Informacije

8.4: Geni i hromatin kod eukariota - Biologija

8.4: Geni i hromatin kod eukariota - Biologija


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kromosomi i kromatin su jedinstvena eukariotska povezanost DNK s više ili manje proteina. Bakterijska DNK (i općenito prokariotska DNK) je relativno 'gola' - nije vidljivo povezana s proteinima.

Elektronski mikrograf an međufaza ćelija (ispod) otkriva da sam kromatin može postojati u različitim stanjima kondenzacije.

Kromatin se maksimalno kondenzira tokom mitoze, formirajući hromozome. Tokom interfaze, hromatin postoji u više ili manje kondenzovanim oblicima, tzv Heterohromatin i euhromatin respektivno. Prijelaz između ovih oblika kromatina uključuje promjene u količinama i tipovima proteina vezanih za kromatin, a to se može dogoditi tokom regulacije gena, odnosno kada se geni uključe ili isključuju. Aktivni geni imaju tendenciju da budu u raspršenijem euhromatinu, tako da enzimi replikacije i transkripcije imaju lakši pristup DNK. Geni koji su neaktivni u transkripciji su heterokromatski, zaklonjeni dodatnim hromatinskim proteinima prisutnim u heterohromatinu. Pogledat ćemo neke eksperimente koji to pokazuju u kasnijem poglavlju.

Možemo definisati tri nivoa organizacije hromatina uopšteno:

1. Nastaje DNK omotana oko histonskih proteina nukleozomi u strukturi "perle na špagi".

2. Višestruki nukleozomi se namotaju (kondenzuju), formirajući 30 nm vlaknaste (solenoidne) strukture.

3. Pakovanje višeg reda 30 nm vlakna dovodi do formiranja metafaznih hromozoma koji se vide u mitozi i mejozi.

Nivoi strukture hromatina određivani su dijelom selektivnom izolacijom i ekstrakcijom interfaznog ćelijskog hromatina, nakon čega je uslijedila selektivna kemijska ekstrakcija komponenti hromatina. Koraci su:

· Nukleusi se prvo izoluju iz ćelija.

· Nuklearni omotač je lagano puknuo kako se ne bi fizički poremetila struktura hromatina.

· hromatin se može nežno ekstrahovati jednim od nekoliko različitih hemijskih tretmana (visoka soli, malo soli, kiselina...).

Nivoi strukture hromatina su ilustrovani u nastavku.

Ekstrakcija soli odvaja većinu proteina iz hromatina. Kada se ekstrakt s malo soli centrifugira i pelet resuspendira, preostali kromatin izgleda kao perle na kanapu. DNK umotan nukleozomi su perle, koje su zauzvrat povezane ujednačenim dužinama metaforičke DNK "nize" ( # 1 na gornjoj ilustraciji). Ekstrakt hromatina sa visokim sadržajem soli pojavljuje se kao zavojnica nukleozoma, ili 30 nm solenoidno vlakno (# 2 gore). Drugi protokoli ekstrakcije otkrili su druge aspekte strukture hromatina prikazane u #s 3 i 4 gore. Kromosomi koji se vide u metafazi mitoze su 'najvišeg reda', najkondenziraniji oblik kromatina.

Filament od 10 nm nukleosoma „perle na niti“ koji preostaje nakon niske ekstrakcije soli može se vidjeti u elektronskom mikroskopu kao što je prikazano u nastavku.

Kada su ove nukleosomske ogrlice bile digestirane sa enzimom deoksiribonukleaza (DNAse), DNK između 'zrnaca' je degradiran, ostavljajući za sobom skraćene 10nm filamente nakon kratkog perioda digestije, ili samo pojedinačne kuglice nakon dužeg varenja (ispod).

Roger Kornberg (sin nobelovca Arthura Kornberga koji je otkrio prvi enzim replikacije DNK polimeraze) sudjelovao je u otkrivanju i karakterizaciji nukleozoma dok je još bio postdoktor! Otkrivena je elektroforeza DNK ekstrahovane iz ovih digestora nukleozomi razdvojeni "linkerom" DNK od oko 80 parova baza. DNK ekstrahovan iz nukleozoma bio je dugačak oko 147 parova baza. Ovo je DNK koja je bila omotana oko proteina nukleozoma.

172 Nukleozomi-DNK i proteini

Nakon odvajanja svih proteina iz nukleosomske DNK, identifikovano je pet proteina (ilustrovano ispod).

Histoni su osnovni proteini koji sadrže mnogo lizin i arginin amino kiseline. Njihovi pozitivno nabijeni bočni lanci omogućavaju ovim aminokiselinama da vežu kisele, negativno nabijene fosfodiesterska kičma dvostruke spiralne DNK. DNK se obavija oko oktamera histona (po 2 od 4 histonska proteina) kako bi formirala nukleosoma. Otprilike jedan gram histona je povezan sa svakim gramom DNK. Nakon ekstrakcije hromatina visoke soli, struktura vidljiva u elektronskom mikroskopu je 30nm solenoid, zavojnica nukleozoma modelirana na slici ispod.

Kao što je gore prikazano, jednostavno povećanje koncentracije soli već ekstrahiranog nukleosomskog preparata će uzrokovati da se 'ogrlica' savija u 30nm solenoidnu strukturu.

173 Struktura hromatina: seciranje hromatina

Kao što možete pretpostaviti, kisela ekstrakcija hromatina bi trebala selektivno ukloniti osnovne histonske proteine, ostavljajući iza sebe povezanost DNK sa nehistonskim proteinima. Pokazalo se da je to bio slučaj. Elektronski mikrograf ostatka hromatina nakon kisele ekstrakcije metafaznih kromosoma prikazan je na sljedećoj stranici.

DNK oslobođena pravilno raspoređenih nukleozoma baziranih na histonima, izlazi u petlju, dalje od duge ose hromatina. Tamni materijal duž ove ose je proteinska skela koja čini ono što je ostalo nakon ekstrakcije histona. Veliki dio ovog proteina jeste topoizomeraza, enzim koji sprečava da se DNK raspadne pod pritiskom replikacije.

174 Histoni i nehistonski proteini


8.4: Geni i hromatin kod eukariota - Biologija

Za gledanje ovog sadržaja potrebna je pretplata na J o VE. Moći ćete vidjeti samo prvih 20 sekundi.

JoVE video plejer je kompatibilan sa HTML5 i Adobe Flashom. Stariji pretraživači koji ne podržavaju HTML5 i H.264 video kodek i dalje će koristiti Flash-bazirani video plejer. Preporučujemo preuzimanje najnovije verzije Flasha ovdje, ali podržavamo sve verzije 10 i novije.

Ako to ne pomogne, javite nam.

Ekspresija gena je regulirana na više nivoa, počevši od inicijacije transkripcije i krećući se sve do prevođenja zrele mRNA u funkcionalni protein. 

Međutim, nisu svi enzimi potrebni za ekspresiju i regulaciju gena jednako raspoređeni u jezgru. Umjesto toga, oni su ograničeni na prostorno definirana žarišta.  Ovo rezultira nepreklapanjem "teritorija" u jezgru, sa specifičnom biohemijskom aktivnošću. 

Na primjer, geni koji kodiraju ribosomalnu RNK prisutni na hromozomima 13,14,15, 21 i 22, također poznati kao regioni nukleolarnog organizatora, grupirani su u nukleolusu - mjestu formiranja ribozoma ćelije. 

To znači da se kromatin može repozicionirati u takve funkcionalno različite žarišta za koordiniranu ekspresiju i regulaciju gena. 

Međutim, kromatin se također može proširiti izvan svoje teritorije, formirajući produženu petlju koja može promijeniti obrazac ekspresije gena.

Na primjer, ljudski gen CFTR nalazi se na periferiji jezgre u stanicama gdje je tih. Međutim, u ćelijama u kojima je gen eksprimiran, kromatin koji sadrži ovu regiju se repozicionira prema unutrašnjosti.

