Jackson et al., 2010, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 11:113.

https://www.nature.com/articles/nrm2838

Ukratko, prepoznavanje mRNK od strane ribosoma odvija se u više koraka. Interakcija mRNK sa (eukariotskim) inicijacijskim faktorima (eIF) dovodi do toga. Kompleks eIF4 stupa u interakciju sa mRNA i tada se formira srednja kružna mRNA uz pomoć hidrolize ATP-a. Ova kružna mRNA se veže za malu podjedinicu ribosoma. (mala podjedinica ima desetak pomoćnih proteina vezanih za sebe.) Nakon vezivanja za sebe. kružnu mRNA na malu podjedinicu, možete reći da je mRNA "pronašla" ribosom jer bi mala podjedinica tada formirala kompleks s velikom podjedinicom i započela korak produljenja translacije.


Odgovor na prvi dio vašeg pitanja je: difuzija. Nakon transkripcije i neke obrade, eukariotska mRNA se izvozi u citoplazmu. Ovdje lebdi okolo dok ne sretne ribozom. Vezivanje ribozoma za mRNA je olakšano proteinima koji se nazivaju faktori inicijacije (IF) i 5' kapa mRNA$^1$.

Drugi dio vašeg pitanja u osnovi se odnosi na sintezu proteina bez ćelija korištenjem RNA šablona. Ovo se već pokazalo da radi: podsjetimo se na čuveni Nirenberg-Matthaei eksperiment$^2$, što je na kraju dovelo do pucanja genetskog koda. Nirenberg i Matthaei su radili sa ekstraktima bakterijskih ćelija, ali su razvijeni i sistemi zasnovani na ekstraktima eukariotskih ćelija.$^3$.


Reference i dalje čitanje:

  1. Nelson DL, Cox MM. Lehningerovi principi biohemije. 7. izdanje (međunarodno izdanje). Basingstoke, Engleska: Macmillan Higher Education; c2017. Poglavlje 27, Metabolizam proteina; str. 1077-1126.
  2. Nirenberg MW, Matthaei JH. Ovisnost sinteze proteina bez ćelija u E. coli o prirodnim ili sintetičkim poliribonukleotidima. PNAS. 1961. oktobar 1;47(10):1588-1602. https://doi.org/10.1073/pnas.47.10.1588
  3. Chong S. Pregled sinteze proteina bez ćelija: historijske znamenitosti, komercijalni sistemi i proširene primjene. Curr Protoc Mol Bio. 2014. oktobar 1;108(1):16.30.1-11. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1630s108

Uvod u RNA biologiju: Cartoon Edition

DNK sadrži uputstva kako da izgradimo sve u našim tijelima. Svaka vaša ćelija sadrži kopiju vaše DNK - poput skupa nacrta. Dijelovi ovih uputstava izvode se prema potrebi u različitim ćelijama.

Obično se slijede upute u DNK nacrtima za izgradnju različitih proteina. Proteini obavljaju veliki dio posla koji je potreban da bi tijelo funkcionisalo. U svakom trenutku, jedna ćelija može slijediti upute kako napraviti imuni protein za odbranu tijela od napadača poput virusa, dok druga stvara protein koji pomaže želucu da probavi hranu.

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Generalno, DNK se čuva unutar jezgra, gdje postoji centralna biblioteka nacrta za cijelu ćeliju. Međutim, proteini se ugrađuju u drugom dijelu ćelije. Kako se upute za proteine ​​prenose iz DNK nacrta do mjesta gdje su proteini zapravo izgrađeni? Nose se u obliku glasničke RNK ili mRNA. Svaka mRNA sadrži kopiju specifičnog nacrta iz veće biblioteke DNK. On prenosi ovaj nacrt u ćeliju, gdje se stvaraju proteini. (mRNA nisu jedina vrsta RNK. Postoji mnogo drugih tipova koji rade i druge stvari, a kasnije ćemo reći više o njima!)

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

mRNA se stvara u procesu koji se zove transkripcija. Enzim nazvan RNA polimeraza putuje duž lanca DNK, donoseći komplementarne RNK građevne blokove kako bi stvorio "transkript" informacija sadržanih u DNK. Rezultirajuća molekula je RNA lanac sa misijom: prenijeti svoju poruku dijelu ćelije koji stvara proteine.

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Jednom kada se transkript kreira, mora proći nekoliko modifikacija da bi bio spreman za translaciju (proces kojim se sadržaj mRNA čita molekularnom mašinom koja se zove ribosom i prevodi u niz blokova proteina koji se nazivaju aminokiseline).

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Jennifer Cook-Chrysos/Whitehead Institute

Kako je mRNA regulisana?

Ćelije su evoluirale na nekoliko načina da regulišu koji se proteini proizvode i kada. mRNA će se prirodno razgraditi tokom vremena, a većina ima relativno kratak životni vijek: molekule mRNA u stanicama sisara mogu se zadržati od nekoliko minuta do nekoliko dana prije nego što se razgrade. Jedan od načina na koji ćelije regulišu koliko se određenog proteina proizvodi u datom trenutku je kontrola koliko dugo mRNA ostaje netaknuta. Sve dok je mRNA netaknuta, može se prevoditi iznova i iznova kako bi proizvela više proteina.

Neke mRNA traju čak hiljadu puta duže od drugih. Jedan od glavnih regulatora koliko dugo mRNA ostaju netaknute je druga vrsta RNK, nazvana miroRNA (miRNA).

Mali, ali moćni

MikroRNA su jedna od mnogih vrsta RNK koje ne kodiraju proteine. Ove sićušne RNK, koje su dugačke samo 22 građevna bloka, ne bivaju prevedene u ribosomu kao RNK za glasnike. Umjesto toga, oni ciljaju i vezuju se za sekvence u specifičnim mRNA i mogu blokirati translaciju mRNA.


