Informacije

Alati za pronalaženje miRNA ID-a

Alati za pronalaženje miRNA ID-a


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kako mogu dobiti pristupne brojeve miRNA hljebne pšenice prema njihovim sekvencama? Koji se alati ili web stranica mogu koristiti?


  1. Ako imate sekvencu, pokrenite BLAST pretragu nukleotida na NCBI, navodeći Triticum aestivum (taxid:4565) kao organizam.

  2. Stranica miRBase za Triticum aestivum ima detalje o mikroRNK pšenice i stranicu na kojoj možete izvršiti pretragu sekvence pomoću BLAST ili SSEARCH (kao što je @WYSIWYG ljubazno istakao).

  3. Možda Triticum aestivum stranica na PlantGDB može pomoći.


Zajedničke karakteristike alata za predviđanje mikroRNA cilja


  • 1 Centar za molekularnu medicinu, Medicinski centar Maine Research Institute, Scarborough, ME, SAD
  • 2 Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono, ME, SAD
  • 3 Odsjek za kompjuterske nauke, Univerzitet Southern Maine, Portland, ME, SAD

Ljudski genom kodira za preko 1800 mikroRNA (miRNA), koje su kratke nekodirajuće RNA molekule koje funkcionišu da regulišu ekspresiju gena nakon transkripcije. Zbog mogućnosti da jedna miRNA cilja višestruke transkripte gena, miRNA su prepoznate kao glavni mehanizam za regulaciju ekspresije gena i translacije mRNA. Računarsko predviđanje miRNA meta je kritičan početni korak u identifikaciji miRNA:mRNA ciljnih interakcija za eksperimentalnu validaciju. Dostupni alati za predviđanje miRNA cilja obuhvataju niz različitih računarskih pristupa, od modeliranja fizičkih interakcija do uključivanja mašinskog učenja. Ovaj pregled pruža pregled glavnih računskih pristupa predviđanju miRNA cilja. Naša rasprava ističe tri alata za njihovu jednostavnost upotrebe, oslanjanje na relativno ažurirane verzije miRBase i niz mogućnosti, a to su DIANA-microT-CDS, miRanda-mirSVR i TargetScan. U poređenju sa svim alatima za predviđanje cilja miRNA, četiri glavna aspekta interakcije miRNA:mRNA cilja pojavljuju se kao zajedničke karakteristike na kojima se zasniva većina ciljanih predviđanja: podudaranje sjemena, očuvanje, besplatna energija i dostupnost lokacije. Ovaj pregled objašnjava ove karakteristike i identifikuje kako su ugrađene u trenutno dostupne alate za predviđanje cilja. Predviđanje cilja MiRNA je dinamično polje sa sve većom pažnjom na razvoj novih alata za analizu. Ovaj pregled pokušava da pruži sveobuhvatnu procjenu ovih alata na način koji je dostupan svim disciplinama. Razumijevanje osnove ovih metodologija predviđanja pomoći će korisniku u odabiru odgovarajućih alata i tumačenju rezultata alata.


Uvod

Prionske bolesti (ili prenosive spongiformne encefalopatije) su neizbježno fatalna klasa progresivnih neurodegenerativnih poremećaja, uključujući sporadičnu Creutzfeldt-Jakobovu bolest (sCJD) i Gerstmann-Straüssler-Scheinker (GSS) sindrom kod ljudi 1 . Patologiji bolesti doprinosi konformaciona konverzija normalnog ćelijskog PrP C u izoformu PrP Sc povezanu sa bolešću, što dovodi do karakteristične spongiformne vakuolacije u mozgu i progresivnog gubitka neurona. sCJD se obično predstavlja kao dementirajuća encefalopatija s mioklonusom, cerebelarnom ataksijom i tipičnim trajanjem bolesti sa srednjim preživljavanjem od četiri mjeseca 2 . Klinička dijagnoza prionskih bolesti vrši se u uznapredovaloj fazi neurološkog opadanja, gdje su oboljele osobe često nepokretne i nezarazne. Potvrda dijagnoze prionskih bolesti je ili biopsijom mozga ili autopsijom. Kako bismo poboljšali dijagnozu i strategije intervencije za prionsku bolest, moramo dalje razumjeti patogenezu prionskih bolesti i ključne regulatore molekularnih procesa tokom infekcije koji pokreću prionsku infektivnost i širenje bolesti. Ovdje nastojimo odrediti molekularni otisak prsta promjena mikroRNA (miRNA) u mozgu i serumu miševa inficiranih prionom koji bi se mogli koristiti kao pretklinički i klinički markeri sCJD.

Molekuli miRNA su prepoznati kao ključni modulator u translacijskoj represiji ili degradaciji mRNA vezivanjem za 3′ neprevedenu regiju (UTR) njihovih ciljnih mjesta. U kontekstu prionskih bolesti, životinjski modeli su otkrili popis miRNA potpisa koji je odgovoran za vitalne biološke puteve uključujući sinaptičku plastičnost, razvoj neurona i preživljavanje stanica 3,4,5,6. Nadalje, miRNA pronađena pakirana u ekstracelularnim vezikulama (EV), kao što su egzosomi, sve se više proučava kako bi se utvrdilo mogu li poslužiti kao dijagnostički biomarkeri kada su izolirani iz krvi 7,8,9. Nedavno, izolacija egzosoma izvedenih iz neurona u krvi 10 sugerira da egzosomi izvedeni iz mozga mogu zaobići krvno-moždanu barijeru (BBB). Ovo može omogućiti mogućnost dijagnosticiranja neurodegenerativnih bolesti putem neinvazivnog testa krvi poznatog kao tečna biopsija mozga.

Da bismo istražili obrasce temporalne miRNA ekspresije u specifičnoj regiji mozga, koristili smo dobro okarakteriziran in vivo model miša s prionskim sojem M1000 koji je ljudski soj prilagođen mišu izolovan od pacijenta koji je umro od GSS 11,12. Ovi zaraženi miševi razviju prve znakove neuropatologije nakon srednjeg perioda inkubacije, 13 sedmica nakon inokulacije (wpi), u talamusu i hipokampusu koji se širi na okcipitalni korteks i moždano stablo od 14 wpi sa M1000-prionima 3 . U ovoj studiji, regija mozga talamusa je sakupljena od miševa zaraženih M1000 i korištena za profiliranje miRNA u vremenskim tačkama koje predstavljaju pretklinički stadij bolesti (3 i 13 wpi, prion M1000 inficiran 3. sedmica (n = 6), sedmica 13 (n = 5) i nezaražena sedmica 3 (n = 6), sedmica 13 (n = 6)) za identifikaciju mogućih pretkliničkih miRNA markera. Poređenja radi, tkiva su takođe sakupljena u kliničkom stadiju pri čemu zaraženi miševi pokazuju simptome (20 wpi, terminal, terminal inficiran prionom M1000 (n = 6) i neinficirani terminal (n = 5)). Osim toga, da bismo identificirali potencijalne pretkliničke biomarkere bazirane na krvi za sCJD, također smo profilirali EV-e izolovane iz odgovarajućeg seruma kako bismo identificirali vremenski odnos između promjena ekspresije miRNA u talamusu i serumskih EV-a tokom bolesti i kako su te promjene uključeni u patogenezu prionskih bolesti. Serumski biomarkeri bi se mogli koristiti za razvoj metode za praćenje faze progresije bolesti kod pacijenata sa sCJD i pomoć u terapijskom tretmanu i ispitivanjima.

Statistički značajna miRNA identificirana u modelu zaraženog miša M1000 u pretkliničkim i kliničkim vremenskim tačkama odabrana je za validaciju u skupu ljudskih kliničkih uzoraka prikupljenih od pacijenata sa sCJD i kontrola. Prionske bolesti uključuju tri oblika: sporadične, porodične i stečene infekcijom koja može imati različite patološke karakteristike. Dok period inkubacije ili pretklinički period može biti dug (do četiri decenije), sCJD može vrlo brzo napredovati nakon kliničke dijagnoze. Kodon 129 gena za prionski protein (PRNP) je mjesto uobičajenog polimorfizma metionin (M)/valin (V) koji je povezan s određenim fenotipovima ljudskih prionskih bolesti kao što je sCJD. U kavkaskoj populaciji, 52% pojedinaca je M homozigot (MM), 36% je heterozigot (MV) i 12% je V homozigot (VV) 13 . Prosječni početak bolesti kod onih koji su MM homozigotni ili MV heterozigotni je 65 godina, a prosječno kliničko trajanje je četiri mjeseca sa rasponom od 1-18 mjeseci. Uočeno je da oni koji su V homozigoti imaju kliničko trajanje od 3-18 mjeseci, pri čemu je srednja dob početka između 41 i 81 godine (pregledano u ref. 14).

Neinvazivni test krvi bio bi neprocjenjiv alat za sCJD jer je obično teško i rijetko stanje za dijagnosticiranje. Pacijentima se često postavlja pogrešna dijagnoza zbog loših kliničkih mjera i nedostatka efikasnih sistemskih terapija lijekovima. Paneli miRNA identificirani u ovoj studiji identificirali su potencijalne biomarkere za ranu dijagnozu i poboljšanje ishoda pacijenata sa sumnjom na sCJD (brzo progresivnu demenciju) koja ima kratko kliničko trajanje.


Rezultati i diskusija

Kanonska miRNA ciljna mjesta funkcionišu prvenstveno u Drosophila 3′ UTR

Da bismo prikupili skupove podataka pogodne za kvantitativnu analizu ciljanja miRNA u ćelijama muva, pratili smo promjene u nivoima mRNA nakon ko-transfekcije S2 ćelija sa jednim od šest različitih miRNA dupleksa i plazmidom koji kodira zeleni fluorescentni protein (GFP). Šest transficiranih miRNA (miR-1, miR-4, miR-92a, miR-124, miR-263a i miR-994) su odabrane jer one (ili srodne miRNA u istoj porodici sjemena) nisu bile endogeno eksprimirane u S2 ćelije [8], i imale su različite identitete početnih nukleotida, raspon GC sadržaja unutar svog sjemena i umjeren do visok raspon predviđenih obilja ciljnog mjesta. Nakon obogaćivanja za transficirane, GFP-pozitivne ćelije sortiranjem ćelija aktiviranim fluorescencijom (FACS), izvršen je mRNA-seq i izračunate su promene nabora mRNA za svaki uslov transfekcije miRNA u odnosu na lažnu transfekciju, u kojoj je GFP plazmid transficiran bez bilo koji miRNA duplex (Dodatna datoteka 1: Tabela S1). Zatim smo normalizirali podatke kako bismo smanjili skupne efekte (Dodatna datoteka 2: Slika S1A-D), od kojih su neki pripisani skromnoj, ali statistički značajnoj derepresiji predviđenih ciljeva visoko eksprimiranih endogenih miRNA, kao što je bantam miRNA (Dodatna datoteka 2: Slika S1E–G) [50, 51]. S ovim novim skupom podataka počinjemo istraživati ​​karakteristike ciljnih mjesta miRNA koje su u korelaciji s represijom mRNA u stanicama Drosophila.

Kod sisara, prisustvo A nasuprot prvog nukleotida miRNA je preferencijalno očuvano i korelira sa pojačanom represijom, bez obzira na identitet prvog nukleotida miRNA – zapažanja koja se objašnjavaju džepom unutar ljudskog Argonaute2 (hsAGO2) koji se prvenstveno vezuje ovo A [34, 37, 39, 52]. Kod muva, A na ovoj poziciji ciljnog mjesta je također povezan s poboljšanom očuvanošću u poređenju sa inače identičnim mjestima kojima nedostaje ovaj A [20], dok je kod nematoda očuvanje i efikasnost mjesta sa savršenim uparivanje miRNA nukleotida 2-8 praćeno a U (8mer-U1 mjesta) liči na 8mer-A1 mjesta [20, 53, 54]. Stoga smo ispitali utjecaj nukleotida na ciljnoj poziciji 1 kod muva, uzimajući u obzir podatke iz svih transfekcija miRNA zajedno objedinjene. Od mRNA koje posjeduju jedno podudaranje s miRNA nukleotidima 2-8 u svom 3' UTR, one sa A suprotnim položajem miRNA 1 (tj. one sa 8mer-A1 mjestom) imaju tendenciju da budu više potisnute od onih sa svakim od drugog. tri mogućnosti suprotne miRNA poziciji 1 (8mer-C1, 8mer-G1, i 8mer-U1, respektivno), s tim da identitet ostale tri mogućnosti imaju mali uticaj na represiju (slika 1a). Kao što se i očekivalo na osnovu zapažanja da je prva pozicija vodeće RNK zakopana unutar Argonaute i nedostupna za uparivanje [52, 55, 56], ovo zapažanje se općenito drži kada se razmatra svaka transfekcija miRNA nezavisno, bez obzira na to da li je identitet prvog nukleotida miRNA je U (Dodatni fajl 2: Slika S2). Tako Drosophila pokazuje preferenciju za A na ciljnoj poziciji 1 koja liči na onu kod sisara, što implicira da je ovaj ciljni nukleotid prepoznat džepom unutar dmAgo1 koji liči na onaj kod hsAGO2. S obzirom na nomenklaturu, ovi rezultati dodatno podržavaju razmatranje 8mer-A1 mjesta kao kanonskog 8mer mjesta Drosophile, kao što je prvobitno učinjeno kod sisara [34].