Većina eukariotskih ćelija ima višestruka hromatinska vlakna sa različitom dužinom i omjerom zbijanja. Stoga, pozicioniranje kromatina također ovisi o fizičkim ograničenjima njegovog pakiranja unutar jezgre. 

U ćelijama sa sfernim jezgrima kao što su limfociti, kromatin je radijalno pozicioniran s aktivno eksprimiranim genima prema unutrašnjosti i potisnutim genima na periferiji. 

U ćelijama sa nesferičnim jezgrima, kao što su fibroblasti, kraća hromatinska vlakna imaju tendenciju da zauzmu unutrašnji položaj, dok su duža hromatinska vlakna pozicionirana na periferiji jezgra.

Repozicija hromatina je takođe povezana sa različitim tipovima karcinoma, gde izmenjeni obrasci ekspresije gena usled repozicije hromatina mogu dovesti do formiranja tumora. Na primjer, repozicioniranje hromozoma 18 s periferije jezgre u unutrašnjost uočeno je u razvoju karcinoma grlića materice i debelog crijeva.

5.19: Položaj hromatina utječe na ekspresiju gena

Hromatin je masivni kompleks DNK i proteina upakovanih unutar jezgra. Složenost savijanja hromatina i način na koji je upakovan u jezgru uveliko utiče na pristup genetskim informacijama. Općenito, periferija jezgra se smatra transkripcijski represivnom, dok se unutrašnjost ćelije smatra transkripcijski aktivnom površinom. 

Topološki pridruženi domeni (TAD)

3-dimenzionalno pozicioniranje hromatina u jezgru utiče na tajming i nivo ekspresije gena kod eukariota. Na primjer, promotori gena su organizirani fizički odvojeno od njihovih regulatornih DNK elemenata, kao što su pojačivači. Ovi promotor-pojačivači elementi moraju biti spojeni kako bi se izvršila ekspresija gena. Svaka hromatida se sastoji od nekoliko takvih jedinica koje međusobno djeluju, koje se nazivaju topološki povezani domeni (TAD). U nekim slučajevima, TAD-ovi iz dvije hromatide također mogu međusobno komunicirati.

hromozomske teritorije (CT)

Nekoliko TAD-ova se akumulira da formiraju hromozomske teritorije (CT). Ovi prostorni rasporedi i distribucije čine jezgro heterogenim tijelom s različitim biohemijskim aktivnostima. Pozicioniranje gena unutar CT-a i samo pozicioniranje CT-ova utiče na ekspresiju gena. Kod ljudi, aktivno transkribovani geni imaju tendenciju da se lokalizuju prema periferiji njihovog CT-a. Nekodirajući geni imaju tendenciju da se lokaliziraju prema svojoj unutrašnjosti CT-a. Na primjer, u jezgri ljudskih ćelija amnionske tekućine, ANT2 gen se nalazi na neaktivnom X hromozomu. Kada je ANT2 gen lokaliziran prema periferiji CT-a, to rezultira njegovom aktivnom transkripcijom.

Hromatini se dinamički repozicioniraju unutar jezgre. Čak i terminalno diferencirane ćelije koje se više ne mogu dijeliti pokazuju kromatin ili repoziciju gena. To znači da repozicioniranje nije slučajan događaj već koordiniran molekularni mehanizam.


30 nanometarska vlakna

Nukleosomska organizacija DNK u hromozomima ne može u potpunosti objasniti stepen zbijenosti neophodan da bi se uklopio genom u kompaktno jezgro. Priroda ovih dodatnih nivoa savijanja DNK je kontroverzna, ali se vjeruje da uključuje namotavanje nizova nukleosoma kako bi se formirao solenoidalni struktura. Takvi solenoidi su vizualizirani u elektronu


Sadržaj

Postoji pet glavnih porodica histona: H1/H5, H2A, H2B, H3 i H4. [2] [4] [5] [6] Histoni H2A, H2B, H3 i H4 su poznati kao histoni jezgra, dok su histoni H1/H5 poznati kao histoni linkera.

Svi osnovni histoni postoje kao dimeri, koji su slični po tome što svi posjeduju domen histonskog nabora: tri alfa spirale povezane s dvije petlje. Upravo ova spiralna struktura omogućava interakciju između različitih dimera, posebno u obliku glave i repa (koji se naziva i motiv rukovanja). [7] Rezultirajuća četiri različita dimera se zatim spajaju i formiraju jedno oktamerno jezgro nukleosoma, otprilike 63 Angstroma u prečniku (čestica nalik solenoidu (DNK). Oko 146 parova baza (bp) DNK omota se oko ove čestice jezgra 1,65 puta u lijevom super-helikalnom okretu dajući česticu prečnika oko 100 Angstroma. [8] Linker histon H1 vezuje nukleozom na ulaznim i izlaznim mestima DNK, zaključavajući DNK na mesto [9] i omogućavajući formiranje strukture višeg reda. Najosnovnija takva formacija je 10 nm vlakno ili perle na konformaciji žice. Ovo uključuje omotavanje DNK oko nukleozoma sa otprilike 50 parova baza DNK koji razdvaja svaki par nukleozoma (također se naziva linker DNK). Strukture višeg reda uključuju vlakna od 30 nm (formiraju nepravilan cik-cak) i 100 nm vlakna, a to su strukture koje se nalaze u normalnim ćelijama. Tokom mitoze i mejoze, kondenzirani hromozomi se sastavljaju kroz interakcije između nukleozoma i drugih regulatornih proteina.

Histoni se dijele na kanonske histone zavisne od replikacije koji se eksprimiraju tokom S-faze ćelijskog ciklusa i varijante histona nezavisne od replikacije, eksprimirane tokom cijelog ćelijskog ciklusa. Kod životinja, geni koji kodiraju kanonske histone obično su grupirani duž hromozoma, nemaju introne i koriste strukturu petlje stabla na 3' kraju umjesto poliA repa. Geni koji kodiraju histonske varijante obično nisu grupirani, imaju introne i njihove mRNA su regulirane poliA repovima. Složeni višećelijski organizmi obično imaju veći broj histonskih varijanti koje pružaju niz različitih funkcija. Akumuliraju se noviji podaci o ulozi različitih varijanti histona naglašavajući funkcionalne veze između varijanti i delikatne regulacije razvoja organizma. [10] Varijante histona iz različitih organizama, njihova klasifikacija i specifične karakteristike varijanti mogu se naći u bazi podataka "HistoneDB 2.0 - Variants".

Slijedi lista humanih histonskih proteina:

Super porodica Porodica Potporodica Članovi
Linker H1 H1F H1F0, H1FNT, H1FOO, H1FX
H1H1 HIST1H1A, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, HIST1H1T
Core H2A H2AF H2AFB1, H2AFB2, H2AFB3, H2AFJ, H2AFV, H2AFX, H2AFY, H2AFY2, H2AFZ
H2A1 HIST1H2AA, HIST1H2AB, HIST1H2AC, HIST1H2AD, HIST1H2AE, HIST1H2AG, HIST1H2AI, HIST1H2AJ, HIST1H2AK, HIST1H2AL, HIST1H2AM
H2A2 HIST2H2AA3, HIST2H2AC
H2B H2BF H2BFM, H2BFS, H2BFWT
H2B1 HIST1H2BA, HIST1H2BB, HIST1H2BC, HIST1H2BD, HIST1H2BE, HIST1H2BF, HIST1H2BG, HIST1H2BH, HIST1H2BI, HIST1H2BJ, HIST1H2BK, HIST1H2BL, HIST1H2BBN HIST1H2BB, HISTBO,
H2B2 HIST2H2BE
H3 H3A1 HIST1H3A, HIST1H3B, HIST1H3C, HIST1H3D, HIST1H3E, HIST1H3F, HIST1H3G, HIST1H3H, HIST1H3I, HIST1H3J
H3A2 HIST2H3C
H3A3 HIST3H3
H4 H41 HIST1H4A, HIST1H4B, HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4G, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1H4J, HIST1H4K, HIST1H4L
H44 HIST4H4