Pozadina

Elongacija translacije je ključni proces kroz koji se genetske informacije u transkriptu sekvencijalno dekodiraju u peptidni lanac ribozomima. Ipak, sekvenca mRNA kodirajućih regiona može sadržavati više informacija od sekvence aminokiselina [1], lokalna brzina produljenja translacije je neujednačena i fino podešena [2, 3]. Programirana varijacija u brzini elongacije može sudjelovati u regulaciji savijanja proteina [2, 4, 5], što je izazov u prenatrpanom i ljepljivom ćelijskom okruženju [6, 7]. Promjena u stopi elongacije translacije može dovesti do pogrešnog savijanja proteina [2, 5], što dalje dovodi do razvojnih abnormalnosti, neuroloških bolesti i karcinoma [8].

Uprkos važnosti translacionog elongacije, ono je uglavnom proučavano sa heterolognim reporterskim genima [9,10,11]. Snažan ribosomski signal zastoja često je bio stavljen u ove reporterske gene, 5′-izduženi ribosom se sudara sa zaustavljenim ribozomom, što dovodi do di-ribozoma (u daljem tekstu takve složene ribozome inducirane jakim ribosomskim signalom zastoja kod heterolognih reportera nazivamo di -ribozomi) ili čak tri-ribozomi. Strukturne analize su pokazale da diribozomi i triribozomi često nisu bili u stanju da nastave sa translacijom i mogu pokrenuti put kontrole kvaliteta proteina povezan sa ribosomima (RQC) [9, 12,13,14,15,16].

Znanje o uzrocima endogenih translacijskih pauza ostaje vrlo ograničeno, uglavnom zato što je detekcija translacijskih pauza tehnički izazovna u endogenim genima. Razvoj ribo-seq-a, pristupa koji sekvencira fragmente mRNA zaštićene ribozomima u rezoluciji kodona, značajno je povećao naše znanje o elongaciji translacije [17, 18]. Akumulacija otisaka ribosoma na mjestu ukazuje na sporo produžavanje translacije (tj. translacijsku pauzu) zasnovano na ovoj ideji, otkrivene su determinante sekvence elongacije translacije, kao što je upotreba sinonimnog kodona [19,20,21], pozitivno nabijeni peptidi u razvoju [ 22], i sekundarne strukture mRNA [23]. Međutim, tradicionalni ribo-sek propušta informacije o sudarima ribosoma [24, 25]. Umjesto toga, sudari ribosoma mogu se proučavati sekvenciranjem fragmenata mRNA zaštićenih dizomima, koji se odnose na endogene naslagane ribozome u ovoj studiji. Dizomi su se detektirali centrifugiranjem sa gradijentom saharoze [26] i uočeni su u neispravnim mRNA ili 3'-netranslatiranim regijama [24]. Međutim, genomski krajolik i determinante sekvence endogenih sudara ribosoma ostaju uglavnom nepoznati u kodirajućim sekvencama vjerno transkribovanih mRNA.

Posljedica endogenog translacijskog pauziranja također ostaje nejasna. Sugerirano je da translacijska elongacija može regulirati kotranslacijsko savijanje proteina [2, 4, 5, 27, 28]. Na primjer, akumulirani dokazi podržavaju da je ekspanzija CAG-a u Huntingtonovoj bolesti dovela do pogrešne translacijske pauze i time nepravilnog savijanja signalnog peptida za subćelijsku lokalizaciju Htt proteina [29]. Neoptimalni kodoni formiraju klastere tokom evolucije [30, 31], oni mogu stvoriti regione sporog prevođenja i učestvovati u savijanju proteina [32]. Međutim, mehanizmi pomoću kojih translacijske pauze reguliraju kotranslacijsko savijanje proteina ostaju nedovoljno istraženi.

U ovoj studiji, uhvatili smo otiske mRNA zaštićene sa dva naslagana ribozoma u brzom proliferaciji ćelija kvasca. Takvi podaci pružaju priliku da se otkrije translacijska dinamika koju tradicionalni ribo-sek (tj. monosome-seq) ne može otkriti. Identifikujemo karakteristike sekvence koje su povezane sa sudarima ribosoma i validiramo neke karakteristike sa reporterskim genima. Krio-elektronska mikroskopija (cryo-EM) analize pokazuju da većina sudara endogenih ribosoma formira različitu strukturu od diribozoma koji induciraju RQC. Bioinformatičkim analizama pokazujemo da se pauze ili sudari ribosoma obično dešavaju u područjima jaza između α-heliksa. Zapravo, zaustavljeni ili sudarani ribosomi su često povezani sa specifičnim pratiocima koji mogu pomoći u savijanju proteina, kao što pokazuju analize masene spektrometrije. Kao posljedica toga, peptid u nastajanju spreman je za pravilno presavijanje tokom translacije.


Eukariotska pre-mRNA prolazi kroz opsežnu obradu prije nego što bude spremna za prevođenje. Dodatni koraci uključeni u sazrijevanje eukariotske mRNA stvaraju molekul s mnogo dužim poluživotom od prokariotske mRNA. Eukariotske mRNA traju nekoliko sati, dok tipične E. coli mRNA ne traje duže od pet sekundi.

Pre-mRNA su prvo obložene proteinima koji stabiliziraju RNA, koji štite pre-mRNA od degradacije dok se obrađuje i izvozi iz jezgre. Tri najvažnija koraka pre-mRNA procesiranja su dodavanje faktora stabilizacije i signalizacije na 5′ i 3′ krajevima molekula, i uklanjanje intervenirajućih sekvenci koje ne specificiraju odgovarajuće aminokiseline. U rijetkim slučajevima, transkript mRNA se može “urediti” nakon što je transkribovan.

5′ Capping

Dok se pre-mRNA još uvijek sintetiše, a 7-metilgvanozin kap se dodaje na 5′ kraj rastućeg transkripta pomoću fosfatne veze. Ovaj dio (funkcionalna grupa) štiti mRNA u nastajanju od degradacije. Osim toga, faktori uključeni u sintezu proteina prepoznaju kapicu kako bi pomogli u pokretanju translacije ribosomima.