Drosophila miRNA posreduju u represiji mRNA kroz ciljanje kanonskih tipova mjesta, prvenstveno u 3' UTR. a Povećana efikasnost kod Drosophila lokacija sa A preko puta miRNA pozicije 1. Prikazan je odgovor mRNA na transfekciju miRNA (bilo miR-1, miR-4, miR-92a, miR-124, miR-263a, ili miR-994). Podaci su objedinjeni u ovih šest nezavisnih eksperimenata. Prikazane su kumulativne distribucije promjena nabora mRNA uočene nakon transfekcije miRNA za mRNA koje su sadržavale jedno mjesto naznačenog tipa u odnosu na transficiranu miRNA. Uspoređeni tipovi mjesta su 8mera koji savršeno odgovaraju pozicijama miRNA 2-7 i imaju specificirani nukleotid (A, C, G ili U) preko puta pozicije 1 miRNA. Također je ucrtana za poređenje kumulativna distribucija promjena nabora mRNA za mRNA koje nisu sadržavale kanonsko mjesto od 7 ili 8 nt u odnosu na transficiranu RNK u njihovom 3′ UTR (bez mjesta). Sličnost distribucija koje sadrže lokaciju sa distribucijom bez lokacije testirana je jednostranim Kolmogorov-Smirnov (K-S) testom (P vrijednosti). U zagradama su prikazani brojevi mRNA analiziranih u svakoj kategoriji. b Šest kanonskih tipova mjesta za koje je otkriven signal za potiskivanje nakon transfekcije miRNA u ćelije Drosophila. ce Efikasnost kanonskih tipova lokacija uočenih u Drosophila 3′ UTRs (c), ORF (d), i 5′ UTRs (e). Ovi paneli su kao u a, ali uporedite distribucije promjene nabora za mRNA koje posjeduju jedno kanonsko mjesto u naznačenom području s onima bez kanonskih mjesta u cijeloj mRNA. Vidi i Dodatni fajl 2: Slike S1 i S2

Analogne analize vrednosti promene nabora mRNA u sistemima sisara pokazale su funkciju i relativnu efikasnost 8mer, 7mer-m8, 7mer-A1, 6mer i ofset 6mer mesta [37, 57]. U skladu s tim, ispitali smo funkciju ovih tipova mjesta u Drosophili, ponovo objedinjavajući podatke i fokusirajući se na mRNA s jednim mjestom na srodnoj miRNA. Također smo razmotrili šesti tip mjesta, 6mer-A1 mjesto, koje podrazumijeva funkciju u nematodama [20] i kompletira skup svih mogućih 8-, 7- i 6-nt savršenog podudaranja sa 8-nt semenskom regijom, koje nazivamo kanonskim tipovima lokacija (Slika 1b primjećuje razliku između 6-nt sjemena i 8-nt regije sjemena). Kada se nalazi u kontekstu 3′ UTR-a, svaki kanonski tip lokacije je bio povezan sa represijom, sa veličinom potiskivanja koja slijedi hijerarhiju 8mer > 7mer-m8 > 7mer-A1 > 6mer

6mer-A1 (slika 1c), kao što je prikazano iz statističkog testiranja razlika u distribucijama promjene nabora (Dodatna datoteka 3: Tabela S2). Ova hijerarhija ličila je na hijerarhiju sisara, osim što je kod sisara efikasnost različitih 6-nt mjesta mnogo izraženija, sa 6mer > offsetom 6mer > 6mer-A1, a sa 6mer-A1 je teško razlikovati od pozadine [37, 57 ].

Također smo ispitali efikasnost kanonskih mjesta u mRNA regijama izvan 3′ UTR. Određena represija je uočena za mRNA sa mjestom u njihovom otvorenom okviru za čitanje (ORF) (i bez kanonskog mjesta drugdje u mRNA), najuvjerljivije za 8mer mjesta, iako je efikasnost ovih mjesta bila mnogo manja od one uočene u 3′ UTR. (Sl. 1d). Ova zapažanja su u skladu s onima kod sisara [37, 58, 59]. Za razliku od zapažanja kod sisara, međutim, represija je uočena i za mRNA sa 8mer mjestom u njihovom 5′ UTR (slika 1e). Uzimajući ove nalaze zajedno, zaključujemo da ciljanje miRNA kod muva liči na ciljanje sisavaca, osim što je efikasnost tri kanonska mjesta od 6-nt ujednačenija kod muva i represija endogenih mRNA lakše se detektuje u 5′ UTR muva.

Široko rasprostranjena konzervacija kanonskih miRNA ciljnih mjesta u Drosophila UTR

Prethodna evolucijska analiza ciljnih mjesta miRNA kod sisara pružila je okvir za procjenu vjerovatnoće da su predviđena ciljna mjesta miRNA sačuvana među vrstama, uz kontrolu faktora kao što su različita srodnost vrsta, diferencijalna pozadinska konzervacija u UTR-ima i diferencijalne stope supstitucija dinukleotida [57 ]. Iako je ovaj pristup primijenjen i na genome Drosophila [20], poboljšali smo ga i proširili (1) ažuriranjem očuvanih klasifikacija porodice miRNA i 3′ UTR anotacija, (2) korištenjem proširenog evolucijskog stabla koje uključuje dodatne vrste insekata, (3 ) proširenje analiza na Drosophila 5′ UTR, (4) korištenje modificiranog cevovoda evolucijske analize [51], i (5) poređenje naših evolucijskih rezultata s našim funkcionalnim podacima. U tom cilju, sastavili smo miRNA napomene iz više studija [8, 10, 11, 15] i klasificirali 91 miRNA porodicu kao široko očuvanu među vrstama Drosophila, od kojih je 29 sačuvano od posljednjeg bilateralnog pretka (Dodatna datoteka 4: Tabela S3 ). Također smo izdvojili višestruka poravnanja sekvenci koja odgovaraju anotiranom D. melanogaster 5′ UTR i 3′ UTR, dodjeljujući svaki UTR jednom od pet binova na osnovu njegovih pozadinskih stopa očuvanja UTR [20]. Za svaku kantu smo izračunali filogenetska stabla s fiksnom topologijom stabla vrsta koja je obuhvatala 27 vrsta insekata, omogućavajući promjenjive dužine grana kako bi se uhvatile sporije ili brže stope zamjene među UTR-ovima kante (slika 2a). Ova stabla su zatim korištena za dodjelu bodova dužine grane (BLS) [17] svakom pojavljivanju motiva u D. melanogaster UTR, koji su kvantifikovali stepen očuvanosti te pojave uz kontrolu stope pozadinske konzervacije njenog ukupnog UTR konteksta [57]. Na primjer, pojava motiva otkrivena među svim vrstama Sophophora u 3′ UTR poravnanju bi dobila BLS od 4,50, 2,53 ili 1,69, ovisno o tome da li je odgovarajući 3′ UTR u kojem je boravio u prvom, trećem ili peta konzerva respektivno (slika 2a).

Evolucijska konzervacija kanonskih mjesta u Drosophila 5′ UTR i 3′ UTR. a Filogenetsko stablo od 27 vrsta korištenih za ispitivanje očuvanja mjesta miRNA. Izvan grupe roda Drosophila uključiti Musca domestica (kućna muva), Anopheles gambiae (komarac), Apis mellifera (evropska medonosna pčela), i Tribolium castaneum (crvena brašna buba). D. melanogaster 3′ UTR su dodijeljeni jednom od pet konzervacijskih spremnika na osnovu medijane konzervacije nukleotida u cijelom 3′ UTR. Stablo je nacrtano koristeći dužine grana i topologiju prijavljene iz poravnanja u cijelom genomu u UCSC Genome Browseru. Lijevo od stabla su kodirana bojama rezultati dužine grana koji odgovaraju lokalitetu očuvanom među cijelom podgrupom vrsta označenom trakom iste boje, prikazujući rezultate za lokaciju unutar 3′ UTR u najnižim, srednjim i najvišim konzervacionim korpama, označenim u zagradama kao kante 1, 3, odnosno 5. b, c Odnosi signala i pozadine za naznačene tipove lokacija pri rastućim granicama dužine grana, izračunati za lokacije koje se nalaze u 3′ UTR (b) ili 5′ UTRs (c). Prekinute linije pokazuju 5% niže granice pouzdanosti (z-test). Ovi paneli su modelirani prema onom koji je prvobitno prikazan za analizu 3′ UTR lokacija sisara [57]. d, e Signal iznad pozadine za naznačene tipove lokacija pri rastućim granicama dužine grana, izračunat za lokacije koje se nalaze u 3′ UTR (d) ili 5′ UTRs (e). Prekinute linije pokazuju 5% niže granice pouzdanosti (z-test). Ovi paneli su modelirani prema onom koji je prvobitno prikazan za analizu 3′ UTR lokacija sisara [57]. f Omjeri signal-pozadina za 8mer mjesta 91 očuvane porodice sjemena miRNA, izračunati na skoro optimalnoj osjetljivosti (granična vrijednost dužine grane od 1,0), upoređujući omjere uočene za mjesta u 5′ UTR sa onima za lokacije u 3′ UTR (rs Spearmanova korelacija). Porodice sjemena sačuvane od predaka bilaterijskih životinja razlikuju se od onih koje su se pojavile u novije vrijeme (narandžasta i plava, odnosno). Boxplots na stranama prikazane su distribucije omjera za ova dva skupa porodica, sa statističkom značajnošću za razlike u ovim distribucijama procijenjenim korištenjem jednostranog Wilcoxon testa sume ranga (*P < 0,01). Vidi također Dodatni fajl 4: Tabela S3. g Odnos između stope očuvanja lokacije i efikasnosti potiskivanja. Udio lokacija sačuvanih iznad pozadine izračunat je kao ([Signal – Background]/Signal) na granici dužine grane od 1,0. Minimalni udio lokacija koje daju destabilizaciju određen je iz kumulativnih distribucija (npr. one u Dodatnoj datoteci 2: Slika S2), uzimajući u obzir maksimalni vertikalni pomak od distribucije bez lokacije (trake greške, standardna devijacija, n = 6 miRNA). Boje i oblici predstavljaju kanonske tipove lokacija i UTR lokaciju, respektivno. Ovaj panel je modeliran prema onom koji je prvobitno prikazan za analizu 3′ UTR lokacija sisara [57]. h Odnos između efikasnosti lokacije i lokacije PCT. mRNA su odabrane tako da imaju ili jedno 7mer-A1, jedno 7mer-m8 ili jedno 8mer 3′ UTR mjesto na transficiranoj miRNA i nijedno drugo kanonsko 3′ UTR mjesto. mRNA sa mjestima svakog tipa grupirane su u šest jednakih binova na osnovu mjesta PCT. Za svaki bin, srednja promjena nabora mRNA u podacima o transfekciji (trake greške, standardna greška) je ucrtana u odnosu na srednju vrijednost PCT, sa isprekidane linije pokazujući najmanji kvadrati koji odgovaraju podacima. Nagibi za svaki su negativni i značajno se razlikuju od nule (P vrijednost < 10 − 10 , linearna regresija korištenjem nevezanih podataka)

Za svaki tip lokacije svake od 91 široko očuvane porodice miRNA, izračunali smo "signal" kao broj puta kada se ta lokacija pojavila u D. melanogaster UTR i imali su BLS koji je bio jednak ili nadmašio određenu vrijednost (tj. „granična dužina grane“). Paralelno, izračunali smo i „pozadinu“ kao broj očuvanih pojavljivanja očekivanih slučajno, na osnovu srednjeg udjela očuvanih instanci motiva za 50 usklađenih dužina k-mer kontrole, od kojih je predviđeno da svaka ima pozadinu očuvanja koja liči na onu miRNA mjesta, kako je procijenjeno na osnovu agregiranih stopa očuvanja dinukleotida [57]. Ovo nam je omogućilo da izračunamo omjer signala i pozadine na svakom graničnom dijelu dužine grane, što je predstavljalo procijenjeno obogaćivanje preferencijalno očuvanih miRNA mjesta u UTR-ovima muva (sl. 2b i c). To nam je također omogućilo da izračunamo signal iznad pozadine, koji je predstavljao procijenjeni broj miRNA mjesta koja su preferencijalno konzervirana u UTR muva (sl. 2d i e).

Kao što se očekivalo, omjeri signal-pozadina su se povećavali kako su evolucijski kriteriji očuvanja postali stroži, s 8mera u 3′ UTR-ima koji su dostigli omjer od skoro pet očuvanih mjesta za svako kontrolno mjesto na većim granicama dužine grana (slika 2b ). Za svaki tip lokacije, omjeri su bili konstantno veći u 3′ UTR nego što su bili u 5′ UTR (sl. 2b i c). Na primjer, u 5′ UTR omjer signala i pozadine za 8mera nije premašio 1,6 (slika 2c). Ovi rezultati su pokazali da je veća vjerovatnoća da će lokacije biti očuvane ako se nalaze u 3′ UTR-ovima, vjerovatno zato što su tu i učinkovitije (Slika 1). Ipak, kada se uporede omjeri signal-pozadina za različite porodice miRNA, omjeri u 5′ UTR su korelirali sa onima u 3′ UTR (Slika 2f Dodatni fajl 4: Tabela S3). Najveći omjeri su imali tendenciju da budu za porodice miRNA muva koje su bile očuvane od predaka bilateralnih životinja (slika 2f), kao što se moglo očekivati ​​za ove drevne porodice koje su imale više vremena da steknu više uloga u mrežama regulacije gena.

Iako je hijerarhija signala i pozadine očuvanja sekvence 8mer > 7mer > 6mer uočena i u 5′ i 3′ UTR odgovara hijerarhiji uočenoj za efikasnost, uočene su neke razlike. Najvažnije je da je signal očuvanja za 6mer lokaciju bio snažno iznad pozadine, dok su se oni za offset 6mer i 6mer-A1 mjesta nisu mogli razlikovati od pozadine (slika 2b), iako su ova tri 6-nt mjesta imala sličnu efikasnost u našem podaci o represiji (slika 1c). Suprotno tome, 5′ UTR 7mer-A1 mjesto je pokazalo detektabilan signal za konzervaciju (slika 2b), iako nije imalo uočljivu efikasnost u posredovanju u potiskivanju (slika 1c).

Za lokacije u 3′ i 5′ UTR, signal iznad pozadine dostigao je vrhunac blizu granice dužine grane od 1,0 (slika 2d). Na ovom i drugim granicama dužine grana, signal iznad pozadine bio je daleko veći u 3′ UTR nego u 5′ UTR (sl. 2d i e), što se može pripisati i većem udjelu lokacija preferencijalno očuvanih u 3′ UTR, kao što je naznačeno višim omjerom signal-pozadina u 3′ UTR, i više lokacija koje se nalaze u 3′ UTR, uglavnom posljedica toga što su 3′ UTR općenito duži od 5′ UTR. Uključujući tipove lokacija čiji su intervali pouzdanosti od nižih 5% premašili nulu, naši rezultati su dali procjenu

12.285 lokacija sačuvano iznad pozadine u 3′ UTRs (2738 ± 31 8mer, 2837 ± 68 7mer-m8, 4062 ± 100 7mer-A1, 2128 ± 221 6mer lokacija, i 520 ± 100 6mer lokacija, i 520 ± 6mer offset na granu 520 ± 44 s, odmak ± 6-g s od 1,0 i prijavljen ±90% interval pouzdanosti) (slika 2d). Kada se doda našoj procjeni od

840 lokacija očuvanih iznad pozadine u 5′ UTR (350 ± 18 8mer, 165 ± 46 7mer-m8 lokacija i 325 ± 44 7mer-A1 lokacija) (Slika 2e), procijenjeni broj preferencijalno očuvanih UTR lokacija u UTR Drosophila ukupno

13,125. Simulacije koje su razmatrale sve očuvane primjere tipova lokaliteta, a zatim i one za koje je procijenjeno da su konzervirane slučajno u 5′ UTR i 3′ UTR, pokazale su da se ovih 13.125 preferencijalno očuvanih lokacija nalazi unutar 5035 ± 83 (90% pouzdanosti interval) od 13.550 jedinstvenih mRNA sa označenim UTR-ovima Drosophile, što implicira da su mRNA iz 37,2% ± 0,6% gena Drosophile konzervirane mete široko očuvanih miRNA.