Nukleozomsko jezgro je formirano od dva H2A-H2B dimera i H3-H4 tetramera, formirajući dvije skoro simetrične polovine tercijarnom strukturom (C2 simetrija, jedna makromolekula je zrcalna slika druge). [8] H2A-H2B dimeri i H3-H4 tetramer takođe pokazuju pseudodijadnu simetriju. Četiri 'jezgra' histona (H2A, H2B, H3 i H4) su relativno slične strukture i visoko su očuvani kroz evoluciju, a svi imaju motiv 'helix turn helix turn helix' (motiv proteina koji se vezuje za DNK koji prepoznaje specifičnu sekvencu DNK) . Oni također dijele karakteristiku dugih 'repova' na jednom kraju strukture aminokiselina - ovo je mjesto posttranslacijske modifikacije (vidi dolje). [11]

Arhealni histon sadrži samo H3-H4 dimernu strukturu napravljenu od istog proteina. Takve dimerne strukture mogu se slagati u visoku superheliks ("hipernukleosom") na koji se DNK namotava na način sličan kolutovima nukleosoma. [12] Samo neki arhealni histoni imaju repove. [13]

Udaljenost između kolutova oko kojih eukariotske ćelije namotaju svoju DNK je određena u rasponu od 59 do 70 Å. [14]

Sve u svemu, histoni ostvaruju pet vrsta interakcija sa DNK:

    i vodikove veze između bočnih lanaca bazičnih aminokiselina (posebno lizina i arginina) i fosfatnog kiseonika na DNK
  • Heliks-dipoli formiraju alfa spirale u H2B, H3 i H4 uzrokuju akumulaciju neto pozitivnog naboja na mjestu interakcije s negativno nabijenim fosfatnim grupama na DNK između okosnice DNK i amidne grupe na glavnom lancu histonskih proteina
  • Nepolarne interakcije između šećera histona i deoksiriboze na DNK
  • Nespecifična umetanja manjih žljebova H3 i H2B N-terminalnih repova u dva manja utora na molekuli DNK

Veoma osnovna priroda histona, osim što olakšava interakciju DNK-histon, doprinosi njihovoj topljivosti u vodi.

Histoni su podložni posttranslacijskim modifikacijama enzimima prvenstveno na njihovim N-terminalnim repovima, ali i u svojim globularnim domenima. [15] [16] Takve modifikacije uključuju metilaciju, citrulinaciju, acetilaciju, fosforilaciju, SUMOilaciju, ubikvitinaciju i ADP-ribozilaciju. To utiče na njihovu funkciju regulacije gena.

Generalno, aktivni geni imaju manje vezanog histona, dok su neaktivni geni visoko povezani sa histonima tokom interfaze. [17] Također se čini da je struktura histona evolucijski očuvana, jer bi bilo kakve štetne mutacije bile ozbiljno neprilagođene. Svi histoni imaju visoko pozitivno nabijen N-terminus sa mnogo lizinskih i argininskih ostataka.

Osnovni histoni se nalaze u jezgrama eukariotskih ćelija i u većini Archaeal phyla, ali ne i u bakterijama. [13] Međutim, linker histoni imaju homologe u bakterijama. [18] Prethodno se smatralo da su jednoćelijske alge poznate kao dinoflagelati jedini eukarioti koji u potpunosti nemaju histone, [19] međutim, kasnije studije su pokazale da njihova DNK još uvijek kodira histonske gene. [20] Za razliku od osnovnih histona, proteini vezani histonski (H1) bogati lizinom nalaze se u bakterijama, inače poznatim kao nukleoprotein HC1/HC2. [18]

Predloženo je da su histonski proteini evolucijski povezani sa spiralnim dijelom proširene AAA+ ATPazne domene, C-domenom i N-terminalnim domenom za prepoznavanje supstrata Clp/Hsp100 proteina. Uprkos razlikama u njihovoj topologiji, ova tri nabora dijele homologni motiv heliksa-lanaca-heliksa (HSH). [11]

Arhealni histoni mogu biti slični evolucijskim prethodnicima eukariotskih histona. [13] Nadalje, histoni nukleosoma (jezgra) možda su evoluirali iz ribosomskih proteina (RPS6/RPS15) sa kojima dijele mnogo toga zajedničkog, i kratki i osnovni proteini. [21] Histonski proteini su među najkonzervativnijim proteinima kod eukariota, naglašavajući njihovu važnu ulogu u biologiji jezgra. [2] : 939 Nasuprot tome, zrele spermatozoide u velikoj mjeri koriste protamine za pakiranje svoje genomske DNK, najvjerovatnije zato što im to omogućava da postignu još veći omjer pakovanja. [22]

Ima nekih varijanta forme u nekim od glavnih klasa. Oni dijele homologiju aminokiselinske sekvence i osnovnu strukturnu sličnost sa specifičnom klasom glavnih histona, ali također imaju vlastitu karakteristiku koja se razlikuje od glavnih histona. Ove manji histoni obično obavljaju specifične funkcije metabolizma hromatina. Na primjer, CENPA sličan histonu H3 povezan je samo sa centromernom regijom hromozoma. Histon H2A varijanta H2A.Z je povezana sa promotorima aktivno transkribovanih gena i takođe je uključena u prevenciju širenja tihog heterohromatina. [23] Nadalje, H2A.Z ima ulogu u hromatinu za stabilnost genoma. [24] Druga H2A varijanta H2A.X je fosforilirana na S139 u regijama oko dvolančanih prekida i označava regiju koja prolazi kroz popravku DNK. [25] Histon H3.3 je povezan sa tijelom aktivno transkribiranih gena. [26]

Zbijanje DNK lanaca Uredi

Histoni se ponašaju kao kalemovi oko kojih se DNK vijuga. Ovo omogućava zbijanje neophodnu za uklapanje velikih genoma eukariota u ćelijske jezgre: zbijena molekula je 40 000 puta kraća od neupakovane molekule.

Regulacija hromatina Edit

Histoni prolaze kroz posttranslacijske modifikacije koje mijenjaju njihovu interakciju s DNK i nuklearnim proteinima. Histoni H3 i H4 imaju duge repove koji vire iz nukleozoma, koji se mogu kovalentno modificirati na nekoliko mjesta. Modifikacije repa uključuju metilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, ubikvitinaciju, SUMOilaciju, citrulinaciju i ADP-ribozilaciju. Jezgro histona H2A i H2B također može biti modificirano. Smatra se da kombinacije modifikacija čine kod, takozvani "histonski kod". [27] [28] Modifikacije histona djeluju u različitim biološkim procesima kao što su regulacija gena, popravak DNK, kondenzacija hromozoma (mitoza) i spermatogeneza (mejoza). [29]

Uobičajena nomenklatura histonskih modifikacija je:

  • Ime histona (npr. H3)
  • Jednoslovna aminokiselinska skraćenica (npr. K za lizin) i pozicija amino kiseline u proteinu
  • Vrsta modifikacije (Me: metil, P: fosfat, Ac: acetil, Ub: ubikvitin)
  • Broj modifikacija (poznato je da se samo Me pojavljuje u više od jedne kopije po ostatku. 1, 2 ili 3 je mono-, di- ili tri-metilacija)

Dakle, H3K4me1 označava monometilaciju 4. ostatka (lizin) od početka (tj. N-terminala) proteina H3.

Primjeri histonskih modifikacija u regulaciji transkripcije
Vrstu
modifikacija
Histon
H3K4 H3K9 H3K14 H3K27 H3K79 H3K36 H4K20 H2BK5 H2BK20
mono-metilacija aktivacija [30] aktivacija [31] aktivacija [31] aktivacija [31] [32] aktivacija [31] aktivacija [31]
dimetilacija represija [33] represija [33] aktivacija [32]
tri-metilacija aktivacija [34] represija [31] represija [31] aktivacija, [32]
represija [31]
aktivacija represija [33]
acetilacija aktivacija [35] aktivacija [34] aktivacija [34] aktivacija [36] aktivacija

Opisan je ogroman katalog histonskih modifikacija, ali funkcionalno razumijevanje većine još uvijek nedostaje. Zajedno, smatra se da histonske modifikacije mogu biti u osnovi histonskog koda, pri čemu kombinacije histonskih modifikacija imaju specifična značenja. Međutim, većina funkcionalnih podataka odnosi se na pojedinačne istaknute modifikacije histona koje su biohemijski podložne detaljnom proučavanju.