3′ Poly-A Tail

Kada je elongacija završena, pre-mRNA se cijepa endonukleazom između AAUAAA konsenzus sekvence i sekvence bogate GU, ostavljajući AAUAAA sekvencu na pre-mRNA. Enzim nazvan poli-A polimeraza zatim dodaje niz od otprilike 200 A ostataka, koji se naziva poli-A rep. Ova modifikacija dalje štiti pre-mRNA od degradacije i signalizira izvoz ćelijskih faktora koji su potrebni transkriptu u citoplazmu.

Pre-mRNA spajanje

Eukariotski geni se sastoje od egzoni, koji odgovaraju sekvencama koje kodiraju proteine ​​(bivšion označava da jesu expritisnut), i intervening sekvence tzv introni (intron označava njihovu intervening role), koji mogu biti uključeni u regulaciju gena, ali se uklanjaju iz pre-mRNA tokom obrade. Intronske sekvence u mRNA ne kodiraju funkcionalne proteine.

Otkriće introna bilo je iznenađenje za istraživače 1970-ih koji su očekivali da će pre-mRNA specificirati proteinske sekvence bez dalje obrade, kao što su primijetili kod prokariota. Geni viših eukariota vrlo često sadrže jedan ili više introna. Ovi regioni mogu odgovarati regulatornim sekvencama, međutim, biološki značaj postojanja mnogo introna ili veoma dugih introna u genu je nejasan. Moguće je da introni usporavaju ekspresiju gena jer je potrebno više vremena za transkripciju pre-mRNK sa puno introna. Alternativno, introni mogu biti ostaci nefunkcionalnog niza koji su ostali od fuzije drevnih gena tokom evolucije. Ovo je podržano činjenicom da odvojeni egzoni često kodiraju odvojene proteinske podjedinice ili domene. Uglavnom, sekvence introna mogu biti mutirane bez konačnog uticaja na proteinski proizvod.

Svi introni pre-mRNK moraju biti potpuno i precizno uklonjeni prije sinteze proteina. Ako proces pogreši čak i za jedan nukleotid, okvir čitanja spojenih egzona bi se pomjerio, a rezultirajući protein bi bio nefunkcionalan. Proces uklanjanja introna i ponovnog povezivanja egzona naziva se spajanje (Slika 1). Introni se uklanjaju i razgrađuju dok je pre-mRNA još uvijek u jezgru. Spajanje se dešava mehanizmom specifičnim za sekvencu koji osigurava da će introni biti uklonjeni i eksoni ponovo spojeni sa tačnošću i preciznošću jednog nukleotida. Spajanje pre-mRNA se provodi kompleksima proteina i RNA molekula koji se nazivaju spliceosomi.

Pitanje za praksu

Slika 1. Pre-mRNA spajanje uključuje precizno uklanjanje introna iz primarnog RNA transkripta. Proces spajanja kataliziraju proteinski kompleksi zvani spliceosomi koji se sastoje od proteina i RNA molekula zvanih snRNA. Spliceosomi prepoznaju sekvence na 5′ i 3′ kraju introna.

Greške u spajanju su upletene u rak i druge ljudske bolesti. Koje vrste mutacija mogu dovesti do grešaka u spajanju?

Imajte na umu da može biti prisutno više od 70 pojedinačnih introna, a svaki mora proći proces spajanja – pored 5′ zatvaranja i dodavanja poli-A repa – samo da bi se stvorila jedna translabilna mRNA molekula.

Uređivanje RNK u tripanosomima

Slika 2. Trypanosoma brucei je uzročnik bolesti spavanja kod ljudi. mRNA ovog patogena moraju biti modificirane dodavanjem nukleotida prije nego što dođe do sinteze proteina. (zasluge: modifikacija rada Torstena Ochsenreitera)

Tripanozomi su grupa protozoa koja uključuje patogen Trypanosoma brucei, što uzrokuje bolest spavanja kod ljudi (Slika 2). Tripanozomi, i gotovo svi drugi eukarioti, imaju organele zvane mitohondrije koje opskrbljuju ćeliju kemijskom energijom. Mitohondrije su organele koje izražavaju vlastitu DNK i za koje se vjeruje da su ostaci simbiotske veze između eukariota i progutanog prokariota. Mitohondrijska DNK tripanosoma pokazuje zanimljiv izuzetak od Centralne dogme: njihove pre-mRNK nemaju tačne informacije za specificiranje funkcionalnog proteina. Obično je to zato što mRNA nedostaje nekoliko U nukleotida. Ćelija izvodi dodatni korak obrade RNK koji se zove uređivanje RNK kako bi to popravila.

Drugi geni u mitohondrijskom genomu kodiraju RNA od 40 do 80 nukleotida. Jedan ili više ovih molekula stupa u interakciju putem komplementarnog uparivanja baza s nekim od nukleotida u pre-mRNA transkriptu. Međutim, vodeća RNK ima više A nukleotida nego što pre-mRNA ima U nukleotida za vezanje. U ovim regijama, RNK vodič izlazi u petlju. 3′ krajevi vodećih RNK ​​imaju dugačak poli-U rep, a ove U baze su umetnute u regione pre-mRNA transkripta na kojima se vodeće RNK nalaze u petlji. Ovaj proces je u potpunosti posredovan molekulama RNK. Odnosno, vodeće RNK – umjesto proteina – služe kao katalizatori u uređivanju RNK.

Uređivanje RNK nije samo fenomen tripanosoma. U mitohondrijima nekih biljaka, gotovo sve pre-mRNA su uređene. Uređivanje RNK također je identificirano kod sisara kao što su pacovi, zečevi, pa čak i ljudi. Šta bi mogao biti evolucijski razlog za ovaj dodatni korak u pre-mRNA procesiranju? Jedna od mogućnosti je da mitohondrije, kao ostaci drevnih prokariota, imaju jednako drevnu metodu zasnovanu na RNK za regulaciju ekspresije gena. U prilog ovoj hipotezi, izmjene napravljene na pre-mRNA razlikuju se ovisno o ćelijskim uvjetima. Iako je spekulativan, proces uređivanja RNK može biti ostatak iz praiskonskog vremena kada su molekule RNK, umjesto proteina, bile odgovorne za kataliziranje reakcija.