Dodatno poređenje rezultata iz naših analiza očuvanja lokacije i efikasnosti lokacije otkrilo je da, kao što je uočeno za 3′ UTR lokacije sisara [57], postoji upečatljiva korelacija između udjela lokacija sačuvanih iznad pozadine za svaki tip lokacije i odgovarajuće frakcije mjesta koja posreduju u destabilizaciji mRNA (slika 2g). Malo odstupaju od ovog trenda nalazišta 3′ UTR 6mer-A1, za koja se činilo da posreduju u određenoj represiji uprkos nedostatku signala za očuvanje, i 5′UTR 7mer-A1 lokacije, koja su imala skroman signal za očuvanje uprkos neprimetnoj efikasnosti potiskivanja (Sl. 2g).

Da bismo procijenili stepen do kojeg je svaka od tri najefikasnija mjesta preferencijalno očuvana, izračunali smo vjerovatnoću očuvanog ciljanja (PCT) rezultat za svaku od 8mer, 7mer-m8 i 7mer-A1 lokacija koje se nalaze u D. melanogaster 3′ UTRs. PCT rezultati, koji se kreću od 0 do 1, sažimaju procijenjenu vjerovatnoću da je određeno mjesto evolucijski očuvano zbog svog uparivanja sa srodnom miRNA, dok kontroliraju druge faktore, kao što su njena dužina, okolni genomski kontekst i sadržaj dinukleotida [57 ]. Ovi rezultati pružaju vrijedan resurs za biologe koji se žele fokusirati na očuvane interakcije ciljanja. Oni također mogu pomoći u predviđanju efikasnosti ciljanja [51, 57]. Zaista, stranice sa većim PCT rezultati su imali tendenciju da daju više potiskivanja (Slika 2h), što implicira da je očekivano da će konzervirana mesta verovatnije boraviti u kontekstu koji je favorizovao njihovu efikasnost.

Značajke korisne za predviđanje efikasnosti lokacije kod muva

Pre nego što smo počeli da istražujemo karakteristike konteksta lokacije povezane sa efikasnošću lokacije, poboljšali smo 3′ UTR napomene u S2 ćelijama, ćelijskoj liniji u kojoj smo dobili naše funkcionalne podatke. Mi smo zaključili da bi nam preciznije označavanje ovih UTR-ova omogućilo da smanjimo uticaj lažno pozitivnih lokacija uz odgovarajuće ponderisanje lokacija prema učestalosti njihovog uključivanja u 3' UTR izoforme [51, 60]. Poznavanje brojnih alternativnih 3′ UTR izoforma za mRNA gena bi takođe pružilo informiraniju procjenu karakteristika povezanih s 3′ UTR, kao što su 3′ UTR dužina i udaljenost od najbližeg 3′ UTR kraja. U skladu s tim, identificirali smo i kvantificirali 3′ UTR izoforme S2 ćelija korištenjem poli(A)-položajnog profiliranja sekvenciranjem (3P-seq) [20]. Iako je većina 3P-seq podržanih poli(A) lokacija odgovarala ili 3′ UTR izoformama koje su prethodno bile označene od strane FlyBase ili velike studije koja je označila dodatna poli(A) mjesta [61], gotovo 47% od 3P-seq podržanih poli(A) lokacija nisu odgovarale postojećim napomenama, a većina ovih novih mjesta mogla bi biti povezana sa obližnjim genom uz podršku RNA-seq dokaza (slika 3a). U slučajevima u kojima se najduža 3′ UTR izoforma za gen označen pomoću 3P-seq razlikuje od one označene u FlyBase, ona je češće bila duža, iako su za skoro 1000 gena rezultati 3P-seq implicirali dominantnu upotrebu kraćeg 3′ UTR izoforma u S2 ćelijama (slika 3b). Koristeći ove informacije, sastavili smo skup od 3826 mRNA koje su prešle naš prag ekspresije u S2 ćelijama i za koje ≥ 90% oznaka 3P-seq odgovara jednoj dominantnoj 3′ UTR izoformi u ovim ćelijama, i koristili smo ovaj skup za istražiti karakteristike konteksta stranice povezane s efikasnošću stranice.

Prečišćavanje 3′ UTR napomena u S2 ćelijama i razvoj regresijskog modela koji predviđa efikasnost ciljanja miRNA u Drosophila. a Poli(A) lokacije otkrivene u S2 ćelijama pomoću 3P-seq, klasificirane u odnosu na njihov prethodni status napomene. b Proširenje i kontrakcija najdužih 3′ UTR izoformi u odnosu na FlyBase napomene. Za svaki gen s poli(A) mjestom otkrivenim korištenjem 3P-seq, razlika između najduže 3′ UTR izoforme označene korištenjem 3P-seq upoređena je s najdužom 3′ UTR izoformom označenom na FlyBase. Ove razlike su zatim grupisane kao što je naznačeno i ucrtan je broj lokacija dodeljenih svakoj kanti. c Optimizacija bodovanja predviđenog 3′ suplementnog uparivanja kod muva. Predviđeni rezultati termodinamičke energije izračunati su za uparivanje između 9-nt regije uzvodno od kanonskih 7-8-nt 3′UTR mjesta i regije promjenjive dužine miRNA s naznačenom veličinom (veličinom prozora) koja je započela na naznačenoj poziciji miRNA. The toplotna karta prikazuje djelimične korelacije između ovih rezultata i potiskivanja povezane s odgovarajućim lokacijama, utvrđene tokom kontrole za tip lokacije. d Optimizacija bodovanja predviđene strukturne pristupačnosti kod muva. Predviđeni rezultati strukturne pristupačnosti RNK izračunati su kao prosječne vjerovatnoće uparivanja za regije promjenjive dužine (veličine prozora) koje su centrirane na naznačenoj poziciji mRNA, prikazane u odnosu na podudarnost sjemena svakog kanonskog 7-8-nt 3′ UTR mjesta. The toplotna karta prikazuje djelimične korelacije između ovih vrijednosti i potiskivanja povezanih s odgovarajućim lokacijama, utvrđenih tokom kontrole za tip lokacije. e Doprinos tipa lokacije i svake od šest karakteristika kontekstnog modela. Za svaki tip lokacije, koeficijenti za višestruku linearnu regresiju su iscrtani za svaku karakteristiku. Budući da je svaka karakteristika ocijenjena na sličnoj skali, relativni doprinos svake karakteristike u razlikovanju više ili manje efektivnih lokacija bio je otprilike proporcionalan apsolutnoj vrijednosti njenog koeficijenta. Takođe su ucrtani presretnuti slučajevi, koji otprilike ukazuju na diskriminatornu moć tipa lokacije. Barovi naznačiti intervale pouzdanosti od 95% svakog koeficijenta. Pogledajte i Dodatni fajl 2: Tabela S4, Tabela S5 i Slika S3A

S ovim skupom mRNA i vrijednostima represije u ruci, ispitali smo dvije složenije karakteristike konteksta mjesta, potvrđujući njihove efekte na ćelije Drosophila i razvijajući sheme bodovanja koje su najbolje korelirale s njihovim utjecajem na ove stanice. Prva od ove dvije karakteristike bilo je 3′ suplementarno uparivanje, tj. uparivanje sa metom miRNA nukleotida izvan regije sjemena. Snaga ovog uparivanja je procijenjena kao predviđena termodinamička energija uparivanja između 3′ regije miRNA i odgovarajuće regije mRNA uzvodno od poklapanja sjemena. Ova predviđena energija uparivanja procijenjena je za mRNA koje posjeduju jedno 7-8-nt 3' UTR mjesto za transficiranu miRNA, a zatim upoređena sa represijom uočenom za mRNA nakon transfekcije miRNA izračunavanjem djelomične korelacije između 3' dodatnih energija uparivanja i promjene mRNA, kontrolirajući tip mjesta.

U ćelijama sisara, 3′ dopunsko uparivanje je najuticajnije kada je usredsređeno na nukleotide 13–17 [37], ali kod muva nisu identifikovane mogućnosti uparivanja koje su najbitnije za potiskivanje. Da bismo sistematski ispitali ove mogućnosti, mijenjali smo tri parametra: (1) početnu poziciju razmatrane miRNA regije, ispitujući sve početne mogućnosti od pozicija 9 do 19, (2) dužinu razmatrane miRNA regije, ispitujući dužine od 4 do 13 nt, i (3) dužina ciljne regije uzvodno od poklapanja sjemena, ispitujući dužine od 4 do 20 nt. Pretraživanje mreže po svim kombinacijama parametara otkrilo je da je predviđena energija 3′ dodatne energije uparivanja optimalno predviđala efikasnost represije kada je izračunata za uparivanje koje se može dogoditi između miRNA nukleotida 13-17 i 9-nt regije uzvodno od sjemena. podudaranje (slika 3c).

Druga karakteristika koju smo istraživali bio je uticaj 3′ UTR strukture na dostupnost ciljane lokacije. Ova karakteristika je prethodno procijenjena korištenjem dva pristupa, ili procjenom sastava nukleotida u blizini mjesta, s obrazloženjem da bi mjesta koja se nalaze u visokom lokalnom AU sadržaju bila pristupačnija [37], ili pokušajem predviđanja pristupačnosti mjesta korištenjem različitih algoritama za savijanje RNA [38, 51, 62, 63, 64, 65]. S obzirom na drugi pristup, metoda koja je prvobitno razvijena za predviđanje pristupačnosti ciljanog mjesta male interferirajuće RNK (siRNA) [62] čini se da je jedna od efikasnijih metoda za predviđanje pristupačnosti ciljnog mjesta miRNA kod sisara [51]. Ova metoda savija 80-nt regiju usredsređenu na poklapanje sjemena, a zatim izvještava o rezultatu strukturalne pristupačnosti (SA) izračunatom kao srednja neuparena vjerovatnoća za manji prozor u blizini poklapanja sjemena [51, 62]. Da bismo odredili optimalnu lokaciju i širinu ovog prozora za bodovanje SA kod muva, ponovo smo izračunali parcijalne korelacije, ovog puta između srednjih vjerovatnoća uparivanja i promjena mRNA, mijenjajući dva parametra: (1) položaj centra prozora unutar mete mRNA, ispitujući svaku poziciju unutar 20 nt od podudaranja sjemena, i (2) veličinu ovog prozora, uzimajući u obzir veličine od 1 do 25 nt. Mrežna pretraga svih kombinacija parametara pokazala je da je prozor od 25 nt usredsređen na nukleotid koji se uparuje na miRNA poziciju 7 bio optimalan za izračunavanje SA kod muva (slika 3d). Iako je optimalna veličina prozora pala na ivicu raspona, veći prozori nisu uzeti u obzir jer su bili skloniji širenju preko 3′ UTR granica, što je smanjilo veličinu uzorka.

Kvantitativni model za predviđanje efikasnosti lokacije kod muva

Da bismo identificirali i procijenili dodatne karakteristike povezane s efikasnošću lokacije kod muva i generirali resurse za postavljanje miRNA mušica u regulatorne mreže gena, razvili smo kvantitativni model efikasnosti ciljanja miRNA za muhe, koji je ličio na naše modele razvijene za sisare [37, 51, 66 ]. Manji obim našeg skupa podataka o mušicama nametnuo je neka ograničenja na karakteristike koje možemo ispitati kod muva, kao i na strategiju koja se koristi za obuku modela. Konkretno, broj primjera obuke bio je red veličine manji u skupu podataka o mušici u odnosu na skup podataka o ljudima. To je bilo zbog (1) manje skupova podataka o transfekciji male RNK u S2 ćelijama u poređenju sa onima dostupnim u HeLa ćelijama, (2) manjeg broja gena eksprimiranih u S2 ćelijama u poređenju sa onima eksprimiranim u HeLa ćelijama, i (3) kraće 3 ′ UTR kod muva, što je dodatno smanjilo broj 3′ UTR sa mjestom za miRNA od interesa. Stoga, nismo uzeli u obzir karakteristike povezane s identitetom sjemena miRNA, kao što je procijenjeno obilje ciljnog mjesta unutar transkriptoma, predviđena stabilnost uparivanja sjemena i identitet nukleotida na miRNA ili ciljnoj poziciji 8, od kojih je svaka informativna za predviđanje efikasnost ciljanja u ljudskim ćelijama [51, 66]. Štaviše, umjesto da razmatramo karakteristike za svaki tip web-mjesta nezavisno, obučili smo jedinstveni, objedinjeni regresijski model koji je smatrao sam tip stranice potencijalnom karakteristikom ciljanja. Osim tipa mjesta, sedam drugih karakteristika mjesta i njihovog okolnog konteksta i devet karakteristika ciljne mRNA smatrano je potencijalno informativnim o efikasnosti ciljanja, bilo zato što je prethodno pokazano da koreliraju s efikasnošću ciljanja kod muva ili sisara, ili jer su bile povezane sa karakteristikama koje su pokazale korelaciju sa efikasnošću (tabela 1).

Počevši od ovih karakteristika, obučili smo modele efikasnosti ciljanja koristeći različite algoritame mašinskog učenja. Da bismo procijenili svaki algoritam, podijelili smo naš skup podataka na 1000 početnih uzoraka kako bismo procijenili performanse predviđanja koje se čeka.Svaki uzorak je uključivao 70% mRNA sa jednim 7-8-nt 3′ UTR mjestom iz svakog eksperimenta transfekcije miRNA (nasumično odabranih bez zamjene), a preostalih 30% smo rezervirali za testiranje. Među različitim algoritmima, strategija postupne regresije koja je maksimizirala Akaike informacioni kriterijum (AIC) dovela je do najboljih empirijskih performansi (Dodatna datoteka 2: Slika S3A). Ova strategija postupne regresije bio je isti algoritam koji smo nedavno koristili za izgradnju modela efikasnosti ciljanja miRNA kod sisara [51]. U odnosu na model koji je uzeo u obzir samo tip lokacije (model „samo lokacija“), model postupne regresije koji je razmatrao karakteristike konteksta lokacije bio je dvostruko do trostruko poboljšan u predviđanju mjerenja promjene nabora mRNA (medijan r 2 od 0,08 i 0,19, respektivno P < 0,001, upareni Wilcoxonov test sa predznakom. Dodatni fajl 2: Slika S3A).