Chemistry Edit

Metilacija lizina Edit

Dodavanje jedne, dvije ili više metil grupa lizinu ima mali učinak na hemiju metilacije histona, ostavlja naboj lizina netaknutim i dodaje minimalan broj atoma tako da sterične interakcije uglavnom nisu pogođene. Međutim, proteini koji sadrže Tudor, hromo ili PHD domene, između ostalih, mogu prepoznati metilaciju lizina sa izuzetnom osjetljivošću i razlikovati mono, di i tri-metil lizin, do te mjere da za neke lizine (npr.: H4K20) mono, di i tri Čini se da metilacija ima različita značenja. Zbog toga, metilacija lizina ima tendenciju da bude vrlo informativna oznaka i dominira poznatim funkcijama modifikacije histona.

Glutamin serotonilacija Uredi

Nedavno je pokazano da se dodavanje serotoninske grupe na poziciju 5 glutamina H3 dešava u serotonergičkim ćelijama kao što su neuroni. Ovo je dio diferencijacije serotonergičkih stanica. Ova post-translacijska modifikacija se događa u sprezi s modifikacijom H3K4me3. Serotonilacija potencira vezivanje opšteg transkripcionog faktora TFIID za TATA kutiju. [37]

Metilacija arginina Edit

Ono što je gore rečeno o hemiji metilacije lizina također se odnosi na metilaciju arginina, a neki proteinski domeni - na primjer, Tudor domeni - mogu biti specifični za metil arginin umjesto metil lizina. Poznato je da je arginin mono- ili dimetiliran, a metilacija može biti simetrična ili asimetrična, potencijalno s različitim značenjima.

Arginin citrulination Edit

Enzimi koji se nazivaju peptidilarginin deiminaze (PAD) hidroliziraju iminsku grupu arginina i vezuju keto grupu, tako da postoji jedan pozitivan naboj manje na aminokiselinskom ostatku. Ovaj proces je uključen u aktivaciju ekspresije gena tako što je modificirane histone činio manje čvrsto vezanim za DNK i na taj način činio kromatin pristupačnijim. [38] PAD-ovi takođe mogu proizvesti suprotan efekat uklanjanjem ili inhibiranjem monometilacije argininskih ostataka na histonima i na taj način antagonizirajući pozitivan efekat metilacije arginina na transkripcionu aktivnost. [39]

Acetilacija lizina Edit

Dodatak acetil grupe ima veliki hemijski efekat na lizin jer neutrališe pozitivni naboj. Ovo smanjuje elektrostatičku privlačnost između histona i negativno nabijene DNK okosnice, labaveći strukturu kromatina. Visoko acetilirani histoni formiraju pristupačniji kromatin i imaju tendenciju da budu povezani s aktivnom transkripcijom. Čini se da je acetilacija lizina manje precizna po značenju od metilacije, jer histon acetiltransferaze imaju tendenciju da djeluju na više od jednog lizina, što pretpostavlja da odražava potrebu za promjenom više lizina da bi imali značajan učinak na strukturu hromatina. Modifikacija uključuje H3K27ac.

Fosforilacija serina/treonina/tirozina Edit

Dodavanje negativno nabijene fosfatne grupe može dovesti do velikih promjena u strukturi proteina, što dovodi do dobro okarakterizirane uloge fosforilacije u kontroli funkcije proteina. Nije jasno koje strukturne implikacije ima fosforilacija histona, ali fosforilacija histona ima jasne funkcije kao posttranslaciona modifikacija, a okarakterisani su domeni vezivanja kao što je BRCT.

Efekti na transkripciju Uredi

Većina dobro proučenih histonskih modifikacija uključena je u kontrolu transkripcije.

Aktivno transkribovani geni Uredi

Dvije histonske modifikacije su posebno povezane s aktivnom transkripcijom:

Trimetilacija H3 lizina 4 (H3K4me3) Ova trimetilacija se dešava na promotoru aktivnih gena [40] [41] [42] i izvodi je COMPASS kompleks. [43] [44] [45] Uprkos očuvanju ovog kompleksa i histonske modifikacije od kvasca do sisara, nije sasvim jasno kakvu ulogu igra ova modifikacija. Međutim, to je odlična oznaka aktivnih promotora i nivo ove histonske modifikacije na promotoru gena je u širokoj korelaciji sa transkripcionom aktivnošću gena. Formiranje ove oznake vezano je za transkripciju na prilično zamršen način: u ranoj fazi transkripcije gena, RNA polimeraza II prolazi kroz promjenu od inicijalne" do "elongacije", što je obilježeno promjenom stanja fosforilacije RNA polimeraze II C. terminalna domena (CTD). Isti enzim koji fosforiliše CTD takođe fosforiliše kompleks Rad6, [46] [47] koji zauzvrat dodaje ubikvitinsku oznaku H2B K123 (K120 kod sisara). [48] ​​H2BK123Ub se javlja u transkribovanim regionima, ali ova oznaka je potrebna da COMPASS trimetilira H3K4 na promotorima. [49] [50] Trimetilacija H3 lizina 36 (H3K36me3) Ova trimetilacija se događa u tijelu aktivnih gena i deponuje se pomoću metiltransferaze Set2. [51] Ovaj protein se povezuje sa elongacijom RNA polimeraze II, a H3K36Me3 je indikativan za aktivno transkribovane gene. [52] H3K36Me3 se prepoznaje po kompleksu Rpd3 histon deacetilaze, koji uklanja modifikacije acetila iz okolnih histona, povećavajući zbijanje hromatina i potiskujući lažnu transkripciju. [53] [54] [55] Povećana kompaktacija hromatina sprečava faktore transkripcije da pristupe DNK i smanjuje verovatnoću pokretanja novih događaja transkripcije unutar tela gena. Ovaj proces stoga pomaže da se osigura da transkripcija nije prekinuta.

Potisnuti geni Uredi

Tri histonske modifikacije su posebno povezane sa potisnutim genima:

Trimetilacija H3 lizina 27 (H3K27me3) Ova histonska modifikacija je deponovana polikomb kompleksom PRC2. [56] To je jasan marker genske represije, [57] i vjerovatno je vezan drugim proteinima kako bi izvršio represivnu funkciju. Drugi polikomb kompleks, PRC1, može vezati H3K27me3 [57] i dodaje histonsku modifikaciju H2AK119Ub koja pomaže sabijanju hromatina. [58] [59] Na osnovu ovih podataka izgleda da se PRC1 regrutuje djelovanjem PRC2, međutim, nedavne studije pokazuju da se PRC1 regrutuje na istim mjestima u odsustvu PRC2. [60] [61] Di i trimetilacija H3 lizina 9 (H3K9me2/3) H3K9me2/3 je dobro okarakteriziran marker za heterohromatin, te je stoga snažno povezan sa represijom gena. Stvaranje heterohromatina je najbolje proučeno kod kvasca Schizosaccharomyces pombe, gdje se pokreće regrutacijom RNA-indukovanog transkripcionog utišavanja (RITS) kompleksa u dvolančane RNA proizvedene iz centromernih ponavljanja. [62] RITS regrutuje Clr4 histon metiltransferazu koja taloži H3K9me2/3. [63] Ovaj proces se naziva metilacija histona. H3K9Me2/3 služi kao vezno mjesto za regrutaciju Swi6 (heterohromatin protein 1 ili HP1, još jedan klasični heterohromatinski marker) [64] [65] koji zauzvrat regrutuje dalje represivne aktivnosti uključujući histonske modifikatore kao što su histon deacetilaze i histon metiltransferaze. [66] Trimetilacija H4 lizina 20 (H4K20me3) Ova modifikacija je usko povezana sa heterohromatinom, [67] [68] iako njen funkcionalni značaj ostaje nejasan. Ovu oznaku postavlja Suv4-20h metiltransferaza, koju barem djelomično regrutuje heterohromatin protein 1. [67]

Bivalentni promoteri Edit

Analiza histonskih modifikacija u embrionalnim matičnim ćelijama (i drugim matičnim ćelijama) otkrila je mnoge promotore gena koji nose i H3K4Me3 i H3K27Me3, drugim riječima, ovi promotori istovremeno pokazuju i aktivirajuće i potisne markere. Ova neobična kombinacija modifikacija označava gene koji su spremni za transkripciju, nisu potrebni u matičnim ćelijama, ali su brzo potrebni nakon diferencijacije u neke loze. Jednom kada ćelija počne da se diferencira, ovi bivalentni promotori se razlažu ili u aktivna ili u represivna stanja u zavisnosti od odabrane loze. [69]

Ostale funkcije Uredi

Oštećenje DNK Uredi

Označavanje mjesta oštećenja DNK važna je funkcija za modifikacije histona. Takođe štiti DNK od uništenja ultraljubičastim zračenjem sunca.