Otkriće senzora za sudare ribosoma

Zajednički tim iz LMB-ovog odjela za ćelijsku biologiju i strukturne studije identificirao je ćelijski faktor koji otkriva sudare ribosoma. Ribosom je molekularna mašina odgovorna za čitanje genetskog koda za proizvodnju proteina, proces poznat kao translacija. Takvi sudari između ribozoma su znak da je nešto pošlo po zlu tokom translacije, a faktor otkrivanja sudara je kritičan za pokretanje puteva za rješavanje problema. Poznato je da ako se zaustavljeni ribozomi ne razriješe efikasno kod miševa, oni razvijaju neurodegeneraciju. Stoga, novo istraživanje baca svjetlo na to kako naše tijelo prati svoje proizvodne linije za proizvodnju proteina kako bi problemi mogli biti brzo riješeni prije nego što izazovu ćelijski stres i bolest.

Svaka ćelija u našem telu sadrži milione ribozoma koji prevode RNK (mRNA), nosioce genetskog koda, u proteine, faktore koji provode većinu biohemijskih reakcija neophodnih za život. U visoko aktivnim ćelijama, većina mRNA ima između 4 do 12 ribozoma duž svoje dužine, od kojih svaki prevodi oko 6 kodona u sekundi. Zdrava ćelija se oslanja na nesmetan rad ovih montažnih linija koje proizvode proteine. Previše spori ribozomi su jedan od pokazatelja da nešto možda ne radi kako treba, tako da ćelije imaju proces koji se zove kontrola kvaliteta povezana s ribozomima (RQC) za rješavanje problema. RQC put reciklira problematične ribozome i inicira degradaciju njihove povezane mRNA i djelomično sintetiziranog proteina. Ali kako ćelije selektivno otkrivaju spore ili zaustavljene ribozome?

U ranijem radu, Szymon Juszkiewicz iz grupe Manua Hegdea u Odjelu za ćelijsku biologiju LMB-a otkrio je da je kritični faktor u RQC putu protein nazvan ZNF598. Ovaj protein vezuje ubikvitinsku oznaku na određeno mjesto na ribosomu, za koje se pokazalo da je potrebno za pokretanje RQC puta. U novoj studiji, Szymon je istražio šta ZNF598 zapravo prepoznaje, očekujući da će se vezati za zaustavljene, ali ne i aktivno prevođenje ribozoma. Neočekivano, otkrio je da se ZNF598 vezuje za ribozom koji je u zastoju samo kada se drugi ribozom sudario sa zadnjim dijelom.

Paralelno, Vish Chandrasekaran iz laboratorije Venkija Ramakrishnana u Odjelu za strukturne studije LMB-a je istraživao poliribozome, sumnjajući da bi njihova karakteristična arhitektura mogla biti prepoznata od strane ćelije u nekim okolnostima. Vish je razradio metode za izolaciju takvih sudaranih poliribozoma i odredio njihovu strukturu koristeći krio-elektronsku mikroskopiju. Struktura je pokazala da su dva sudarena ribozoma u preciznoj orijentaciji tako da je mesto vezivanja ubikvitinske oznake za ZNF598 blizu interfejsa između ribozoma. Prepoznavanjem ovog karakterističnog interfejsa, ZNF598 je u stanju da otkrije višestruke uzroke usporavanja translacije, izbegavajući sve ribozome koji se normalno prevode.

Razumijevanje načina na koji stanice otkrivaju pogrešan prijevod važno je jer je nakupljanje defektnih proteina glavni uzrok bolesti kod ljudi, posebno neurodegeneracije. Tim sada pokušava precizno shvatiti kako ZNF598 stupa u interakciju sa sudaranim ribozomima, kako se ubikvitinska oznaka pričvršćena na sudarene ribozome koristi za njihovo rastavljanje i koje su ćelijske mRNA posebno sklone problemima koji izazivaju sudare ribosoma.

Ovaj rad su podržali MRC, Wellcome Trust, Agouron institut i Louis-Jeantet fondacija.


DMCA žalba

Ako smatrate da sadržaj dostupan putem web stranice (kao što je definirano u našim Uvjetima pružanja usluge) krši jedno ili više vaših autorskih prava, obavijestite nas davanjem pisanog obavještenja (“Obavijest o kršenju”) koje sadrži dolje opisane informacije određenom agent naveden ispod. Ako Varsity Tutors preduzme mjere kao odgovor na Obavijest o kršenju, pokušat će u dobroj namjeri kontaktirati stranu koja je takav sadržaj učinila dostupnim putem najnovije adrese e-pošte, ako postoji, koju je ta strana dala Varsity Tutors.

Vaše Obavještenje o kršenju može se proslijediti strani koja je sadržaj učinila dostupnim ili trećim stranama kao što je ChillingEffects.org.

Imajte na umu da ćete biti odgovorni za štetu (uključujući troškove i advokatske honorare) ako materijalno lažno predstavite da proizvod ili aktivnost krše vaša autorska prava. Stoga, ako niste sigurni da sadržaj koji se nalazi na web-mjestu ili je povezan s njim krši vaša autorska prava, trebali biste prvo razmisliti o tome da kontaktirate advokata.