Na prvi pogled, an r 2 od samo 0,19 za najbolji algoritam može se činiti zabrinjavajućim, jer implicira da metoda čini samo 19% varijabilnosti uočene u našim skupovima podataka. Međutim, nijedan model ciljanja miRNA ne može objasniti varijabilnost koja proizlazi iz eksperimentalne buke ili sekundarnih efekata potiskivanja primarnih ciljeva, koji zajedno doprinose velikom dijelu varijabilnosti uočene u skupovima podataka o transfekciji miRNA. Zaista, naša analiza promjena uočenih za predviđene mete jedne miRNA kada je druga miRNA bila transficirana pokazala je da eksperimentalni šum i sekundarni efekti zajedno čine skoro polovinu varijabilnosti uočene u našim skupovima podataka, što implicira da bi savršen model direktnog ciljanja mogao objasniti na najviše 52% varijabilnosti (Dodatna datoteka 2: Slika S3B). Dakle, the r 2 od 0,19, što je ličilo na ono dobijeno u analizama sisara [51], impliciralo je da model objašnjava

37% varijabilnosti se može pripisati direktnom ciljanju.

Karakteristike koje su najinformativnije za model postupne regresije bile su vjerovatno one s najvećim utjecajem na efikasnost lokacije kod muva. Da bismo identificirali ove ključne karakteristike, kvantificirali smo postotak početnih uzoraka u kojima je svaka karakteristika odabrana (Tabela 1). Sedam od 17 karakteristika odabrano je u ≥ 90% početnih uzoraka (Tablica 1), a modeli višestruke linearne regresije obučeni sa samo ovih sedam karakteristika su bili najmanje dobri kao i oni koji su uzimali u obzir svih 17 karakteristika (medijan r 2 od 0,20 Dodatni fajl 2: Slika S3A). Osim tipa lokacije, koji se dugo razmatra u TargetScanFly [8], ove robusno odabrane karakteristike uključuju tri karakteristike lokacije: energiju 3′ dodatnog uparivanja (3P_energy), SA i evolucijsko očuvanje (PCT) i tri karakteristike mRNA: dužina ORF (len_ORF), 3′ UTR dužina (len_3UTR) i broj slabih mjesta unutar mRNA (other_sites) (tabela 1). Značajno je da su sve ove karakteristike prethodno odabrane prilikom modeliranja efikasnosti mjesta kod sisara [51], s nijansom da je kod muva 3P_energy nadmašio 3P_score, drugu metodu evaluacije 3′ dopunskog uparivanja koja je optimizirana na podacima o sisarima [37]. Međutim, dvije karakteristike koje su snažno povezane s djelotvornošću mjesta kod sisara nisu bile dosljedno odabrane u analizi muha. Ovo uključuje sastav AU u blizini ciljne lokacije (local_AU) i minimalnu udaljenost lokacije od 3′ UTR granica (min_dist) [37]. Možda ove karakteristike nisu snažno razlikovale efikasne mete od neefikasnih kod muva jer su u poređenju sa 3′ UTR sisara, muhe 3′ UTR konstitutivno bogatije AU i mnogo kraće. (Srednja dužina 3′ UTR je 661 nt odnosno 202 nt za ljude i muhe, s obzirom na najdužu UTR napomenu po genu nakon uklanjanja gena s najdužim UTR napomenama ≤2 nt.)

Koristeći sedam dosljedno odabranih karakteristika i cijeli skup podataka od 3′ UTR-a koji sadrže pojedinačne 7mer-A1, 7mer-m8 ili 8mer lokacije, obučili smo nezavisne modele višestruke linearne regresije za svako od ova tri kanonska mjesta. Ova tri modela su zatim kombinovana da bi se generisao model za ciljanje miRNA muva, koji mi zovemo „model konteksta“ jer je ličio na naše kontekstualne modele razvijene za ciljanje miRNA sisavaca po tome što je modelovao kontekst lokacije pored tipa lokacije. Znak svakog koeficijenta otkriva odnos svake osobine prema potiskivanju (slika 3e). Na primjer, mRNA sa dužim ORF ili dužim 3′ UTR, i mjesta sa slabijom 3′ dodatnom energijom uparivanja bile su otpornije na represiju (što je naznačeno pozitivnim koeficijentom), dok su ciljna mjesta koja su bila strukturalno pristupačnija ili više očuvana, i mRNA s drugim slabim mjestima su bili skloniji potiskivanju (što je naznačeno negativnim koeficijentom). Normalizacija rezultata svake karakteristike na sličnu skalu omogućila je procjenu relativnog doprinosa svake karakteristike kontekstualnom modelu (slika 3e). Kao što se očekivalo, tip lokacije je takođe bio glavni prediktor potiskivanja u modelu, na šta ukazuje velika veličina termina presretanja (slika 3e). Znakovi i relativne veličine karakteristika su u velikoj mjeri paralelne onima pronađenim kod sisara [51], što ukazuje da bi utjecaj ovih karakteristika mogao odražavati evolucijski očuvane aspekte ciljanja miRNA kod bilateralnih vrsta. Jedna razlika je bila u tome PCT rezultati su relativno više doprinijeli kontekstualnom modelu muva nego analognom modelu sisara [51], što implicira da detekcija i bodovanje molekularnih karakteristika ciljane efikasnosti imaju više prostora za poboljšanje kod muva, vjerovatno zato što je manje podataka bilo dostupno za muhe. za identifikaciju i evaluaciju karakteristika.

Poređenje sa performansama prethodnih metoda

Zatim smo uporedili performanse modela konteksta muva sa prethodno prijavljenim metodama, mereći koliko je uspešno svaka metoda predvidela i rangirala mRNA koje reaguju na dobijanje ili gubitak miRNA u Drosophili. Za obuku, naš kontekstni model je uzeo u obzir samo mRNA koje su imale jedno 7-8-nt mjesto za srodnu miRNA unutar svog 3′ UTR, ali za testiranje ga je trebalo proširiti na mRNA koje su imale više mjesta na istoj miRNA unutar svog 3′ UTRs. U skladu s tim, za svaku predviđenu metu, generirali smo ukupni kontekstni rezultat, izračunat kao zbir rezultata konteksta lokacija prema srodnoj miRNA [37], i koristili ove ukupne rezultate konteksta za rangiranje svih predviđenih ciljeva za svaku miRNA. Odgovor najbolje rangiranih ciljeva je zatim upoređen sa odgovorom 14 ranije prijavljenih metoda, izabranih zato što su predviđanja za mete Drosophila bila dostupna na internetu, kao i informacije potrebne za rangiranje predviđanja. Nakon što je već generirao PCT rezultate Drosophila lokacija, također smo kombinirali rezultate višestrukih 7-8-nt kanonskih mjesta kada su prisutni unutar istih 3′ UTR-a da bismo generirali agregat PCT rezultati, koji su takođe korišćeni za rangiranje predviđanja zasnovanih isključivo na verovatnoći da su oni preferencijalno konzervirani ciljevi miRNA [57].

Poduzeli smo mjere opreza kako bismo izvršili pošteno poređenje algoritama. Prvo, za svaki algoritam smo uzeli u obzir samo predviđene ciljeve koji su odgovarali mRNA izraženim iznad praga kvantifikacije u relevantnom uzorku testnog skupa kojem nedostaje miRNA. Drugo, izbjegli smo testiranje kontekstnog modela na istim podacima o transfekciji na kojima je bio obučen. Konkretnije, implementirali smo strategiju unakrsne validacije kada smo testirali rezultate kontekstnog modela koristeći skupove podataka o transfekciji, uzastopno zadržavajući svaki skup podataka i ponovo obučavajući koeficijente za karakteristike u našem kontekstualnom modelu koristeći pet preostalih skupova podataka o transfekciji prije generiranja predviđanja za zadržani skup podataka. Dodatno umanjivanje zabrinutosti zbog prevelikog prilagođavanja bilo je zapažanje da većina najbolje rangiranih meta sadrži dvije ili više kanonskih 3′ UTR lokacija i stoga nisu korištene tokom razvoja i obuke našeg modela. Treće, za sva testiranja kontekstnog modela, koristili smo koeficijente preobučene na javno dostupnim FlyBase 3′ UTR anotacijama, s obrazloženjem da bi obuka o poboljšanim 3′ UTR anotacijama izvedenim iz naših 3P-seq podataka dala prednost našem modelu.

Još jedno ključno razmatranje za pošteno poređenje učinka predviđanja je izbor pristupa koji se koristi za procjenu učinka. Upotreba standardnih metoda za procjenu binarnog klasifikatora, kao što je kriva radne karakteristike prijemnika (ROC), nije prikladna iz nekoliko razloga. Prvo, za predviđanja miRNA cilja, ne postoji odgovarajući skup poznatih istinitih pozitivnih ili pravih negativnih, jer baze podataka validiranih ciljeva propuštaju mnoge stvarne ciljeve i snažno su pristrasne u korist algoritama predviđanja koji se koriste za identifikaciju ciljanih kandidata koji su tada validirano. U nedostatku odgovarajućih skupova poznatih pozitivnih i negativnih, ROC analize se mogu izvesti korištenjem molekularnih efekata poremećaja miRNA, ali ovaj pristup zahtijeva odabir praga za odvajanje mRNA koje reaguju od onih koje ne reaguju. Odabirom strogog praga propuštaju se mnogi autentični ciljevi, dok odabir manje strožeg praga koji ima šansu da uhvati većinu autentičnih ciljeva donosi previše lažnih pozitivnih rezultata. Problemi sa ROC krivuljama se povećavaju kada se pokušava uporediti performanse različitih algoritama, od kojih neki predviđaju 100 puta više ciljeva od drugih. Odabir granične vrijednosti visoke rigoroznosti ne čini pravdu algoritmima koji pružaju mnoga predviđanja s ciljem postizanja veće osjetljivosti predviđanja, dok je odabir niske granične vrijednosti nepravedan prema algoritmima koji pružaju relativno malo predviđanja u nastojanju da postignu bolje predviđanje. specifičnost. Štaviše, upotreba binarnog praga prikriva koliko precizno algoritmi rangiraju svoje predviđene ciljeve. Iz ovih razloga, preoblikovanje kvantitativnog fenomena ciljanja miRNA kao problema binarne klasifikacije nije prikladno, a pošteno poređenje performansi predviđanja koristeći ROC krivulje nije moguće.

Prepoznajući ove probleme, razvijen je novi pristup za procjenu performansi predviđanja miRNA cilja [67], koji smo prvo implementirali koristeći naših šest skupova podataka od kojih je svaki ispitivao promjene mRNA nakon transfekcije miRNA u S2 ćelije (slika 4a). Za svaki algoritam i svaku transficiranu miRNA, izračunali smo srednju promjenu puta mRNA za najbolje rangirane mete transficirane miRNA, a zatim nacrtali srednju vrijednost za šest različitih miRNA na različitim pragovima rangiranja, sumirajući na taj način efikasnost potiskivanja najbolje rangiranih mete na svakom pragu. Ovaj pristup dijagrama srednje represije preko raspona rangiranih pragova ima nekoliko ključnih karakteristika koje ga čine pogodnim za pošteno poređenje performansi predviđanja cilja: (1) Dizajniran je za testiranje performansi korištenjem globalnih molekularnih mjerenja i stoga ne zahtijeva poznavanje istinskih pozitivnih rezultata i pravi negativni, (2) koristi klizni prag i na taj način omogućava simultana poređenja na svim granicama strogosti, (3) njegov klizni prag je dobro prikladan za procjenu sposobnosti algoritama da rangiraju predviđene ciljeve (dato odnosom između srednje represije i prag strogosti).

Performanse različitih algoritama za predviđanje cilja kod muva. a Diferencijalna sposobnost algoritama da predvide mRNA koje najviše reaguju na miRNA transficirane u ćelije Drosophila. Prikazuje se za svaki algoritam u ključ su srednje promjene nabora mRNA uočene za najbolje rangirane predviđene mete, procijenjene preko kliznog praga osjetljivosti korištenjem šest skupova podataka o transfekciji miRNA. Neke metode, kao što je PicTar, koje su generirale relativno malo predviđanja, mogle bi se procijeniti na samo nekoliko pragova, dok bi se druge, kao što su RNA22 i TargetSpy, mogle procijeniti na mnogo više. Za svaki algoritam, predviđanja za svaku od šest miRNA su rangirana prema njihovim rezultatima, a srednje vrijednosti promjene nabora su ucrtane na svakom pragu osjetljivosti. Na primjer, na pragu od 16, identificirano je 16 najboljih predviđanja za svaku miRNA (ne uzimajući u obzir predviđanja za mRNA ekspresiju prenisko da bi se mogla precizno kvantificirati). Vrijednosti promjene nabora mRNA za ova predviđanja su prikupljene iz srodnih transfekcija, a srednje vrijednosti promjene nabora su izračunate za svaku transfekciju za koju prag nije premašio broj prijavljenih predviđanja. Zatim je nacrtana srednja vrijednost dostupnih srednjih vrijednosti. Također je prikazana srednja vrijednost srednjih promjena nabora mRNA za sve mRNA s najmanje jednim srodnim kanonskim mjestom od 7-8 nt u njihovom 3' UTR (isprekidana linija), srednja vrijednost promjene srednjeg nabora za sve mRNA s najmanje jednim očuvanim srodnim kanonskim mjestom od 7–8 nt u njihovom 3′ UTR (tačkasta linija) i interval pouzdanosti od 95% za promjene srednjeg puta nasumično odabranih mRNA, određen korištenjem 1000 ponovnih uzorkovanja (bez zamjene) na svakoj graničnoj vrijednosti (senčenje). Lokacije su smatrane očuvanim ako su njihovi rezultati dužine grana premašili graničnu vrijednost s omjerom signal:pozadina od 2:1 za odgovarajući tip lokacije (granične vrijednosti od 1,0, 1,6 i 1,6 za 8mer, 7mer-m8 i 7mer-A1 lokacije, odnosno sl. 2b). Navedeni su pragovi na kojima je distribucija promjena nagiba za predviđene ciljeve kontekstnog modela bila značajno veća od one kod bilo kojeg drugog modela (*, jednostrani Wilcoxonov test zbroja ranga, P vrijednost < 0,05). Vidi također Dodatni fajl 2: Slika S4. b Diferencijalna sposobnost algoritama da predvide mRNA koje najviše reaguju na izbacivanje miRNA kod muva. Prikazuje se za svaki algoritam u ključ su prosječne promjene nabora mRNA uočene za najbolje rangirane predviđene mete, procijenjene preko kliznog praga osjetljivosti korištenjem tri skupa podataka o nokautiranju. Inače, ovaj panel je kao u a. c i d Diferencijalna sposobnost algoritama da predvide ciljeve koji reaguju na miRNA uprkos nedostatku kanonskog 7-8-nt 3′ UTR mesta. Ovi paneli su kao u a i b, osim što prikazuju rezultate samo za predviđene ciljeve kojima nedostaje kanonsko mjesto od 7–8 nt u njihovom 3′ UTR. Rezultati za naš kontekstualni model i druge algoritme koji predviđaju samo ciljeve sa kanonskim 7–8-nt 3′ UTR lokacijama nisu prikazani. Umjesto toga, prikazani su rezultati za 6mer kontekstni model, koji uzima u obzir samo aditivne efekte 6mer, offset 6mer i 6mer-A1 lokacija i njihove odgovarajuće karakteristike konteksta. e i f Poteškoće u predviđanju mRNA koje reaguju na transfekciju ili nokaut miRNA uprkos nedostatku kanonskih 6-8-nt 3′ UTR mjesta. Ovi paneli su kao u c i d, odnosno, osim što prikazuju rezultate za mRNA sa 3′ UTR-ima kojima nedostaje kanonsko 6-8-nt mjesto