Fosforilacija H2AX u serinu 139 (γH2AX) Fosforilirani H2AX (također poznat kao gama H2AX) je marker za prekide dvostrukog lanca DNK, [70] i čini dio odgovora na oštećenje DNK. [25] [71] H2AX je fosforiliran rano nakon otkrivanja prekida dvostrukog lanca DNK i formira domen koji se proteže na mnogo kilobaza sa svake strane oštećenja. [70] [72] [73] Gama H2AX djeluje kao vezno mjesto za protein MDC1, koji zauzvrat regrutuje ključne proteine ​​za popravku DNK [74] (ova složena tema je dobro razmotrena u [75] ) i kao takva, gama H2AX čini vitalni dio mašinerije koja osigurava stabilnost genoma. Acetilacija H3 lizina 56 (H3K56Ac) H3K56Acx je neophodan za stabilnost genoma. [76] [77] H3K56 je acetiliran kompleksom p300/Rtt109, [78] [79] [80] ali se brzo deacetilira oko mjesta oštećenja DNK. Acetilacija H3K56 je također potrebna za stabilizaciju viljuški za replikaciju u zastoju, sprječavajući opasne kolapse viljuške za replikaciju. [81] [82] Iako općenito sisari mnogo više koriste histonske modifikacije nego mikroorganizmi, glavna uloga H3K56Ac u replikaciji DNK postoji samo u gljivama, i to je postalo meta za razvoj antibiotika. [83]

DNK popravka Edit

H3K36me3 ima sposobnost da regrutuje MSH2-MSH6 (hMutSα) kompleks puta popravke neusklađenosti DNK. [84] Dosljedno, regije ljudskog genoma s visokim nivoom H3K36me3 akumuliraju manje somatskih mutacija zbog aktivnosti popravljanja neusklađenosti. [85]

Kondenzacija hromozoma Uredi

Ovisnost Edit

Epigenetske modifikacije histonskih repova u određenim regijama mozga su od centralnog značaja u ovisnostima. [91] [92] [93] Jednom kada se dogode određene epigenetske promjene, izgledaju kao dugotrajni "molekularni ožiljci" koji mogu objasniti postojanost ovisnosti. [91]

Pušači cigareta (oko 15% američke populacije) obično su ovisni o nikotinu. [94] Nakon 7 dana nikotinskog tretmana miševa, pojačana je acetilacija i histona H3 i histona H4 na FosB promotoru u nucleus accumbensu mozga, uzrokujući 61% povećanje ekspresije FosB. [95] Ovo bi takođe povećalo ekspresiju varijante spajanja Delta FosB. U nucleus accumbensu mozga, Delta FosB funkcionira kao "trajni molekularni prekidač" i "glavni kontrolni protein" u razvoju ovisnosti. [96] [97]

Oko 7% američke populacije je ovisno o alkoholu. Kod pacova izloženih alkoholu do 5 dana, došlo je do povećanja acetilacije histona 3 lizina 9 u pronociceptin promotoru u kompleksu moždane amigdale. Ova acetilacija je aktivirajući znak za pronociceptin. Sistem opioidnih receptora nociceptin/nociceptin uključen je u pojačavajuće ili kondicionirajuće efekte alkohola. [98]

Ovisnost o metamfetaminu javlja se kod oko 0,2% američke populacije. [99] Chronic methamphetamine use causes methylation of the lysine in position 4 of histone 3 located at the promoters of the c-fos i C-C chemokine receptor 2 (ccr2) genes, activating those genes in the nucleus accumbens (NAc). [100] c-fos is well known to be important in addiction. [101] The ccr2 gene is also important in addiction, since mutational inactivation of this gene impairs addiction. [100]

The first step of chromatin structure duplication is the synthesis of histone proteins: H1, H2A, H2B, H3, H4. These proteins are synthesized during S phase of the cell cycle. There are different mechanisms which contribute to the increase of histone synthesis.

Yeast Edit

Yeast carry one or two copies of each histone gene, which are not clustered but rather scattered throughout chromosomes. Histone gene transcription is controlled by multiple gene regulatory proteins such as transcription factors which bind to histone promoter regions. In budding yeast, the candidate gene for activation of histone gene expression is SBF. SBF is a transcription factor that is activated in late G1 phase, when it dissociates from its repressor Whi5. This occurs when Whi5 is phosphorylated by Cdc8 which is a G1/S Cdk. [102] Suppression of histone gene expression outside of S phases is dependent on Hir proteins which form inactive chromatin structure at the locus of histone genes, causing transcriptional activators to be blocked. [103] [104]

Metazoan Edit

In metazoans the increase in the rate of histone synthesis is due to the increase in processing of pre-mRNA to its mature form as well as decrease in mRNA degradation this results in an increase of active mRNA for translation of histone proteins. The mechanism for mRNA activation has been found to be the removal of a segment of the 3' end of the mRNA strand, and is dependent on association with stem-loop binding protein (SLBP). [105] SLBP also stabilizes histone mRNAs during S phase by blocking degradation by the 3'hExo nuclease. [106] SLBP levels are controlled by cell-cycle proteins, causing SLBP to accumulate as cells enter S phase and degrade as cells leave S phase. SLBP are marked for degradation by phosphorylation at two threonine residues by cyclin dependent kinases, possibly cyclin A/ cdk2, at the end of S phase. [107] Metazoans also have multiple copies of histone genes clustered on chromosomes which are localized in structures called Cajal bodies as determined by genome-wide chromosome conformation capture analysis (4C-Seq). [108]

Link between cell-cycle control and synthesis Edit

Nuclear protein Ataxia-Telangiectasia (NPAT), also known as nuclear protein coactivator of histone transcription, is a transcription factor which activates histone gene transcription on chromosomes 1 and 6 of human cells. NPAT is also a substrate of cyclin E-Cdk2, which is required for the transition between G1 phase and S phase. NPAT activates histone gene expression only after it has been phosphorylated by the G1/S-Cdk cyclin E-Cdk2 in early S phase. [109] This shows an important regulatory link between cell-cycle control and histone synthesis.

Histones were discovered in 1884 by Albrecht Kossel. [110] The word "histone" dates from the late 19th century and is derived from the German word "Histon", a word itself of uncertain origin - perhaps from the Greek histanai ili histos.