Molimo slijedite ove korake da podnesete obavještenje:

Morate uključiti sljedeće:

Fizički ili elektronski potpis vlasnika autorskih prava ili osobe ovlaštene da djeluje u njihovo ime Identifikacija autorskih prava za koje se tvrdi da su prekršena Opis prirode i tačne lokacije sadržaja za koji tvrdite da krši vaša autorska prava, u dovoljno pojedinosti koje omogućavaju Varsity Tutorima da pronađu i pozitivno identifikuju taj sadržaj, na primjer, potrebna nam je veza do određenog pitanja (ne samo naziv pitanja) koja sadrži sadržaj i opis kojeg konkretnog dijela pitanja – sliku, link, tekst itd. – Vaša žalba se odnosi na Vaše ime, adresu, broj telefona i e-mail adresu i Vašu izjavu: (a) da vjerujete u dobroj vjeri da je korištenje sadržaja za koje tvrdite da krši Vaša autorska prava nije ovlašten zakonom, ili od strane vlasnika autorskih prava ili agenta takvog vlasnika (b) da su sve informacije sadržane u Vašem Obavještenju o kršenju tačne, i (c) pod kaznenom kaznom za krivokletstvo, da ste ili vlasnik autorskih prava ili osoba ovlaštena da djeluje u njihovo ime.

Pošaljite svoju žalbu našem ovlaštenom agentu na:

Charles Cohn Varsity Tutors LLC
101 S. Hanley Rd, apartman 300
St. Louis, MO 63105


Uvod

Lokalizacija mRNA unutar ćelija funkcioniše tako da prostorno ograničava ekspresiju gena, što je kritično za određivanje sudbine ćelije i pravilno oblikovanje tela tokom embriogeneze (St. Johnston, 2005). Lokalizirana translacija mRNA također je važna za mnoge procese u diferenciranim somatskim stanicama (Kislauskis et al., 1997 Adereth et al., 2005 Huttelmaier et al., 2005) i intenzivno se koristi u neuronskim stanicama kako bi se ograničila ekspresija specifičnih proteina na sinapse ( Kiebler i Bassell, 2006). U Xenopus laevis i Drosophila melanogaster, mRNA koje kodiraju proteine ​​uključene u mitotičku progresiju su obogaćene na mitotičkom vretenu (Raff et al., 1990. Groisman et al., 2000.). Nadalje, citološke i biohemijske studije X. laevis vretena ekstrakta jaja i mikrotubule morskog ježa su pokazale da su ribozomi usko povezani sa mitotičkim mikrotubulama, što sugeriše da bi lokalizovani prevod mogao biti ključni regulator mitoze (Suprenant, 1993. Liska et al., 2004. Mitchison et al., 2004.). Međutim, opseg ciljanja mRNA na specifične subcelularne strukture, kao što je vreteno, nije sveobuhvatno istražen i njegovi osnovni mehanizmi i funkcije su slabo shvaćeni.

Da bismo stekli uvid u ulogu lokaliziranih mRNA tokom mitoze, sveobuhvatno smo identificirali mRNA koje se lokaliziraju na mikrotubulama u mejotičkom X. laevis ekstrakti jaja i ekstrakti mitotičkih ljudskih ćelija koristeći Affymetrix mikromreže. Otkrili smo da je specifična i očuvana grupa mRNA, nazvana mRNA vezana za mikrotubule (MT-mRNA), obogaćena mikrotubulama. Uočili smo da je samo podskup MT-mRNA povezan s poliribozomima vezanim za mikrotubule, što ukazuje da mitotička vretena sadrže i translacijsko aktivne i neaktivne mRNA. Nadalje, otkrili smo da aktivna translacija nije potrebna za ciljanje endogenih ili egzogenih mRNA na mitotičke mikrotubule. Predlažemo da je lokalizacija specifičnih mRNA na vretenu konzervirani mehanizam za poboljšanje lokalizacije proteina i za segregaciju translacijsko neaktivnih mRNA.


Ribosom

Brzi pogled:
Ribosom funkcionira kao mikro-mašina za proizvodnju proteina. Ribosomi se sastoje od posebnih proteina i nukleinskih kiselina. PREVOD informacija i povezivanje aminokiselina su u srcu procesa proizvodnje proteina.
Ribosom, formiran od dvije podjedinice koje su zaključane zajedno, funkcionira za: (1) prevođenje kodiranih informacija iz ćelijskog jezgra koje daje ribonukleinska kiselina (mRNA), (2) povezivanje aminokiselina odabranih i prikupljenih iz citoplazme prijenosom ribonukleinske kiseline ( tRNA). (Red u kojem su aminokiseline povezane zajedno određen je mRNA) i, (3) Izvezite proizvedeni polipeptid u citoplazmu gdje će formirati funkcionalni protein.

Ribosomi se nalaze ‘slobodni’ u citoplazmi ili su vezani za endoplazmatski retikulum (ER) kako bi formirali grubi ER. U ćeliji sisara može biti i do 10 miliona ribozoma. Nekoliko ribozoma može biti vezano za isti mRNA lanac, ova struktura se naziva polizom. Ribosomi imaju samo privremeno postojanje. Kada sintetiziraju polipeptid, dvije podjedinice se razdvajaju i ili se ponovo koriste ili razbijaju.

Ribosomi mogu spojiti aminokiseline brzinom od 200 u minuti. Mali proteini se stoga mogu napraviti prilično brzo, ali dva do tri sata su potrebna za veće proteine ​​kao što je masivni mišićni protein titin od 30.000 aminokiselina.

Ribosomi u prokariotima koriste malo drugačiji proces za proizvodnju proteina od ribosoma u eukariota. Na sreću, ova razlika predstavlja prozor molekularne mogućnosti za napad antibiotskim lijekovima kao što je streptomicin. Nažalost, neki bakterijski toksini i polio virus također ga koriste kako bi im omogućili da napadnu mehanizam translacije.

Za pregledni dijagram proizvodnje proteina kliknite ovdje.
(Diagram će se otvoriti u posebnom prozoru)

Ovo je slika elektronskog mikroskopa koja prikazuje dio grubog endoplazmatskog retikuluma u ćeliji korijena biljke iz kukuruza. Tamne mrlje su ribozomi.

(ljubaznošću Chrisa Hawesa, The Research School of Biology & Molecular Sciences, Oxford Brookes University, Oxford, UK)

DUŽI POGLED na ribosome:

Ribosomi su makromolekularne proizvodne jedinice. Sastoje se od ribosomskih proteina (riboproteina) i ribonukleinskih kiselina (ribonukleoproteina). Riječ ribozom nastaje uzimanjem 'ribo' od ribonukleinske kiseline i dodavanjem u 'soma’, latinska riječ za tijelo. Ribozomi mogu biti vezani membranom(ama), ali nisu membranski.