Primjenom ove analize performansi, otkrili smo da su svi algoritmi osim RNA22 slučajno predvidjeli potisnute mete bolje nego što se očekivalo (slika 4a). Međutim, neki, uključujući ComiR, PicTar, MinoTar, RNAhybrid, TargetSpy i mirSVR, imali su sličan ili lošiji učinak od naivne strategije odabira svih mRNA koje imaju barem jedno 7-8-nt kanonsko mjesto u svom 3′ UTR. Od prethodno prijavljenih algoritama, TargetScanFly, EMBL i PITA.Top su se najbolje pokazali. Ipak, naš kontekstni model je bio bolji od svih prethodnih metoda, dajući predviđanja koja su najviše reagirala na transfekciju miRNA na svakom testiranom pragu (slika 4a).

Iako je naša strategija unakrsne validacije izbjegla testiranje našeg modela na istim mjerenjima koja su korištena za njegovu obuku, neke zabrinutosti u vezi s testiranjem podataka o transfekciji su ostale, jer su ti podaci korišteni za optimizaciju bodovanja nekih karakteristika našeg modela. Štoviše, transfekcija uvodi visoke koncentracije miRNA u stanice u kojima one inače ne djeluju, što izaziva zabrinutost da model razvijen i testiran isključivo na skupovima podataka o transfekciji možda neće točno predvidjeti odgovor miRNA u njihovom endogenom fiziološkom kontekstu. Stoga smo tražili skup testova koji nije korišten za razvoj nijednog od algoritama i koji je pratio odgovor transkriptoma na endogene miRNA izražene na fiziološkim nivoima. Umjesto praćenja nove represije uočene nakon ektopičnog dodavanja miRNA, takav skup testova bi ispitao derepresiju uočenu nakon gubitka endogene miRNA. Istražujući literaturu o Drosophila, identificirali smo tri skupa podataka o nokautiranju miRNA sa uvjerljivim signalima za derepresiju. Objedinjavanje ovih skupova podataka, koji su pratili promjene mRNA nakon brisanja miR-14 [31], miR-34 [32] ili miR-277 [33], i provođenje iste vrste analize kao što smo uradili za skupove podataka o transfekciji ( ali praćenje derepresije nakon gubitka miRNA umjesto represije nakon uvođenja miRNA) otkrilo je performanse koje su općenito ličile na one uočene sa skupovima podataka o transfekciji (slika 4b). Relativne performanse prethodnih metoda su se donekle pomaknule, uz poboljšanje uočeno za Aggregate PCT, miRanda-MicroCosm i PicTar i uočeno pogoršanje za MinoTar, TargetScanFly i TargetSpy. Važno je, međutim, da se pri testiranju ovih posljedica endogenog ciljanja miRNA kod muva, kontekstualni model opet pokazao boljim od svih prethodnih modela. Rezultati za miR-277 bili su slični onima za druge dvije miRNA (podaci nisu prikazani), iako je miR-277 neobičan po tome što se primarno nalazi unutar Ago2, a ne Ago1 [2].

Korištenje promjene srednjeg puta za procjenu potiskivanja (ili derepresije) najbolje rangiranih ciljeva imalo je nekoliko potencijalnih ograničenja. Na primjer, može preuveličati utjecaj pojedinačnih odstupanja ili skupova podataka veće težine s većom varijansom u njihovim distribucijama promjene nabora. Ipak, ispitivanje dijagrama koji prikazuje srednju vrijednost promjena medijane mRNA nije bitno promijenilo našu procjenu relativne performanse svakog algoritma, što je pokazalo da nismo došli do pogrešnih zaključaka zbog odstupanja (Dodatna datoteka 2: Slika S4). Još jedno potencijalno upozorenje je da naši testni setovi koji gledaju na promjene mRNA mogu promašiti ciljeve koji su potisnuti samo na nivou translacije, bez promjena u stabilnosti mRNA.Iako je takva represija samo za translaciju široko rasprostranjena u ranim ribljim embrionima [68, 69], ispitivanje kasnijih embriona i postembrionalnih stanica i tkiva sisara nije uspjelo pronaći skup ciljeva koji su uvjerljivo regulirani samo na nivou translacije [69,70 ,71], i nemamo razloga da sumnjamo da takvi ciljevi postoje u postembrionalnim muvama. Takođe je potencijalno uticala na naša poređenja činjenica da su za neke prethodne algoritme nedostajala predviđanja za neke miRNA naših testnih skupova. Na primjer, EMBL predviđanja nisu bila dostupna za miR-263a i miR-994, a budući da su mete za ove dvije miRNA podvrgnute manjoj represiji u našim transfekcijama, testiranje EMBL-a samo na ostatku skupova podataka o transfekciji vjerovatno je povećalo njegovu relativnu učinkovitost .

Algoritmi za predviđanje cilja su razvijeni sa različitim prioritetima u pogledu tačnosti predviđanja. Zbog brige za specifičnost predviđanja, neki, uključujući naš kontekstni model, uzimaju u obzir samo predviđanja sa najefikasnijim tipovima lokacija, tj. 7-8-nt lokacija koje se podudaraju sa sjemenom unutar 3′ UTR. Nasuprot tome, drugi algoritmi, iz brige za osjetljivost predviđanja, ne ograničavaju svoja predviđanja na one s ovim najefikasnijim tipovima web lokacija, a neki od njih uključuju predviđanja s velikim nizom nekanonskih lokacija koje ne pokazuju dokaze efikasnosti kada se testiraju. koristeći podatke od sisara i riba [51]. Da bismo počeli da istražujemo kompromise ovih divergentnih prioriteta pri predviđanju ciljeva miRNA kod muva, uklonili smo predviđanja koja sadrže 7-8-nt kanonska mesta u srodnu miRNA u njihovim 3' UTR-ima i testirali ponašanje preostalih predviđanja kojima su nedostajale ove više efikasne kanonske lokacije. Prilikom testiranja podataka o transfekciji, većina algoritama koji se ne fokusiraju striktno na 3′ UTR sa 7-8-nt kanonskim mjestima generirali su predviđanja koja su slučajno potisnuta više nego što se očekivalo (slika 4c).

Ohrabreni ovim rezultatima, koristili smo naše karakteristike konteksta kako bismo izgradili model koji je razmatrao predviđanja kojima nedostaju kanonske 7–8-nt 3′ UTR lokacije, ali su imale barem jedno offset 6mer, 6mer ili 6mer-A1 mjesto u svom 3′ UTR. Kada se koristi bilo koji skup testova i testiraju se samo predviđanja kojima su nedostajala kanonska 7–8-nt 3′ UTR mjesta za srodnu miRNA, ovaj model, koji nazivamo modelom „6mer konteksta“, pokazao se bolje od svih postojećih algoritama, iako je statistički značajno poboljšanje je uočeno na samo dva praga prilikom testiranja derepresije endogenih ciljeva (sl. 4c i d). Drugi algoritam koji je dao predviđanja koja su dosledno potisnuta bolje od pozadine bio je DIANA-microT-CDS, koji uključuje predviđanja samo sa kanonskim ORF lokacijama. Stoga, uzevši zajedno, naša analiza pokazuje da dvije različite strategije koje se fokusiraju na samo marginalno efikasna mjesta mogu biti prediktivne kod muha, kako se sudi prema rezultatima transfekcije i nokauta, jedan pristup se fokusira na kanonske 6-nt lokacije u 3′ UTR, a drugi fokusira se na kanonske ORF lokacije. Međutim, u najboljem slučaju, prosječna represija od četiri do osam glavnih predviđanja iz ovih pristupa bila je mnogo manja od one glavnih ciljeva standardnog kontekstnog modela i umjesto toga je ličila na onu od stotina mRNA koje su sadržavale 7-8-nt kanonskih 3 ′ UTR lokacije (sl. 4a–d).

Opažanje da bi se mogli izgraditi modeli koji bi uspješno predviđali mete sa samo marginalnim kanonskim mjestima bilo je u skladu s dokazanom djelotvornošću ovih rubnih mjesta u ćelijama Drosophila (slika 1). Veći izazov je bio predvidjeti efikasne nekanonske lokacije, kojima nedostaje najmanje 6-nt savršenog podudaranja sa sjemenskom regijom. Iako dva tipa nekanonskih mjesta, poznatih kao 3′ dopunska mjesta i centrirana mjesta, mogu posredovati u potiskivanju, ova mjesta su rijetka—zaista toliko rijetka da je teško uočiti signal za njihovo djelovanje u stanicama sisara bez agregiranja mnogih skupova podataka [ 5, 72]. Ipak, neki algoritmi daju mnoga predviđanja koja imaju samo nekanonske lokacije. Analize skupova podataka o sisarima pokazuju da ova predviđanja nisu slučajno više potisnuta nego što se očekivalo [51], što postavlja pitanje da li bi neki od algoritama mogao uspješno predvidjeti nekanonska mjesta u Drosophili. Da bismo odgovorili na ovo pitanje, koristili smo naša dva testna skupa za mjerenje odgovora predviđanja kojima je nedostajalo bilo kakvo kanonsko 6-8-nt mjesto na srodnu miRNA u njihovom 3' UTR (Slika 4e, f). Jedina predviđanja sa uvjerljivim signalom iznad pozadine u bilo kojem testnom skupu bila su ona za EMBL, DIANA-microT-CDS i MinoTar. Ručno ispitivanje najbolje rangiranih predviđanja iz EMBL-a otkrilo je da se signal zapažen za njegova predviđanja može pripisati kanonskim mjestima smještenim u ORF-ovima i 3′ UTR-ovima alternativnih posljednjih egzona, dok se signal za predviđanja DIANA-microT-CDS i MinoTar može pripisati kanonskim ORF lokacijama. Zaključujemo da kod muva, kao i kod sisara [51], nekanonska mjesta samo rijetko posreduju u potiskivanju, iako ne možemo isključiti formalnu mogućnost da efektivnih nekanonskih mjesta ima u izobilju, ali iz nekog razloga nije predviđeno iznad bilo koje od postojećih algoritmi.

TargetScanFly (v7)

Otkrivši da je kontekstni model imao bolji učinak od modela koji su davali predviđanja cilja istraživačkoj zajednici Drosophila (Slika 4a, b), revidirali smo TargetScanFly (dostupan na targetscan.org) kako bismo prikazali ova poboljšana predviđanja. Zbog sve manjeg povrata predviđanja ciljeva sa samo marginalnim lokacijama (sl. 4c–f), nastavili smo ograničavati TargetScanFly na predviđanja sa 7-8-nt kanonskim 3′ UTR lokacijama, s rangovima koji su vođeni verzijom kontekstnog modela koji bio je obučen za cijeli skup podataka o transfekciji.

Radi jednostavnosti, razvili smo kontekstualni model koristeći mRNA bez obilnih alternativnih 3′ UTR izoforma (slika 3), a da bismo pravili poređenja sa rezultatima prethodnih modela, testirali smo kontekstni model koristeći samo najdužu izoformu označenu FlyBase-om (Sl. 4). Ipak, s obzirom na to da upotreba alternativnih 3′ UTR izoforma značajno poboljšava performanse modela ciljanja miRNA [51, 60], naša revizija predviđanja TargetScanFly uključila je i rezultate konteksta i trenutne informacije izoforme prilikom rangiranja mRNA sa kanonskim 7-8- nt miRNA mjesta u njihovim 3′ UTR.

Budući da su glavne baze podataka genskih anotacija (npr. Ensembl/FlyBase) još uvijek bile u procesu inkorporiranja informacija dostupnih o 3′ UTR izoformama, prvi korak u reviziji bio je sastavljanje skupa referentnih 3′ UTR-ova koji su predstavljali najduži 3′ UTR izoforme za reprezentativne ORF muhe. Ovi reprezentativni ORF-ovi su odabrani među skupom oznaka transkripta koji dijele isti stop kodon, s alternativnim posljednjim egzonima koji generiraju više reprezentativnih ORF-ova po genu. Da bismo sastavili ovaj set 3′ UTR-ova, počeli smo s FlyBase napomenama [73] za koje su 3′ UTR-ovi prošireni, kada je to bilo moguće, koristeći nedavno identificirane dugačke 3′ UTR izoforme [74] i očitavanja na 3′-kraju koji označavaju dodatni distalni cijepanje i mjesta poliadenilacije. Proširenje ovih 3′ UTR-a dovelo je do značajnog povećanja broja predviđenih regulatornih interakcija, sa srednjim brojem ciljeva za očuvane miRNA koji se povećao za 78% u odnosu na prethodnu verziju TargetScanFly (Dodatna datoteka 2: Slika S5).