In the early 1960s, before the types of histones were known and before histones were known to be highly conserved across taxonomically diverse organisms, James F. Bonner and his collaborators began a study of these proteins that were known to be tightly associated with the DNA in the nucleus of higher organisms. [111] Bonner and his postdoctoral fellow Ru Chih C. Huang showed that isolated chromatin would not support RNA transcription in the test tube, but if the histones were extracted from the chromatin, RNA could be transcribed from the remaining DNA. [112] Their paper became a citation classic. [113] Paul T'so and James Bonner had called together a World Congress on Histone Chemistry and Biology in 1964, in which it became clear that there was no consensus on the number of kinds of histone and that no one knew how they would compare when isolated from different organisms. [114] [111] Bonner and his collaborators then developed methods to separate each type of histone, purified individual histones, compared amino acid compositions in the same histone from different organisms, and compared amino acid sequences of the same histone from different organisms in collaboration with Emil Smith from UCLA. [115] For example, they found Histone IV sequence to be highly conserved between peas and calf thymus. [115] However, their work on the biochemical characteristics of individual histones did not reveal how the histones interacted with each other or with DNA to which they were tightly bound. [114]

Also in the 1960s, Vincent Allfrey and Alfred Mirsky had suggested, based on their analyses of histones, that acetylation and methylation of histones could provide a transcriptional control mechanism, but did not have available the kind of detailed analysis that later investigators were able to conduct to show how such regulation could be gene-specific. [116] Until the early 1990s, histones were dismissed by most as inert packing material for eukaryotic nuclear DNA, a view based in part on the models of Mark Ptashne and others, who believed that transcription was activated by protein-DNA and protein-protein interactions on largely naked DNA templates, as is the case in bacteria.

During the 1980s, Yahli Lorch and Roger Kornberg [117] showed that a nucleosome on a core promoter prevents the initiation of transcription in vitro, and Michael Grunstein [118] demonstrated that histones repress transcription in vivo, leading to the idea of the nucleosome as a general gene repressor. Relief from repression is believed to involve both histone modification and the action of chromatin-remodeling complexes. Vincent Allfrey and Alfred Mirsky had earlier proposed a role of histone modification in transcriptional activation, [119] regarded as a molecular manifestation of epigenetics. Michael Grunstein [120] and David Allis [121] found support for this proposal, in the importance of histone acetylation for transcription in yeast and the activity of the transcriptional activator Gcn5 as a histone acetyltransferase.

The discovery of the H5 histone appears to date back to the 1970s, [122] and it is now considered an isoform of Histone H1. [2] [4] [5] [6]


Sadržaj

Together with the acetylpolyamine amidohydrolases and the acetoin utilization proteins, the histone deacetylases form an ancient protein superfamily known as the histone deacetylase superfamily. [4]

HDACs, are classified in four classes depending on sequence homology to the yeast original enzymes and domain organization: [5]

HDAC classification in higher eukaryotes
Klasa Članovi Catalytic sites Subcellular localization Tissue distribution Podloge Binding partners Knockout phenotype
I HDAC1 1 Nukleus Ubiquitous Androgen receptor, SHP, p53, MyoD, E2F1, STAT3 Embryonic lethal, increased histone acetylation, increase in p21 and p27
HDAC2 1 Nukleus Ubiquitous Glucocorticoid receptor, YY1, BCL6, STAT3 Cardiac defect
HDAC3 1 Nukleus Ubiquitous SHP, YY1, GATA1, RELA, STAT3, MEF2D
HDAC8 1 Nucleus/cytoplasm Ubiquitous? EST1B
IIA HDAC4 1 Nucleus / cytoplasm heart, skeletal muscle, brain GCMA, GATA1, HP1 RFXANK Defects in chondrocyte differentiation
HDAC5 1 Nucleus / cytoplasm heart, skeletal muscle, brain GCMA, SMAD7, HP1 REA, estrogen receptor Cardiac defect
HDAC7 1 Nucleus / cytoplasm / mitochondria heart, skeletal muscle, pancreas, placenta PLAG1, PLAG2 HIF1A, BCL6, endothelin receptor, ACTN1, ACTN4, androgen receptor, Tip60 Maintenance of vascular integrity, increase in MMP10
HDAC9 1 Nucleus / cytoplasm brain, skeletal muscle FOXP3 Cardiac defect
IIB HDAC6 2 Mostly cytoplasm heart, liver, kidney, placenta α-Tubulin, HSP90, SHP, SMAD7 RUNX2
HDAC10 1 Mostly cytoplasm liver, spleen, kidney
III sirtuins in mammals (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7)
Sir2 in the yeast S. cerevisiae
IV HDAC11 2 Nucleus / cytoplasm brain, heart, skeletal muscle, kidney

HDAC (except class III) contain zinc and are known as Zn 2+ -dependent histone deacetylases. [6] They feature a classical arginase fold and are structurally and mechanistically distinct from sirtuins (class III), which fold into a Rossmann architecture and are NAD + dependent. [7]

HDAC proteins are grouped into four classes (see above) based on function and DNA sequence similarity. Class I, II and IV are considered "classical" HDACs whose activities are inhibited by trichostatin A (TSA) and have a zinc dependent active site, whereas Class III enzymes are a family of NAD + -dependent proteins known as sirtuins and are not affected by TSA. [8] Homologues to these three groups are found in yeast having the names: reduced potassium dependency 3 (Rpd3), which corresponds to Class I histone deacetylase 1 (hda1), corresponding to Class II and silent information regulator 2 (Sir2), corresponding to Class III. Class IV contains just one isoform (HDAC11), which is not highly homologous with either Rpd3 or hda1 yeast enzymes, [9] and therefore HDAC11 is assigned to its own class. The Class III enzymes are considered a separate type of enzyme and have a different mechanism of action these enzymes are NAD + -dependent, whereas HDACs in other classes require Zn 2+ as a cofactor. [10]

HDACs are conserved across evolution, showing orthologs in all eukaryotes and even in Archaea. All upper eukaryotes, including vertebrates, plants and arthropods, possess at least one HDAC per class, while most vertebrates carry the 11 canonical HDACs, with the exception of bone fish, which lack HDAC2 but appears to have an extra copy of HDAC11, dubbed HDAC12. Plants carry additional HDACs compared to animals, putatively to carry out the more complex transcriptional regulation required by these sessile organisms. HDACs appear to be deriving from an ancestral acetyl-binding domain, as HDAC homologs have been found in bacteria in the form of Acetoin utilization proteins (AcuC) proteins. [2]

Within the Class I HDACs, HDAC 1, 2, and 3 are found primarily in the nucleus, whereas HDAC8 is found in both the nucleus and the cytoplasm, and is also membrane-associated. Class II HDACs (HDAC4, 5, 6, 7 9, and 10) are able to shuttle in and out of the nucleus, depending on different signals. [11] [12]

HDAC6 is a cytoplasmic, microtubule-associated enzyme. HDAC6 deacetylates tubulin, Hsp90, and cortactin, and forms complexes with other partner proteins, and is, therefore, involved in a variety of biological processes. [13]

Histone modification Edit

Histone tails are normally positively charged due to amine groups present on their lysine and arginine amino acids. These positive charges help the histone tails to interact with and bind to the negatively charged phosphate groups on the DNA backbone. Acetylation, which occurs normally in a cell, neutralizes the positive charges on the histone by changing amines into amides and decreases the ability of the histones to bind to DNA. This decreased binding allows chromatin expansion, permitting genetic transcription to take place. Histone deacetylases remove those acetyl groups, increasing the positive charge of histone tails and encouraging high-affinity binding between the histones and DNA backbone. The increased DNA binding condenses DNA structure, preventing transcription.

Histone deacetylase is involved in a series of pathways within the living system. Prema Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), these are:

  • Environmental information processing signal transduction notch signaling pathwayPATH:ko04330
  • Cellular processes cell growth and death cell cyclePATH:ko04110
  • Human diseases cancers chronic myeloid leukemiaPATH:ko05220

Histone acetylation plays an important role in the regulation of gene expression. Hyperacetylated chromatin is transcriptionally active, and hypoacetylated chromatin is silent. A study on mice found that a specific subset of mouse genes (7%) was deregulated in the absence of HDAC1. [14] Their study also found a regulatory crosstalk between HDAC1 and HDAC2 and suggest a novel function for HDAC1 as a transcriptional coactivator. HDAC1 expression was found to be increased in the prefrontal cortex of schizophrenia subjects, [15] negatively correlating with the expression of GAD67 mRNA.