Ribosom: mikro-mašina za proizvodnju proteina
Ribosom je u osnovi vrlo komplicirana, ali elegantna mikro-mašina za proizvodnju proteina. Svaki kompletan ribosom je konstruisan od dve podjedinice. Eukariotski ribosom se sastoji od nukleinskih kiselina i oko 80 proteina i ima molekulsku masu od oko 4.200.000 Da. Otprilike dvije trećine ove mase sastoji se od ribosomske RNK i jednu trećinu od oko 50+ različitih ribosomalnih proteina.

Ribosomi se nalaze u prokariotskim i eukariotskim stanicama u mitohondrijima, hloroplastima i bakterijama. Oni koji se nalaze u prokariotima općenito su manji od onih u eukariota. Ribosomi u mitohondrijima i hloroplastima su po veličini slični onima u bakterijama. Postoji oko 10 milijardi proteinskih molekula u stanici sisara, a ribosomi proizvode većinu njih. Brzo rastuća stanica sisara može sadržavati oko 10 miliona ribozoma. [Jedna ćelija E. Coli sadrži oko 20.000 ribozoma i to čini oko 25% ukupne mase ćelije].

Proteini i nukleinske kiseline koje formiraju podjedinice ribosoma nastaju u nukleolu i izvoze se kroz nuklearne pore u citoplazmu. Dvije podjedinice su nejednake veličine i postoje u ovom stanju dok se ne zatraže za upotrebu. Veća podjedinica je otprilike dvostruko veća od manje.

Veća podjedinica ima uglavnom katalitičku funkciju, a manja podjedinica uglavnom dekodirnu. U velikoj podjedinici ribosomska RNA obavlja funkciju enzima i naziva se ribozim. Manja jedinica se povezuje sa mRNA, a zatim se spaja na veću podjedinicu. Jednom formirani ribosomi nisu statične jedinice. Kada se završi proizvodnja određenog proteina, dvije podjedinice se razdvajaju i tada se obično razgrađuju. Ribosomi imaju samo privremeno postojanje.

Ponekad podjedinice ribosoma prihvataju mRNA čim mRNA izađe iz jezgra. Kada mnogi ribozomi to rade, struktura se naziva polizom. Ribosomi mogu funkcionirati u "slobodnom" stanju u citoplazmi, ali se također mogu "naseliti" na endoplazmatski retikulum i formirati "grubi endoplazmatski retikulum". Tamo gdje postoji grubi endoplazmatski retikulum, veza između ribosoma i endoplazmatskog retikuluma (ER) olakšava daljnju obradu i provjeru novonastalih proteina od strane ER.

Fabrika proteina: lokacija i usluge.

Svim fabrikama su potrebne usluge kao što su gas, voda, odvodnja i komunikacije. Da bi se to omogućilo mora postojati lokacija ili mjesto.

Za proizvodnju proteina su također potrebni servisni zahtjevi. Mjesto koje zahtijeva pružanje usluga nastaje u maloj podjedinici ribosoma kada lanac mRNA uđe kroz jedan selektivni rascjep, a lanac inicijatorske tRNA kroz drugi. Ova radnja pokreće malu podjedinicu da se pričvrsti za veliku podjedinicu ribosoma kako bi formirala potpun i aktivan ribosom. Zadivljujući proces proizvodnje proteina sada može početi.

Za odvijanje translacije i sinteze proteina uključene su mnoge inicijatorske i otpuštajuće kemikalije, a odvijaju se i mnoge reakcije pomoću enzima. Međutim, postoje opšti zahtjevi i oni moraju biti zadovoljeni. Lista u nastavku prikazuje glavne zahtjeve i način na koji se oni pružaju:

  • Zahtjev: Siguran (bez kontaminacije) i pogodan objekat za proces proizvodnje proteina.
  • odredba: ovu mogućnost pružaju dvije ribosomske podjedinice. Kada se dvije podjedinice spoje zajedno kako bi formirale kompletan ribosom, molekuli koji ulaze i izlaze mogu to učiniti samo kroz selektivne pukotine ili tunele u molekularnoj strukturi.
  • Zahtjev: Dostava informacija u obliku koji ribosom može prevesti sa visokim stepenom tačnosti. Prijevod mora biti tačan kako bi se proizveli ispravni proteini.
  • odredba: Informacije se dostavljaju iz jezgra i dostavljaju ribosomu u obliku lanca mRNA. Kada se mRNA formira u jezgri, introni (nekodirajući dijelovi) se izrezuju, a egzoni (kodirajući dijelovi) se spajaju procesom koji se naziva spajanje.
  • Zahtjev: Zalihe aminokiselina iz kojih ribosomski mehanizam može dobiti specifične potrebne aminokiseline.
  • odredba: Aminokiseline, koje se uglavnom unose iz hrane, normalno su slobodno dostupne u citoplazmi.
  • Zahtjev: Sistem koji može odabrati i zaključati aminokiselinu u citoplazmi i dostaviti je na mjesto translacije i sinteze u ribosomu.
  • odredba: Kratki lanci transferne ribonukleinske kiseline (tRNA) napravljeni u jezgri i dostupni u citoplazmi djeluju kao „adapterski alati”. Kada se lanac tRNA zakači za aminokiselinu, kaže se da je tRNA 'nabijena'. tRNA difundira u manju podjedinicu ribosoma i svaki kratki lanac tRNA će isporučiti JEDAN amino kiseline.
  • Zahtjev: Sredstva za otpuštanje u citoplazmu: (a) novoformirani polipeptid, (b) mRNA koja je korištena u procesu prevođenja, i (c) tRNA koja je isporučila aminokiselinu koju je nosila i sada je 'nenabijena'.
  • Odredba: (a) kada se novoformirani peptidni lanac proizvodi duboko unutar velike podjedinice ribosoma, on se usmjerava prema citoplazmi duž tunela ili pukotina. (b) 'Upotrebljena' mRNA napušta manju podjedinicu ribosoma kroz tunel na strani suprotnoj od točke njenog ulaska. Kretanje kroz ribozom je uzrokovano samo jednosmjernim, povremenim kretanjem ribozoma duž i u smjeru dolaznog lanca mRNA. (c) tRNA u 'nenabijenom' stanju odlazi kroz tunel u molekularnoj arhitekturi velike podjedinice ribosoma.