Za svaku od ovih referentnih 3′ UTR izoforma, 3′-end skupovi podataka su korišteni za kvantificiranje relativnog obilja tandem izoforma, čime su generirani profili izoforme potrebni za bodovanje karakteristika koje variraju s 3′ UTR dužinom (len_3UTR i other_sites) i dodjeljivanje težine na kontekstualnu skoru svakog mjesta, što je predstavljalo dio 3′ UTR molekula koji sadrže mjesto [60]. Naši 3P-seq podaci iz S2 ćelija su kombinovani sa 3′-seq podacima iz niza razvojnih faza muhe [74] da bi se generisao meta 3′ UTR profil izoforme za svaki reprezentativni ORF, kao što je ilustrovano za Ultrabithorax (Ubx) (Sl. 5), za koje je poznato da se podvrgavaju alternativnom cepanju i poliadenilaciji [75]. Iako se ne očekuje da će ovaj meta pristup biti toliko precizan kao korištenje pojedinačnih skupova podataka za generiranje profila izoforme i predviđanja prilagođenih pojedinačnom stadiju ili tipu ćelije [61, 75, 76, 77], on pojednostavljuje zbirno rangiranje predviđenih ciljeva za svaku miRNA i još uvijek nadmašuje prethodni pristup u kojem se uopšte ne uzima u obzir obilje izoforme, vjerovatno zato što su profili izoforme za mnoge gene u velikoj korelaciji u različitim tipovima ćelija [60].

Primjer TargetScanFly stranice, koja prikazuje predviđena mjesta očuvanih miRNA unutar Ubx 3′ UTR. Na vrhu je 3′ UTR profil, koji pokazuje relativnu ekspresiju tandemskih 3′ UTR izoformi, mjereno korištenjem 3′-seq [74], kao i naših 3P-seq podataka. Na ovom profilu je prikazan kraj najduže FlyBase napomene (plava vertikalna linija) i broj čitanja na 3′-kraju (525) korištenih za generiranje profila (označeno na y-osa). Ispod profila su očuvana i slabo očuvana mjesta za miRNA široko očuvane među insektima (obojena prema ključu), s opcijama za prikaz lokacija za loše očuvane miRNA i druge miRBase napomene. U kutiji su predviđene miR-iab-8 lokacije, pri čemu je lokacija koju je izabrao korisnik označena sa a tamnija kutija. Višestruko poravnanje sekvenci pokazuje vrste u kojima se ortologno mjesto može otkriti (bijelo isticanje) među 27 vrsta insekata. Ispod poravnanja je predviđeno posljedično uparivanje između odabrane miRNA i njenih očuvanih i loše očuvanih mjesta, pokazujući također za svako mjesto njegovu poziciju, tip lokacije, ocjenu konteksta, percentil ocjene konteksta, ponderirani rezultat konteksta, rezultat dužine grane i PCT rezultat

Za svako kanonsko mjesto od 7–8 nt, koristili smo odgovarajući 3′ UTR profil da bismo izračunali kontekstni rezultat i ponderirali ovaj rezultat na osnovu relativnog obilja tandemskih 3′ UTR izoforma koje su sadržavale mjesto [60]. Bodovi za više lokacija u istoj familiji miRNA su također kombinovani kako bi se generirali kumulativni ponderirani kontekstni rezultati za 3′ UTR profil svakog reprezentativnog ORF-a, što je omogućilo zadani pristup za rangiranje predviđenih ciljeva s najmanje jednim 7-8-nt mjestom za to miRNA familija [51]. Kao opciju, korisnik može umjesto toga zatražiti da se predviđeni ciljevi široko očuvanih miRNA rangiraju na osnovu njihovog agregata PCT rezultati [57], kako je ažurirano u ovoj studiji. Korisnik također može dobiti predviđanja iz perspektive svakog gena koji kodira protein, posmatrano ili kao mapiranje 7-8-nt mjesta prikazanih ispod 3′ UTR profila i iznad 3′ UTR poravnanja sekvence (slika 5), ​​ili kao tabela miRNA rangiranih ili kumulativnim ponderiranim rezultatom konteksta ili agregatom PCT rezultat.


Elektronski dodatni materijal dostupan je na mreži na https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5015282.

Izdaje Kraljevsko društvo pod uslovima licence Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, koja dozvoljava neograničenu upotrebu, pod uslovom da se navede originalni autor i izvor.

Reference

Hosaka T, Yamashita T, Tamaoka A, Kwak S

. 2019 Ekstracelularne RNK kao biomarkeri sporadične amiotrofične lateralne skleroze i drugih neurodegenerativnih bolesti. Int. J. Mol. Sci. 20, 3148. (doi:10.3390/ijms20133148) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2017. faza I kliničko ispitivanje sigurnosti L-serina za pacijente s ALS-om. Amyotroph. Lateral Scler. Front. Degener. 18, 107-111. (doi:10.1080/21678421.2016.1221971) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2006 Identifikacija potencijalnih biomarkera CSF u ALS . Neurologija 66, 1218-1222. (doi:10.1212/01.wnl.0000203129.82104.07) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2001 Smanjen unos glutamata u trombocitima kod pacijenata sa amiotrofičnom lateralnom sklerozom. Neurologija 56, 270-272. (doi:10.1212/WNL.56.2.270) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Nivoi teškog lanca neurofilamenta u plazmi i progresija bolesti kod amiotrofične lateralne skleroze: Uvidi iz longitudinalne studije. J. Neurol. Neurosurg. Psihijatrija 86, 565-573. (doi:10.1136/jnnp-2014-307672) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Labra J, Menon P, Byth K, Morrison S, Vučić S

. 2016. Stopa progresije bolesti: prognostički biomarker u ALS. J. Neurol. Neurosurg. Psihijatrija 87, 628-632. (doi:10.1136/jnnp-2015-310998) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Shepheard SR, Wuu J, Cardoso M, Wiklendt L, Dinning PG, Chataway T, Schultz D, Benatar M, Rogers ML

. 2017 Urinarni p75ECD: prognostika, progresija bolesti i farmakodinamički biomarker kod ALS-a. Neurologija 88, 1137-1143. (doi:10.1212/WNL.0000000000003741) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2019 Dijagnostičke i prognostičke performanse neurofilamenata u ALS . Front. Neurol. 9, 1167. (doi:10.3389/fneur.2018.01167) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Simpson EP, Henry YK, Henkel JS, Smith RG, Appel SH

. 2004 Povećana lipidna peroksidacija u serumima pacijenata sa ALS: potencijalni biomarker opterećenja bolesti. Neurologija 62, 1758-1765. (doi:10.1212/WNL.62.10.1758) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Boylan K, Yang C, Crook J, Overstreet K, Heckman M, Wang Y, Borchelt D, Shaw G

. 2009 Imunoreaktivnost fosforilisane aksonalne neurofilamentne H podjedinice (pNF-H) u krvi glodara modela ALS i pacijenata sa ALS: procjena krvi pNF-H kao potencijalnog ALS biomarkera. J. Neurochem. 111, 1182-1191. (doi:10.1111/j.1471-4159.2009.06386.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Wilson ME, Boumaza I, Lacomis D, Bowser R

. 2010 Cistatin C: kandidat za biomarker za amiotrofičnu lateralnu sklerozu. PLoS ONE 5, e15133. (doi:10.1371/journal.pone.0015133) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bede P, Bokde ALW, Byrne S, Elamin M, Fagan AJ, Hardiman O

. 2012 Markeri kičmene moždine kod ALS-a: razmatranja dijagnostike i biomarkera . Amyotroph. Lateral Scler. 13, 407-415. (doi:10.3109/17482968.2011.649760) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2012 Miografija električne impedance kao biomarker za procjenu progresije ALS-a. Amyotroph. Lateral Scler. 13, 439-445. (doi:10.3109/17482968.2012.688837) Crossref, PubMed, Google Scholar

Tarasiuk J, Kułakowska A, Drozdowski W, Kornhuber J, Lewczuk P

. 2012 CSF markeri kod amiotrofične lateralne skleroze. J. Neural Transm. 119, 747-757. (doi:10.1007/s00702-012-0806-y) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Feneberg E, Steinacker P, Lehnert S, Schneider A, Walther P, Thal DR, Linsenmeier M, Ludolph AC, Otto M

. 2014 Ograničena uloga slobodnog TDP-43 kao dijagnostičkog alata u neurodegenerativnim bolestima. Amyotroph. Lateral Scler. Front. Degener. 15, 351-356. (doi:10.3109/21678421.2014.905606) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Laki lanac neurofilamenta: prognostički biomarker kod amiotrofične lateralne skleroze. Neurologija 84, 2247-2257. (doi:10.1212/WNL.0000000000001642) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2012 Praćenje promjena proteoma CSF-a kod amiotrofične lateralne skleroze: prepreke i perspektive u prevođenju nove markerske ploče u kliniku. PLoS ONE 7, e44401. (doi:10.1371/journal.pone.0044401) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Minimalne informacije za studije ekstracelularnih vezikula 2018 (MISEV2018): izjava o stavu Međunarodnog društva za ekstracelularne vezikule i ažuriranje smjernica MISEV2014 . J. Extracell. Vezikule 7, 1535750. (doi:10.1080/20013078.2018.1535750) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Cheruiyot C, Pataki Z, Ramratnam B, Li M

. 2018 Proteomska analiza egzosoma i njena primjena u HIV-1 infekciji. Proteomics Clin. Appl. 12, 1700142. (doi:10.1002/prca.201700142) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2018 miRNA profil povezan s egzozomima kao prognostički alat za praćenje odgovora na terapiju kod pacijenata s multiplom sklerozom. FASEB J. 32, 4241-4246. (doi:10.1096/fj.201701533R) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Meng Y, Sun J, Wang X, Hu T, Ma Y, Kong C, Piao H, Yu T, Zhang G

. 2019 Egzozomi: obećavajući put za dijagnozu raka dojke. Technol. Cancer Res. Treat. 18, 1533033818821421. (doi:10.1177/1533033818821421) Crossref, ISI, Google Scholar

Shi M, Jiang Y, Yang L, Yan S, Wang Y-G, Lu X-J

. 2018 Smanjeni nivoi egzozomalnog miR-638 u serumu predviđaju lošu prognozu kod hepatocelularnog karcinoma. J. Cell. Biochem. 119, 4711-4716. (doi:10.1002/jcb.26650) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chen B, Xia Z, Deng YN, Yang Y, Zhang P, Zhu H, Xu N, Liang S

. 2019 Novi mikroRNA biomarkeri za dijagnozu i prognozu kolorektalnog karcinoma. Otvorite Biol. 9, 180212. (doi:10.1098/rsob.180212) Link, ISI, Google Scholar

Wu HZY, Ong KL, Seeher K, Armstrong NJ, Thalamuthu A, Brodaty H, Sachdev P, Mather K

. 2015 Cirkulirajuće mikroRNA kao biomarkeri Alchajmerove bolesti: sistematski pregled. J. Alchajmerova bolest. 49, 755-766. (doi:10.3233/JAD-150619) Crossref, ISI, Google Scholar

Zheng X, Zhang Y, Yue P, Liu L, Wang C, Zhou K, Hua Y, Wu G, Li Y

. 2019 Dijagnostički značaj cirkulirajućih miRNA u sistemskom eritematoznom lupusu. PLoS ONE 14, e0217523. (doi:10.1371/journal.pone.0217523) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2019 Pregled mikroRNA biomarkera u traumatskim ozljedama mozga. J. Exp. Neurosci. 13, 117906951983228. (doi:10.1177/1179069519832286) Crossref, ISI, Google Scholar

Zhou SS, Jin JP, Wang JQ, Zhang ZG, Freedman JH, Zheng Y, Cai L

. 2018 MiRNAS u kardiovaskularnim bolestima: potencijalni biomarkeri, terapijski ciljevi i izazovi pregled-članak . Acta Pharmacol. Sin. 39, 1073-1084. (doi:10.1038/aps.2018.30) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Roser AE, Caldi Gomes L, Schünemann J, Maass F, Lingor P

. 2018 Cirkulirajuće miRNA kao dijagnostički biomarkeri za Parkinsonovu bolest. Front. Neurosci. 12, 625. (doi:10.3389/fnins.2018.00625) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Piket E, Železnjakova GY, Kular L, Jagodić M

. 2019 Male nekodirajuće RNA kao važni igrači, biomarkeri i terapeutske mete u multiploj sklerozi: sveobuhvatni pregled. J. Autoimmun. 101, 17-25. (doi:10.1016/j.jaut.2019.04.002) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Vaishya S, Sarwade RD, Seshadri V

. 2018 MikroRNA, proteini i metaboliti kao novi biomarkeri za predijabetes, dijabetes i srodne komplikacije. Front. Endocrinol. (Lozana) 9, 180. (doi:10.3389/fendo.2018.00180) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Mustapić M, Eitan E, Werner JKJ, Berkowitz ST, Lazaropoulos MP, Tran J, Goetzl EJ, Kapogiannis D

. 2017 Ekstracelularne vezikule plazme obogaćene neuronskim porijeklom: potencijalni prozor u patološke procese u mozgu. Front. Neurosci. 11, 278. (doi:10.3389/FNINS.2017.00278) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Brooks BR, Miller RG, Swash M, Munsat TL

. 2000 El Escorial ponovo pregledan: revidirani kriteriji za dijagnozu amiotrofične lateralne skleroze. Amyotroph. Lateral Scler. 1, 293-299. (doi:10.1080/146608200300079536) Google Scholar

. 2011 Cutadapt uklanja sekvence adaptera iz sekvencijskih čitanja visoke propusnosti. EMBnet.journal 17, 10. (doi:10.14806/ej.17.1.200) Crossref, Google Scholar

. 2012 Fast gapped-read poravnanje sa Bowtie 2 . Nat. Metode 9, 357-359. (doi:10.1038/nmeth.1923) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK

. 2009 edgeR: biokonduktorski paket za analizu diferencijalne ekspresije podataka digitalne ekspresije gena. Bioinformatika 26, 139-140. (doi:10.1093/bioinformatics/btp616) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010 Metoda normalizacije skaliranja za analizu diferencijalne ekspresije RNA-seq podataka. Genome Biol. 11, R25. (doi:10.1186/gb-2010-11-3-r25) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kozomara A, Griffiths-Jones S

. 2014 miRBase: označavanje mikroRNA visoke pouzdanosti koristeći podatke dubokog sekvenciranja. Nukleinske kiseline Res. 42, D68-D73. (doi:10.1093/nar/gkt1181) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2009 MIQE smjernice: minimalne informacije za objavljivanje kvantitativnih PCR eksperimenata u realnom vremenu. Clin. Chem. 55, 611-622. (doi:10.1373/clinchem.2008.112797) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF

. 2004. Normalizacija kvantitativne reverzne transkripcije-PCR podataka u realnom vremenu: pristup procjeni varijanse zasnovan na modelu za identifikaciju gena pogodnih za normalizaciju, primijenjen na skupove podataka o raku mokraćne bešike i debelog crijeva. Cancer Res. 64, 5245-5250. (doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-0496) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F.