Non-histone effects Edit

It is a mistake to regard HDACs solely in the context of regulating gene transcription by modifying histones and chromatin structure, although that appears to be the predominant function. The function, activity, and stability of proteins can be controlled by post-translational modifications. Protein phosphorylation is perhaps the most widely studied and understood modification in which certain amino acid residues are phosphorylated by the action of protein kinases or dephosphorylated by the action of phosphatases. The acetylation of lysine residues is emerging as an analogous mechanism, in which non-histone proteins are acted on by acetylases and deacetylases. [16] It is in this context that HDACs are being found to interact with a variety of non-histone proteins—some of these are transcription factors and co-regulators, some are not. Note the following four examples:

    is associated with aggresomes. Misfolded protein aggregates are tagged by ubiquitination and removed from the cytoplasm by dynein motors via the microtubule network to an organelle termed the aggresome. HDAC 6 binds polyubiquitinated misfolded proteins and links to dynein motors, thereby allowing the misfolded protein cargo to be physically transported to chaperones and proteasomes for subsequent destruction. [17] HDAC6 is important regulator of HSP90 function and its inhibitor proposed to treat metabolic disorders. [18] is an important phosphatase involved in cell signaling via phosphoinositols and the AKT/PI3 kinase pathway. PTEN is subject to complex regulatory control via phosphorylation, ubiquitination, oxidation and acetylation. Acetylation of PTEN by the histone acetyltransferase p300/CBP-associated factor (PCAF) can repress its activity on the converse, deacetylation of PTEN by SIRT1 deacetylase and, by HDAC1, can stimulate its activity. [19][20]
  • APE1/Ref-1 (APEX1) is a multifunctional protein possessing both DNA repair activity (on abasic and single-strand break sites) and transcriptional regulatory activity associated with oxidative stress. APE1/Ref-1 is acetylated by PCAF on the converse, it is stably associated with and deacetylated by Class I HDACs. The acetylation state of APE1/Ref-1 does not appear to affect its DNA repair activity, but it does regulate its transcriptional activity such as its ability to bind to the PTH promoter and initiate transcription of the parathyroid hormone gene. [21][22] is a key transcription factor and effector molecule involved in responses to cell stress, consisting of a p50/p65 heterodimer. The p65 subunit is controlled by acetylation via PCAF and by deacetylation via HDAC3 and HDAC6. [23]

These are just some examples of constantly emerging non-histone, non-chromatin roles for HDACs.

Inherited mutations in the gene encoding FUS, an RNA/DNA binding protein, are causally linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS). [24] FUS has a pivotal role in the DNA damage response involving its direct interaction with histone deacetylase 1 (HDAC1). ALS mutant FUS proteins are defective in the DNA damage response and in recombinational DNA repair, and also show reduced interaction with HDAC1. [24]

Ataxia-telangiectasia is due to mutation in the Atm gen. Wild-type Atm encodes a protein kinase employed in chromatin remodeling and in epigenetic alterations that are required for repairing DNA double-strand breaks. [25] Atm mutation causes neurons to accumulate nuclear histone deacetylase 4 (HDAC4) resulting in increased histone deacetylation and altered neuronal gene expression that likely contributes to the neurodegeneration characteristic of ataxia-telangiectasia. [26]

Histone deacetylase inhibitors (HDIs) have a long history of use in psychiatry and neurology as mood stabilizers and anti-epileptics, for example, valproic acid. In more recent times, HDIs are being studied as a mitigator or treatment for neurodegenerative diseases. [27] [28] Also in recent years, there has been an effort to develop HDIs for cancer therapy. [29] [30] Vorinostat (SAHA) was FDA approved in 2006 for the treatment of cutaneous manifestations in patients with cutaneous T cell lymphoma (CTCL) that have failed previous treatments. A second HDI, Istodax (romidepsin), was approved in 2009 for patients with CTCL. The exact mechanisms by which the compounds may work are unclear, but epigenetic pathways are proposed. [31] In addition, a clinical trial is studying valproic acid effects on the latent pools of HIV in infected persons. [32] HDIs are currently being investigated as chemosensitizers for cytotoxic chemotherapy or radiation therapy, or in association with DNA methylation inhibitors based on in vitro synergy. [33] Isoform selective HDIs which can aid in elucidating role of individual HDAC isoforms have been developed. [34] [35] [36]

HDAC inhibitors have effects on non-histone proteins that are related to acetylation. HDIs can alter the degree of acetylation of these molecules and, therefore, increase or repress their activity. For the four examples given above (see Funkcija) on HDACs acting on non-histone proteins, in each of those instances the HDAC inhibitor Trichostatin A (TSA) blocks the effect. HDIs have been shown to alter the activity of many transcription factors, including ACTR, cMyb, E2F1, EKLF, FEN 1, GATA, HNF-4, HSP90, Ku70, NFκB, PCNA, p53, RB, Runx, SF1 Sp3, STAT, TFIIE, TCF, YY1. [37] [38]

The ketone body β-hydroxybutyrate has been shown in mice to increase gene expression of FOXO3a by histone deacetylase inhibition. [39]

Histone deacetylase inhibitors may modulate the latency of some viruses, resulting in reactivation. [40] This has been shown to occur, for instance, with a latent human herpesvirus-6 infekcija.

Histone deacetylase inhibitors have shown activity against certain Plazmodijum species and stages which may indicate they have potential in malaria treatment. It has been shown that HDIs accumulate acetylated histone H3K9/H3K14, a downstream target of class I HDACs. [41]


Additional data files

The following additional data are available with the online version of this paper. Additional data file 1 includes the microarray datasets used for this analysis. Additional data file 2 includes the stress datasets used for fuzzy k-means analysis. Additional data file 3 includes clustering results of all stress datasets. Additional data file 4 includes a comparison between clusters N6 and N53. Additional data file 5 shows all genes in the common stresses response cluster N12. Additional data file 6 provides original data of gene expression in roots. Additional data file 7 shows processed root dataset used for fuzzy k-means analysis. Additional data file 8 shows clustering results for the root dataset. Additional data file 9 shows the intersection between stress clustering and root clustering. Additional data file 10 shows clustering results for abiotic stresses in roots.


Opcije pristupa

Dobijte puni pristup časopisu za 1 godinu

Sve cijene su NETO cijene.
PDV će biti dodat kasnije na blagajni.
Obračun poreza bit će finaliziran prilikom plaćanja.

Dobijte vremenski ograničen ili potpun pristup članku na ReadCube-u.

Sve cijene su NETO cijene.


8.4: Genes and Chromatin in Eukaryotes - Biology

Za gledanje ovog sadržaja potrebna je pretplata na J o VE. Moći ćete vidjeti samo prvih 20 sekundi.

JoVE video plejer je kompatibilan sa HTML5 i Adobe Flashom. Stariji pretraživači koji ne podržavaju HTML5 i H.264 video kodek i dalje će koristiti Flash-bazirani video plejer. Preporučujemo preuzimanje najnovije verzije Flasha ovdje, ali podržavamo sve verzije 10 i novije.

Ako to ne pomogne, javite nam.

The promoter is a major regulator of gene expression that contains binding sites for RNA polymerase, the enzyme responsible for transcription, and transcription factors, that facilitate or inhibit the binding of RNA polymerase. 

The promoter region is mostly located upstream of the gene it regulates. It has distinct structural features, such as a curved structure with the ability to bend when transcriptional regulators bind and low thermodynamic stability due to the presence of AT-rich regions.  

In eukaryotes, this transcriptional control region is more complex than in prokaryotes. In addition to the core promoter, eukaryotic genes have many additional cis-regulatory sequences that transcription factors can bind.

Prokaryotic RNA polymerase requires a sigma factor to bind to the promoter, whereas eukaryotic RNA polymerases require several such regulators. 

Additionally, the three different RNA polymerases in eukaryotes that bind to distinct promoters, require different transcriptional regulators. 

The core eukaryotic promoter contains several signature motifs that work together in various combinations to allow RNA polymerase to bind. 

The TATA box is highly conserved across organisms. TATA boxes are usually present in genes that show high levels of cell-specific expression, such as proteins involved in cell differentiation.

Initiator and downstream promoter elements consist of degenerate sequences that follow a specific pattern of nucleotides, though their exact sequence varies.  