The Protein Factory: What happens on the inside?
– A look at the protein production line that can join up amino acids at a rate of 200 per minute!

Now we have considered the requirements and provisions needed for the protein production machine to operate, we can look at the inner workings.

As mentioned earlier many detailed biochemical reactions take place in the ribosome and only a brief outline is given here to illustrate the concept.
(Please also see ‘schematic of ribosome’ at end of section)

In the ribosome there are THREE STAGES and THREE operational SITES involved in the protein production line.

Trojica STAGES are (1) Initiation, (2) Elongation and (3) Termination.

The three operational or binding SITES su A, P i E reading from the mRNA entry site (conventionally the right hand side).

Sites A i P span both the ribosome sub-units with a larger part residing in the ribosome large sub-unit, and a smaller part in the smaller sub-unit. Site E, the exit site, resides in the large ribosome sub-unit.

Table of binding sites, positions and functions in a ribosome
(please also see schematic of ribosome at end of section)

Binding Site

mRNA strand entry site

Biological term

Main processes

Admission of codon of mRNA & ‘charged’ strand of tRNA. Checking and decoding and start of ‘handing over’ one amino acid molecule

Peptide synthesis, consolidation, elongation and transfer of peptide chain to site A

Site E

Preparation of ‘uncharged’ tRNA for exit

The Three stages:

  1. Iniciranje. During this stage a small ribosome sub-unit links onto the ‘start end’ of an mRNA strand. ‘Initiator tRNA’ also enters the small sub-unit. This complex then joins onto a ribosome large sub-unit. At the beginning of the mRNA strand there is a ‘start translating’ message and a strand of tRNA ‘charged’ with one specific amino acid, enters site A of the ribosome. Production of a polypeptide has now been initiated.For the tRNA not to be rejected the three letter code group it carries (called an anti-codon) must match up with the three letter code group (called a codon) on the strand of mRNA already in the ribosome. This is a very important part of the prevod process and it is surprising how few ‘errors of translation’ occur. [In general the particular amino acid it carries is determined by the three letter anticodon it bears, e.g. if the three letter code is CAG (Cytosine, Adenine, Guanine) then it will select and transport the amino acid Glutamine (Gln)].
  1. Elongation.This term covers the period between initiation and termination and it is during this time that the main part of the designated protein is made. The process consists of a series of cycles, the total number of which is determined by the mRNA. One of the main events during elongation is translocation. This is when the ribosome moves along the mRNA by one codon notch and a new cycle starts.During the ‘start-up’ process the ‘initiation tRNA’ will have moved to site P (see schematic of ribosome at end of section) and the ribosome will have admitted into site A, a new tRNA ‘charged’ with one amino acid.The ‘charged’ tRNA resides in site A until it has been checked and accepted (or rejected) and until the growing peptide chain attached to the tRNA in site P, has been transferred across by enzymes, to the ‘charged’ tRNA in site A. Here one new amino acid is donated by the tRNA and added to the peptide chain. By this process the peptide chain is increased in length by increments of one amino acid. [The peptide bond formation between the growing peptide chain and the newly admitted amino acid is assisted by peptidyl transferase and takes place in the large ribosome sub-unit. The reaction occurs between tRNA that carries the nascent peptide chain, peptidyl-tRNA and the tRNA that carries the incoming amino acid, the aminoacyl-tRNA]. When this has taken place the tRNA in site P, having transferred its peptide chain, and now without any attachments, is moved to site E the exit site.Next, the tRNA in site A, complete with a peptide chain increased in length by one amino acid, moves to site P. U site P riboproteins act to consolidate the bonding of the peptide chain to the newly added amino acid. If the peptide chain is long the oldest part will be moved out into the cytoplasm to be followed by the rest of the chain as it is produced.The next cycle
    With site A now empty translokacija odvija. The ribosome moves on by a distance of one (three letter) codon notch along the mRNA to bring a new codon into the processing area. tRNA ‘charged’ with an attached amino acid now enters site A, and provided a satisfactory match of the mRNA codon and tRNA anti-codon is made, the cycle starts again. This process continues until a termination stage is reached.
  2. Termination. When the ribosome reaches the end of the mRNA strand, a terminal or ‘end of protein code’ message is flagged up. This registers the end of production for the particular protein coded for by this strand of mRNA. ‘Release factor’ chemicals prevent any more amino acid additions, and the new protein (polypeptide) is completely moved out into the cytoplasm through a cleft in the large sub-unit. The two ribosome sub-units disengage, separate and are re-used or broken down.

  • Nearly all the proteins required by cells are synthesised by ribosomes. Ribosomes are found ‘free’ in the cell cytoplasm and also attached to rough endoplasmic reticulum.
  • Ribosomes receive information from the cell nucleus and construction materials from the cytoplasm.
  • Ribosomi translate information encoded in messenger ribonucleic acid (mRNA).
  • Oni link together specific amino acids to form polypeptides and they export these to the cytoplasm.
  • A mammalian cell may contain as many as 10 million ribosomes, but each ribosome has only a temporary existence.
  • Ribosomes can link up amino acids at a rate of 200 per minute.
  • Ribosomes are formed from the locking of a small sub-unit on to a large sub-unit. The sub-units are normally available in the cytoplasm, the larger one being about twice the size of the smaller one.
  • Each ribosome is a complex of ribonucleoproteins with two-thirds of its mass is composed of ribosomal RNA and about one-third ribosomal protein.
  • Protein production takes place in three stages: (1) initiation, (2) elongation, and (3) termination.
  • During peptide production the ribosome moves along the mRNA in an intermittent process called translocation.
  • Antibiotic drugs such as streptomycin can be used to attack the translation mechanism in prokaryotes. This is very useful. Unfortunately some bacterial toxins and viruses can also do this.
  • After they leave the ribosome most proteins are folded or modified in some way. This is called ‘post translational modification’.