2002 Tačna normalizacija kvantitativnih RT-PCR podataka u realnom vremenu geometrijskim usrednjavanjem više gena interne kontrole. Genome Biol. 3, ISTRAŽIVANJE0034. (doi:10.1186/gb-2002-3-7-research0034) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2013 Standardizacija metoda prikupljanja uzoraka, izolacije i analize u istraživanju ekstracelularnih vezikula . J. Extracell. Vezikule 2, 20360. (doi:10.3402/jev.v2i0.20360) Crossref, Google Scholar

Hill AF, Pegtel DM, Lambertz U, Leonardi T, O'Driscoll L, Pluchino S, Ter-Ovanesyan D, Nolte-‘t Hoen ENM

. 2013 ISEV pozicioni rad: analiza RNA ekstracelularnih vezikula i bioinformatika . J. Extracell. Vezikule 2, 22859. (doi:10.3402/jev.v2i0.22859) Crossref, Google Scholar

Katsu M, Hama Y, Utsumi J, Takashina K, Yasumatsu H, Mori F, Wakabayashi K, Shoji M, Sasaki H

. 2019 Profili ekspresije mikroRNA ekstracelularnih vezikula izvedenih iz neurona u plazmi pacijenata s amiotrofičnom lateralnom sklerozom. Neurosci. Lett. 708, 134176. (doi:10.1016/j.neulet.2019.03.048) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Moduliranje inflamatornih monocita sa jedinstvenim mikroRNA genskim potpisom poboljšava ALS kod miša. J. Clin. Invest. 122, 3063-3087. (doi:10.1172/JCI62636) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

De Felice B, Guida M, Guida M, Coppola C, De Mieri G, Cotrufo R.

2012 Potpis miRNA u leukocitima iz sporadične amiotrofične lateralne skleroze. Gene 508, 35-40. (doi:10.1016/j.gene.2012.07.058) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2017 Serumske miRNA miR-206, 143-3p i 374b-5p kao potencijalni biomarkeri za amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS). Neurobiol. Starenje 55, 123-131. (doi:10.1016/j.neurobiolaging.2017.03.027) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Liguori M, Nuzziello N, Introna A, Consiglio A, Licciulli F, D'Errico E, Scarafino A, Distaso E, Simone IL

. 2018 Disregulacija mikroRNA i ciljnih genskih mreža u perifernoj krvi pacijenata sa sporadičnom amiotrofičnom lateralnom sklerozom. Front. Mol. Neurosci. 11, 288. (doi:10.3389/fnmol.2018.00288) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Povezivanje mikrorna seruma i kliničkih parametara kod amiotrofične lateralne skleroze. Muscle Nerve 58, 261-269. (doi:10.1002/mus.26106) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Vrabec K, Boštjančič E, Koritnik B, Leonardis L, Dolenc Grošelj L, Zidar J, Rogelj B, Glavač D, Ravnik-Glavač M

. 2018 Diferencijalna ekspresija nekoliko miRNA i gena domaćina AATK i DNM2 u leukocitima sporadičnih pacijenata sa ALS-om. Front. Mol. Neurosci. 11, 106. (doi:10.3389/fnmol.2018.00106) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 miR-338-3p je prekomjerno eksprimiran u krvi, CFS, serumu i kičmenoj moždini kod pacijenata sa sporadičnom amiotrofičnom lateralnom sklerozom. Neurogenetika 15, 243-253. (doi:10.1007/s10048-014-0420-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Toivonen JM, Manzano R, Oliván S, Saragosa P, García-Redondo A, Osta R

. 2014 MicroRNA-206: potencijalni cirkulirajući biomarker kandidat za amiotrofičnu lateralnu sklerozu. PLoS ONE 9, e89065. (doi:10.1371/journal.pone.0089065) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Takahashi I, Hama Y, Matsushima M, Hirotani M, Kano T, Hohzen H, Yabe I, Utsumi J, Sasaki H

. 2015 Identifikacija mikroRNA u plazmi kao biomarkera sporadične amiotrofične lateralne skleroze. Mol. Mozak 8, 67. (doi:10.1186/s13041-015-0161-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Chen Y, Wei Q, Chen X, Li C, Cao B, Ou R, Hadano S, Shang H-F

. 2016 Aberacija ekspresije miRNA u leukocitima od sporadične amiotrofične lateralne skleroze. Front. Mol. Neurosci. 9, 69. (doi:10.3389/fnmol.2016.00069) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

de Andrade HMT, de Albuquerque M, Avansini SH, de Rocha SC, Dogini DB, Nucci A, Carvalho B, Lopes-Cendes I

. 2016 MikroRNA-424 i 206 su potencijalni prognostički markeri u spinalnoj amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi. J. Neurol. Sci. 368, 19-24. (doi:10.1016/j.jns.2016.06.046) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Tasca E, Pegoraro V, Merico A, Angelini C

. 2016 Cirkulirajuće mikroRNA kao biomarkeri mišićne diferencijacije i atrofije kod ALS-a. Clin. Neuropathol. 35, 22-30. (doi:10.5414/NP300889) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2017 Cirkulirajuće mikroRNA obogaćene mozgom kao novi biomarkeri za otkrivanje i diferencijaciju neurodegenerativnih bolesti. Alchajmerova rez. Ther. 9, 1-13. (doi:10.1186/s13195-017-0316-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Waller R, Wyles M, Heath PR, Kazoka M, Wollff H, Shaw PJ, Kirby J

. 2018 Mala RNK sekvencija sporadične amiotrofične lateralne skleroze cerebrospinalne tekućine otkriva različito izražene miRNA povezane s neuralnom i glijalnom aktivnošću. Front. Neurosci. 11, 731. (doi:10.3389/fnins.2017.00731) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Benoist M, Palenzuela R, Rozas C, Rojas P, Tortosa E, Morales B, González-Billault C, Ávila J, Esteban JA

. 2013 MAP1B zavisna Rac aktivacija je potrebna za endocitozu AMPA receptora tokom dugotrajne depresije. EMBO J. 32, 2287-2299. (doi:10.1038/emboj.2013.166) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Regulacija funkcionalne heterogenosti monocita pomoću miR-146a i Relb . Cell Rep. 1, 317-324. (doi:10.1016/j.celrep.2012.02.009) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2013 Modulacija mGluR-ovisnog MAP1B translacije i endocitoze AMPA receptora pomoću mikroRNA miR-146a-5p. J. Neurosci. 33, 9013-9020. (doi:10.1523/JNEUROSCI.5210-12.2013) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Sison SL, Patitucci TN, Seminary ER, Villalon E, Lorson CL, Ebert AD

. 2017 miR-146a proizveden u astrocitima kao posrednik gubitka motornih neurona u spinalnoj mišićnoj atrofiji. Hum. Mol. Genet. 26, 3409-3420. (doi:10.1093/hmg/ddx230) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lu Y, Cao DL, Jiang BC, Yang T, Gao YJ

. 2015 MicroRNA-146a-5p ublažava neuropatski bol suzbijanjem TRAF6 signalizacije u kičmenoj moždini. Mozak. Behav. Immun. 49, 119-129. (doi:10.1016/j.bbi.2015.04.018) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Iyer A, Zurolo E, Prabowo A, Fluiter K, Spliet WGM, van Rijen PC, Gorter JA, Aronica E.

2012 MicroRNA-146a: ključni regulator upalnog odgovora posredovanog astrocitima. PLoS ONE 7, e44789. (doi:10.1371/journal.pone.0044789) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Udruženje mikroRNA-146a sa autoimunim bolestima. Upala 35, 1525-1529. (doi:10.1007/s10753-012-9467-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Cui JG, Li YY, Zhao Y, Bhattacharjee S, Lukiw WJ

. 2010 Diferencijalna regulacija kinaze-1 (IRAK-1) i IRAK-2 povezane s receptorom interleukina-1 mikroRNA-146a i NF-κB u ljudskim astroglijalnim ćelijama pod stresom i kod Alchajmerove bolesti. J. Biol. Chem. 285, 38 951-38 960. (doi:10.1074/jbc.M110.178848) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2008. Identifikacija miRNA promjena u mozgu i likvoru kod Alchajmerove bolesti daje navodne biomarkere i uvid u puteve bolesti. J. Alchajmerova bolest. 14, 27-41. (doi:10.3233/JAD-2008-14103) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2009. Obilje i stabilnost mikro-RNA u ljudskom mozgu: specifične promjene u neokorteksu temporalnog režnja Alchajmerove bolesti. Neurosci. Lett. 459, 100-104. (doi:10.1016/j.neulet.2009.04.052) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kiko T, Nakagawa K, Tsuduki T, Furukawa K, Arai H, Miyazawa T

. 2014 MikroRNA u plazmi i cerebrospinalnoj tečnosti kao potencijalni markeri za Alchajmerovu bolest. J. Alchajmerova bolest. 39, 253-259. (doi:10.3233/JAD-130932) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Müller M, Kuiperij HB, Claassen JA, Küsters B, Verbeek MM

. 2014 MikroRNA u Alchajmerovoj bolesti: diferencijalna ekspresija u hipokampusu i cerebrospinalnoj tečnosti bez ćelija. Neurobiol. Starenje 35, 152-158. (doi:10.1016/j.neurobiolaging.2013.07.005) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Profili mikroRNA seruma služe kao novi biomarkeri za dijagnozu Alchajmerove bolesti. Dis. Markeri 2015, 625659. (doi:10.1155/2015/625659) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 Brza izolacija ekstracelularnih vezikula iz ćelijske kulture i bioloških tekućina korištenjem sintetičkog peptida sa specifičnim afinitetom za proteine ​​toplotnog šoka. PLoS ONE 9, e110443. (doi:10.1371/journal.pone.0110443) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2019 Identifikacija cirkulirajućeg miRNA potpisa u ekstracelularnim vezikulama prikupljenim od pacijenata s amiotrofičnom lateralnom sklerozom. Brain Res. 1708, 100-108. (doi:10.1016/j.brainres.2018.12.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Hua YJ, Tang ZY, Tu K, Zhu L, Li YX, Xie L, Xiao HS

. 2009 Identifikacija i ciljano predviđanje miRNA specifično izraženih u neuralnom tkivu štakora. BMC Genomics 10, 214. (doi:10.1186/1471-2164-10-214) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Liu G, Detloff MR, Miller KN, Santi L, Houlé JD

. 2012 Vježba modulira mikroRNA koje utiču na PTEN/mTOR put kod pacova nakon ozljede kičmene moždine. Exp. Neurol. 233, 447-456. (doi:10.1016/j.expneurol.2011.11.018) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015. Ekspresija MiR-10b-5p u mozgu Huntingtonove bolesti povezana je sa uzrastom početka i stepenom zahvaćenosti striatusa. BMC Med. Genomika 8, 1-14. (doi:10.1186/s12920-015-0083-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Varendi K, Kumar A, Härma MA, Andressoo JO

. 2014 MIR-1, miR-10b, miR-155 i miR-191 su novi regulatori BDNF-a. Cell. Mol. Life Sci. 71, 4443-4456. (doi:10.1007/s00018-014-1628-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Li Y, Yui D, Luikart BW, McKay RM, Li Y, Rubenstein JL, Parada LF

. 2012 Uslovna ablacija neurotrofnog faktora iz mozga-TrkB signalizacije narušava razvoj strijatalnog neurona. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 109, 15 491-15 496. (doi:10.1073/pnas.1212899109) Crossref, ISI, Google Scholar

Buchman AS, Yu L, Boyle PA, Schneider JA, De Jager PL, Bennett DA.

2016. Veća ekspresija BDNF gena mozga povezana je sa sporijim kognitivnim padom kod starijih osoba. Neurologija 86, 735-741. (doi:10.1212/WNL.0000000000002387) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Sadanand A, Janardhanan A, Vanisree AJ, Pavai T

. 2018 Ekspresija neurotrofina u limfocitima: snažan pokazatelj degeneracije kod Parkinsonove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze i ataksije. J. Mol. Neurosci. 64, 224-232. (doi:10.1007/s12031-017-1014-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Dva lica miR-29 . J. Cardiovasc. Med. 16, 480-490. (doi:10.2459/JCM.0000000000000246) Crossref, Google Scholar

. 2014 Profili mikroRNA u serumu kod djece sa autizmom. Mol. autizam 5, 40. (doi:10.1186/2040-2392-5-40) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Moreau MP, Bruse SE, David-Rus R, Buyske S, Brzustowicz LM

. 2011. Promijenjeni profili ekspresije mikroRNA u postmortem uzorcima mozga osoba sa šizofrenijom i bipolarnim poremećajem. Biol. Psihijatrija 69, 188-193. (doi:10.1016/j.biopsych.2010.09.039) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2013 Potpis pacijenata sa Alchajmerovom bolešću zasnovan na 12-miRNA u krvi. Genome Biol. 14, R78. (doi:10.1186/gb-2013-14-7-r78) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

2018. Potpisi zasnovani na miRNA u cerebrospinalnoj tekućini kao potencijalni dijagnostički alati za ranu fazu Parkinsonove bolesti. Oncotarget 9, 17 455-17 465. (doi:10.18632/oncotarget.24736) Crossref, Google Scholar

Pallarès-Albanell J, Zomeño-Abellán MT, Escaramís G, Pantano L, Soriano A, Segura MF, Martí E

. 2019 Skrining visoke propusnosti identificira mikroRNA inhibitore koji utječu na održavanje neurona i/ili odgovor na oksidativni stres. Mol. Ther. Nukleinske kiseline 17, 374-387. (doi:10.1016/j.omtn.2019.06.007) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kruman II, Pedersen WA, Springer JE, Mattson MP