The initiator element is the most common promoter motif. It can either help to maintain basal levels of transcription or work together with the TATA box to improve the binding of transcription factors. 

The downstream promoter element is located downstream of the transcription start site and was initially found in promoters lacking a TATA box.  The DPE often works in conjunction with the initiator element to regulate transcription.

CpG islands consist of sections of DNA where a cytosine is followed by a guanine. CpG islands usually regulate housekeeping genes, which are continuously expressed in small amounts and do not require high levels of transcription.

10.7: The Eukaryotic Promoter Region

The eukaryotic promoter region is a segment of DNA located upstream of a gene. It contains an RNA polymerase binding site, a transcription start site, and several cis-regulatory sequences.  The proximal promoter region is located in the vicinity of the gene and has cis-regulatory sequences and the core promoter. The core promoter is the binding site for RNA polymerase and is usually located between -35 and +35 nucleotides from the transcription start site. The distal promoter regions are cis-regulatory sequences, thousands of base pairs away from a gene. The length of a promoter region can vary significantly from gene to gene.

The core promoter contains characteristic motifs where general transcription factors can bind and recruit RNA polymerase.  The TATA box is a motif located 25-30 base pairs upstream from the transcription start site. It is more flexible and less thermodynamically stable than other promoter motifs due to its high A-T content, allowing the efficient binding of the transcription machinery. It is found in genes that require high levels of expression under specific conditions, such as those genes involved in cell differentiation. The TATA box is often flanked by a set of short nucleotide motifs, known as B-recognition elements.  Transcription Factor II B,  an important component involved in the assembly of the transcription machinery at the TATA box, binds to these B-elements.

The Initiator element, composed of the degenerate sequence YYANWYY*, contains the transcription start site.  Downstream of the initiator element is another characteristic motif, known as the downstream promoter element (DPE), made up of the degenerate sequence RGWYVT. The TATA box and the DPE regulate similar types of genes, and a eukaryotic promoter can have either a TATA box or a DPE. The initiator element can function synergistically either with a TATA box or DPE to regulate transcription.

The CpG islands are another type of core promoter motif that regulates the expression of other types of genes,  like housekeeping genes, that require constant expression in small amounts. They are called CpG islands because they contain sequences that are high in cytosine followed by guanine. The “p” represents the phosphodiester bond that links C to G. CpG islands are also known to occur in distal promoter regions.

*R codes for either A or G W codes for either A or T Y codes for C or T V codes for A or G or C  and N codes for any of the four bases.


Metode

Plazmidna konstrukcija

The VP64 and 2TAL (two copies of the TAD of the TALE protein AvrBs3 from Xanthomonas campestris) coding sequences were codon-optimized for rice (Oryza sativa) and synthesized commercially (GenScript, Nanjing, China). The VP64 coding sequence was fused to the 3′ end of Cas9 by overlapping PCR, and an Avr II site was introduced between Cas9 and VP64. The Cas9-VP64 fusion gene was cloned into pJIT163 to generate p163-Cas9-VP64. Then, one copy of VP64 and three copies of the 2TAL fragment were inserted into the Avr II site of p163-Cas9-VP64 to generate p163-Cas9-TV. Different sgRNAs were introduced into pOsU3-sgRNA as previously described [35]. The sgRNA-dsgRNA co-expression plasmid was constructed as previously reported [36]. All the primers used in this work are listed in Additional file 1: Table S7 and were synthesized by GenScript.

DNase-seq data analysis

DNase-seq data for rice seedlings (GSE26610) were reported previously [19] and obtained from the NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). The DNase-seq data were loaded into Gbrowse of the rice annotation project database (RAP-DB), and the chromatin states of target sites were viewed.

Protoplast transfection

Two-week-old seedlings of rice cultivar “Nipponbare” were used for isolating protoplasts. Protoplast isolation and transfection were performed following the standard protocol [35]. Plasmids (10 μg each construct) were transfected into protoplasts via PEG-mediated transfection.

Agrobacterium-mediated rice transformation

Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 was transformed with binary vectors harboring Cas9 and sgRNA expression cassettes by electroporation. Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic callus cells of rice cultivar Nipponbare was conducted according to Hiei et al. [37]. Transgenic seedlings were selected on hygromycin-containing (50 μg/mL) medium.

Extraction of plant genomic DNA

The transfected protoplasts were incubated at 28 °C. After 48 h, the protoplasts were collected and genomic DNA was extracted by the CTAB method [38].

PCR amplification of targeted regions and next-generation sequencing

Genomic DNA extracted from protoplasts was used as a template in PCR. In the first-round PCR, specific primers were used to amplify the genomic regions flanking the CRISPR target sites (Additional file 1: Table S7). In the second round, 150–250-bp PCR products were amplified using primers (Additional file 1: Table S7) to introduce forward and reverse barcodes into the first-round PCR products. Equal amounts of the final PCR products were pooled and sequenced commercially (GENEWIZ, Suzhou, China) by paired-end read sequencing using the Illumina NextSeq 500 platform. The sgRNA target sites were examined for indels. Sequencing of each amplicon was repeated three times, using genomic DNA from three independent protoplast samples.

In vitro cleavage by Cas9 RNP

In vitro cleavage by Cas9 RNP was performed as previously reported [39]. Target DNA sequences were amplified by PCR using specific primers (Additional file 1: Table S7), then purified and eluted in RNase-free water. Cas9 protein (1 μg) and sgRNA (1 μg) were pre-mixed and incubated with the target DNA (200 ng) at 37 °C for 1 h. The products were then separated on 2% agarose gel, and band intensities were measured using ImageJ to calculate Cas9 cleavage activity.

Real-time PCR analysis

Transfected protoplasts were incubated at 28 °C for 24 h. Samples of 2 × 10 6 transfected rice protoplasts were used for RNA extraction. Total RNA was extracted with TRNzol reagent (Tiangen Biotech), then reverse transcribed into first-strand cDNA using a Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase (Thermo Fisher Scientific). Real-time PCR analysis was performed using SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Bio) and run on a Bio-Rad CFX96 PCR System (Bio-Rad Laboratories). Normalized expression levels were calculated with CFX Manager Software (Bio-Rad) using the 2 -ΔΔ(t) metoda. The Ubiquitin (Ubi) was used as the internal reference gene. The primers used are listed in Additional file 1: Table S7.

Detection of chromatin accessibility

Low-input DNase I digestion assays were performed as previously reported [40]. Transfected protoplasts were incubated at 28 °C for 24 h. Samples of 4 × 10 5 transfected rice protoplasts were resuspended in 45 μL lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100) and incubated on ice for 5 min, then DNase I (1000 U/ml, Sigma, AMPD1-1KT) was added to a final concentration of 2 U/mL. The samples were incubated at 37 °C for another 5 min before the reaction was terminated by adding 50 μL stop buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM NaCl, 0.15% SDS, 10 mM EDTA) containing 1 U Proteinase K and incubating at 55 °C for 1 h. Genomic DNA was extracted from each sample by the phenol-chloroform method [41] and analyzed by real-time qPCR (SYBR Premix Ex TaqTM II, Takara). The primers used are listed in Additional file 1: Table S7 and were synthesized by GenScript.

Detection of off-targets

Potential off-target sites for sgRNAs 24, 28, 34, and 38 were predicted by the online tool CRISPR-P [28]. Locus-specific primers for these sites were designed to produce PCR products of

150 to 250 bp. In the first round of PCR, specific primers were used to amplify the genomic regions flanking the on-target and off-target sites. The resulting PCR products were used as templates for second-round PCR, with barcodes added to each end of the PCR products using the primers listed in Additional file 1: Table S7. The PCR products were then pooled in equal quantities for next-generation sequencing. On-target and potential off-target sites were examined for indels. Sequencing of each amplicon was repeated three times, using genomic DNA from three independent protoplast samples.


Pogledajte video: REGULACIJA GENSKE EKSPRESIJE: LAKTOZNI OPERON, DIFERENCIJACIJA ĆELIJA KOD ČOVJEKA (Oktobar 2022).