An overview diagram of protein production, including a note about protein modification.


Neuroendocrinology: The Normal Neuroendocrine System

Vladimir Stanišić , . Bert W. O’Malley , in Progress in Brain Research , 2010

Regulation of steroid hormone receptor availability by modulation of steroid receptor mRNA stability and translation

Regulation of steroid receptor mRNA stability and translation occurs primarily through binding of specific mRNA-binding proteins or micro-RNAs (miRNA) to 3′UTR regulatory elements. Two regulatory elements are most prominent, AU-rich elements (AREs) and C-rich elements. AREs containing multiple copies of a 5′-AUUUA-3′ motif destabilize mRNAs, while C-rich elements are recognized and differentially regulated by poly(C)-binding proteins. The miRNAs are a class of regulatory modalities that interact with specific complementary sequences present in the 3′ UTR region of the receptor’s mRNA. All steroid hormone receptors contain an unusually long 3′UTR and a large number of ARE sequences in the 3′UTR, and allow steroid hormones to auto-regulate the mRNA expression levels of their cognate receptors ( Ing, 2005 ).

The ERα mRNA is 4.3 kb long and has a steady-state half-life of approximately five hours ( Fig. 4 ). The mRNA contains an extensive 3′ UTR which is three times as long as its open reading frame. The ERα 3′UTR is known to contain several regulatory elements including 14 putative class I AREs ( Green et al., 1986 Keaveney et al., 1993 Kenealy et al., 2000 ), but its stability can be altered in response to different stimuli ( Kenealy et al., 2000 ). Proteins such as AUFp45 bind ERα mRNA and increase its stability by protecting it from RNases ( Ing et al., 2008 ). Recently, several miRNAs – miR18a, miR22, miR206 and miR221/222 – have been shown to bind and negatively affect ERα mRNA stability and/or translation ( Adams et al., 2007 Liu et al., 2009 Pandey and Picard, 2009 Zhao et al., 2008b ). Functionally, the expression of miRNAs leads to a decrease in the cellular receptor pool and subsequently to attenuated cellular responses to estrogen stimulation.

Androgen receptor mRNA spans 7 kbs and is extensively regulated post-transcriptionally ( Waltering et al., 2006b ). Towards the 5′ end of the AR 3′UTR, the RNA-binding protein HuR binds and stabilizes mRNA by interacting with AREs. HuR belongs to the Elav/Hu family of RNA-binding proteins, which in addition to being a regulator of mRNA stability also has a function in shuttling AR mRNA from the nucleus to the cytoplasm. Two proteins bind the C-rich elements in the AR mRNA-CP1 and -CP2 both affect AR mRNA stability and the rate of translation ( Wilce et al., 2002 ). Recently, a new regulator of AR mRNA translation, hnRNP-K, has been identified in prostate cancer cells. The hnRNP-K can bind to both the 5′ and 3′ UTR regions as well as the coding region of the AR mRNA to inhibit its translation ( Mukhopadhyay et al., 2009 ). Overall, androgens and progestins generally increase the stability of AR and PR mRNA in prostate and endometrial cancers, respectively ( Ing, 2005 ).

Human GR mRNA contains numerous ARE elements and is subject to post-transcriptional regulation ( Schaaf and Cidlowski, 2002 ). In addition to its regulation by a protein binding to an ARE element in the GR 3′UTR, GR mRNA is also negatively regulated by two miRNAs – miR18 and miR124a. Interestingly, while miR18 is broadly expressed in many tissues, miR124a is exclusively expressed in the brain, suggesting a probable tissue-specific regulatory requirement for controlling GR mRNA expression in the nervous system ( Vreugdenhil et al., 2009 ). Generally, glucocorticoids tend to decrease the stability of GR mRNA in the kidney, liver and colon cells ( Ing, 2005 ).


Engineering RBS issues

Efficiency

Different RBSs bind ribosomes with different efficiencies. While the overall efficiency of translation may not be directly proportional to this RBS-binding efficiency, it is an important variable. In the future, we expect that this data book will have a table such as the following:

Standard BioBrick Ribosome Binding Sites

Part Number Binding Efficiency Sequence
BBa_B0030 0.6 att aaa gag gag aaa
BBa_B0031 0.07 tca cac agg aaa cc
BBa_B0032 0.3 tca cac agg aaa g


A BioBrick engineer, armed with this table, could perform a first-order re-engineering of the transfer function by measuring a component with BBa_B0031 and then selecting a more appropriate RBS.

In order to allow for easy variation in the RBS, some BioBrick parts have their RBSs and their protein coding regions implemented as separate parts. For convenience, the combined, normalized part is also available. In order to divide the BioBrick part into its RBS and coding region, a set of BioBrick restriction sites must be designed.

Standard Assembly and the RBS

The RBS is physically near the start codon. (In BioBricks, this will always be ATG.) The "sequence logo", similar to a consensus sequence, for the RBS is shown below. The size of each letter is proportional to the frequency of that base in the RBS part.

This figure shows the RBS as an A/G-rich region about 10 bases upstream of the start codon. This leaves little room for a BioBrick restriction enzyme site. The standard assembly method of BioBricks normally results in an 8-base region containing a 6-base mixed SpeI/XbaI restriction site surrounded by a base on each end as shown below. If a start codon followed this sequence, the RBS would be significantly disturbed.

This problem is solved by changing the rightmost base from a G to a T. This results in the sequence shown below and limits the impact of the BioBrick overhead to six bases.


Pogledajte video: Eukaryotic Translation Protein Synthesis, Animation. (Decembar 2022).