. 1999 ALS-povezana Cu/Zn-SOD mutacija povećava ranjivost motornih neurona na ekscitotoksičnost mehanizmom koji uključuje povećani oksidativni stres i poremećenu homeostazu kalcijuma. Exp. Neurol. 160, 28-39. (doi:10.1006/exnr.1999.7190) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bao N, Fang B, Lv H, Jiang Y, Chen F, Wang Z, Ma H

. 2018 Povećana regulacija miR-199a-5p štiti kičmenu moždinu od ozljede izazvane ishemijom/reperfuzijom putem smanjenja ECE1 kod štakora. Cell. Mol. Neurobiol. 38, 1293-1303. (doi:10.1007/s10571-018-0597-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar


MicroRNA SARADNJA U RAKU: MEHANIZMI, FUNKCIJE I POTENCIJALNE TERAPIJE

Iako se upotreba miRNA mimičara i miRNA inhibitora kao terapeutika čini obećavajućom, samo je mali broj miRNA terapeutika do sada napredovao u kliničkom razvoju. Jedan od glavnih izazova je identifikacija najboljih kandidata za miRNA ili miRNA meta za različite vrste karcinoma. Intuitivna strategija je kombinovanje analize ekspresije gena sa algoritmima za predviđanje miRNA cilja, kao što je TargetScan (30). Međutim, ova strategija je ugrožena indirektnim efektima i složenom regulacijom gena koja uključuje različite molekularne vrste i njihove dinamičke interakcije. Stoga su razvijene biohemijske tehnike bazirane na imunoprecipitaciji Argonaute i miRNA (npr. HITS-CLIP i PAR-CLIP) kako bi se eksperimentalno identificirale miRNA𠄼iljne interakcije na razini transkriptoma (31). Još jedan izazov za miRNA terapeutike je izbjegavanje ili minimiziranje toksičnosti i efekata izvan cilja. Kako jedna miRNA često prilično slabo potiskuje svoje mete (21,32), obično su potrebne visoke doze efektivnih miRNA mimika da bi se postigao očekivani efekat. Međutim, visoke doze također izazivaju neželjene posljedice, uključujući nenamjerno ciljanje primijenjenih miRNA. Na primjer, kliničko ispitivanje MRX34 je moralo biti prekinuto zbog imunološki povezanih neželjenih događaja koji uključuju smrt pacijenata. Takvi se neuspjesi mogu spriječiti snižavanjem doze miRNA mimika i posljedično smanjenjem efekata izvan cilja, ali terapeutska korist bi se mogla podjednako smanjiti. Da bi se prevladao ovaj problem, razuman pristup bi bio korištenje kombinacija nižih doza miRNA koje sinergistički reguliraju ekspresiju zajedničke mete. U tom kontekstu, očekujemo smanjenje ili izbjegavanje neželjenih događaja kod pacijenata kada se višestruke miRNA istovremeno primjenjuju na nižim razinama u poređenju sa pojedinačnim tretmanom visokim dozama miRNA.

Kooperativna i sinergistička regulacija miRNA je intrigantan, ali slabo istražen mehanizam. Različite miRNA mogu na primjer sarađivati ​​regulacijom višestrukih, komplementarnih ciljeva na putu (Slika ​ (Slika 1). 1). Postoji nekoliko eksperimentalno potvrđenih primjera gdje miRNA ispoljavaju sinergističke efekte kod raka (Tabela ​ (Tabela 1). 1). Ko-transfekcija miR-34a i miR-15a/16 dovela je do povećanog zaustavljanja ćelijskog ciklusa u ćelijama raka pluća ne-malih ćelija zbog činjenice da miR-15a i miR-16 specifično snižavaju CCNE1 i CCND3. Takva regulacija gena ima komplementarni efekat na regulaciju ćelijskog ciklusa pomoću miR-34a (33). Pencheva etਊl. identifikovali da miR-1908, miR-199a-5p i miR-199a-3p zajedno ciljaju ApoE signalizaciju u melanomu. LNA posredovana inhibicija ovih miRNA snažno je potisnula metastaze melanoma (34). U poređenju sa tretmanom sa jednom miRNA u ćelijama akutne limfoblastne leukemije dece, koekspresija miR-125b, miR-100  i miR-99a rezultirala je smanjenjem regulacije višestrukih meta što je uzročno povezano sa rezistencijom na hemoterapeutsko sredstvo vinkristin ( 35). Kroz istraživanje devet miRNA parova u ćelijama glioma, Zhao etਊl. otkrili su da se ekstenzivna sinergija dogodila među pojačano reguliranim miRNA. Oni su pokazali da se najveći sinergistički efekat povećanja apoptoze ćelija glioma postiže istovremenom inhibicijom miR-20a i miR-21 (36).Derepresija tumor supresorskih gena (PDCD4, BTG2  i NEDD4L) inhibicijom miR-21, miR-23a i miR-27a pokazala je sinergističke efekte prema smanjenju rasta i progresije tumora pankreasa (37). Nadalje, s obzirom na višestruko ciljanje miRNA, istraživači su predložili miRNA kao pomoćne tvari u kombinaciji s dostupnim terapijama raka (38). Na primjer, miRNA modulacija se može koristiti za povećanje efikasnosti inhibitora malih molekula koji ciljaju onkogene (39) i za smanjenje efektivnih doza hemoterapije (40). Pokazali smo kako se potencijalna terapijska dobit može postići korištenjem miR-205 i miR-342 kao ko-adjuvansa za senzibiliziranje tumorskih stanica na genotoksični lijek protiv raka (41).

Implementacija kooperativnosti miRNA kroz ciljanje zajedničkog puta ili zajedničkog gena koji kodira protein. Ciljanje nekoliko međusobno povezanih gena koji kodiraju proteine ​​od strane više miRNA dovodi do regulacije puta i samim tim do modulacije fenotipskog ishoda (put A). Usklađeno ciljanje gena koji kodira protein od strane dvije miRNA može izazvati efikasnu regulaciju biološkog procesa koji je kontroliran genom (put B). miRNA ciljevi su označeni crvenom bojom.


1. Identifikacija cilja i validacija

Identifikacija mete i karakterizacija

Identifikacija i karakterizacija cilja počinje identificiranjem funkcije mogućeg terapeutskog cilja (gena/proteina) i njegove uloge u bolesti. Identifikacija mete je praćena karakterizacijom molekularnih mehanizama kojima se meta adresira. Dobra meta treba da bude efikasna, sigurna, da ispunjava kliničke i komercijalne zahteve i da bude "droggable".

Pristupi:

  • Data mining korištenjem bioinformatike
    — identificiranje, odabir i određivanje prioriteta potencijalnih ciljeva bolesti
  • Genetska asocijacija
    — genetski polimorfizam i povezanost sa bolešću
  • Profil ekspresije
    — promjene nivoa mRNA/proteina
  • Put i fenotipska analiza
    — In vitro
    ćelijske mehaničke studije
  • Funkcionalni skrining
    — nokautiranje, nokaut ili korištenje alata specifičnih za cilj

Validacija cilja

Validacija cilja pokazuje da je molekularna meta direktno uključena u proces bolesti i da će modulacija mete vjerovatno imati terapeutski učinak. Najvažniji kriterijum za ciljnu validaciju je pristup višestrukoj validaciji.

Pristupi:

  • Genetska manipulacija ciljnim genima (in vitro)
    — obaranje gena (shRNA, siRNA, miRNA), nokautiranje gena (CRISPR, ZFNs), ukidanje gena
    (virusna transfekcija mutantnih gena)
  • Antitela
    — interakcija s ciljem s visokim afinitetom i blokiranje daljnjih interakcija
  • Hemijska genomika
    — hemijski pristupi protiv proteina koji kodira genom

Da li vaša laboratorija ima poteškoća u otkrivanju novih ciljeva? Naš široki portfelj testova, reagensa i biblioteka može vam pomoći da pronađete pravu bravu kako biste mogli započeti rad na otključavanju. Iz Sangerova CRISPR biblioteka cijelog genoma to Duolink ® PLA za mjerenje interakcija protein-protein, i bioaktivne male molekule, pružamo vam prave alate za omogućavanje identifikacije, validacije i karakterizacije novih ciljeva koje tražite.


MiRBase

Numerisanje miRNA gena je jednostavno sekvencijalno. Na primjer, u vrijeme pisanja posljednja objavljena miRNA bila je mišja mir-352. Sljedeća objavljena miRNA će dobiti broj 353. Međutim, ako dostavite Xenopus miRNA koja je identična ljudskom mir-121, na primjer, predlažemo da i svoju sekvencu nazovete mir-121.

Imena/identifikatori u bazi podataka su oblika hsa-mir-121. Prva tri slova označavaju organizam. Zrela miRNA je označena kao miR-121 u bazi podataka i u većem dijelu literature, dok se mir-121 odnosi na miRNA gen i također na predviđeni dio petlje stabla u primarnom transkriptu. Različite prekursorske sekvence i genomski lokusi koji izražavaju identične zrele sekvence dobijaju imena u obliku hsa-mir-121-1 i hsa-mir-121-2. Slovni sufiksi označavaju blisko povezane zrele sekvence -- na primjer hsa-miR-121a i hsa-miR-121b bi se izrazili iz prekursora hsa-mir-121a i hsa-mir-121b respektivno.

Studije kloniranja miRNA ponekad identifikuju dva

22nt sekvence miRNA koje potiču od istog predviđenog prekursora. Kada relativna izobilja jasno ukazuje koja je pretežno eksprimirana miRNA, zrelim sekvencama se dodeljuju nazivi oblika miR-56 (preovlađujući proizvod) i miR-56* (iz suprotnog kraka prekursora). Kada podaci nisu dovoljni da se odredi koja je sekvenca preovlađujuća, imena poput miR-142-5p (sa 5' kraka) i miR-142-3p (sa 3' kraka). Starija konvencija ponekad je koristila miR-142-s i miR-142-as.

miRNA koje nisu u skladu s ovim idejama su u nekim slučajevima preimenovane u bazi podataka. Međutim, postoji nekoliko objavljenih izuzetaka od ovih pravila koji su prilagođeni. Na primjer, različiti organizmi imaju malo različite konvencije imenovanja - u biljkama, objavljena imena su u obliku MIR121. Virusne miRNA također usvajaju malo drugačiju shemu imenovanja. Iz tog razloga nije mudro oslanjati se na pisanje velikih slova za prenošenje informacija, kao što je mir/miR prekursor/zrela konvencija. let-7 i lin-4 su očigledni izuzeci od šeme numeracije, a ova imena su zadržana iz istorijskih razloga. Nove prijave homologa let-7 ili lin-4 će takođe dobiti ova imena.

Imajte na umu da imena miRNA mogu prenijeti samo ograničene informacije i da su potpuno neprikladna za kodiranje informacija o složenim odnosima sekvenci. Stoga se ne biste trebali oslanjati na ime da vam kaže sve što trebate znati o sekvenci. Razumni pristupi bazi podataka trebali bi umjesto toga koristiti namjenska polja i napomene za opisivanje takvih odnosa, kao što su "porodični" podaci navedeni ovdje.

Kriterijumi i konvencije za identifikaciju i imenovanje miRNA opisani su u sljedećem kratkom članku:

Victor Ambros, Bonnie Bartel, David P. Bartel, Christopher B. Burge, James C. Carrington, Xuemei Chen, Gideon Dreyfuss, Sean R. Eddy, Sam Griffiths-Jones, Mhairi Marshall, Marjori Matzke, Gary Ruvkun i Thomas Tuschl. Jedinstven sistem za označavanje mikroRNA. RNA 2003 9(3):277-279.

Pored imena ili ID-a, svaki unos miRBase Sequence ima jedinstveni pristupni broj. Pristupni broj je jedini istinski stabilan identifikator za unos - imena miRNA mogu se promijeniti od onih objavljenih kako odnosi između sekvenci postanu jasni. Prednost pristupnog sistema je u tome što se takve promjene mogu pratiti u bazi podataka, omogućavajući da se imena razvijaju kako bi ostala dosljedna, dok korisniku pruža potpuni pristup podacima i historiji. Međutim, akcesiji prenose malo biološkog značenja i očekuje se da se miRNA u publikacijama pominju po imenu.


MiRBase: baza podataka mikroRNA

miRBase pruža sljedeće usluge:

  • Baza podataka miRBase je pretraživa baza objavljenih miRNA sekvenci i napomena. Svaki unos u bazi podataka miRBase Sequence predstavlja predviđeni dio transkripta miRNA (nazvan mir u bazi podataka), s informacijama o lokaciji i sekvenci zrele miRNA sekvence (nazvan miR). I ukosnice i zrele sekvence su dostupne za pretraživanje i pregledavanje, a unosi se također mogu preuzeti po imenu, ključnoj riječi, referencama i napomenama. Svi podaci o sekvenci i napomenama također su dostupni za preuzimanje.
  • Registar miRBase daje lovcima na miRNA gene jedinstvena imena za nove miRNA gene prije objavljivanja rezultata. Posjetite stranice pomoći za više informacija o usluzi imenovanja.

Za primanje obavještenja putem e-pošte o ažuriranju podataka i promjenama funkcija, pretplatite se na mailing listu miRBase najava. Sve upite o web stranici ili usluzi imenovanja treba uputiti na [email protected]

miRBase upravlja laboratorija Griffiths-Jones na Fakultetu za biologiju, medicinu i zdravlje Univerziteta u Manchesteru uz finansiranje BBSRC-a. miRBase je prethodno bio domaćin i podržan od strane Wellcome Trust Sanger Instituta.


Historija promjena

Simons, M. & Raposo, G. Egzozomi – vezikularni nosioci za međućelijsku komunikaciju. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 575–581 (2009).

Valadi, H. et al. Transfer mRNA i mikroRNK posredovan egzozomima je novi mehanizam genetske razmjene između stanica. Nat. Cell Biol. 9, 654–659 (2007).

Hunter, M. P. et al. Detekcija ekspresije mikroRNA u mikrovezikulama periferne krvi ljudi. PLoS One 3, e3694 (2008).

Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A. & Ratajczak, M. Z. Mikrovezikule izvedene iz membrane: važni i nedovoljno cijenjeni posrednici komunikacije stanica-ćelija. Leukemija 20, 1487–1495 (2006).

Selbach, M. et al. Široko rasprostranjene promjene u sintezi proteina izazvane mikroRNA. Priroda 455, 58–63 (2008).

Baek, D. et al. Utjecaj mikroRNA na proizvodnju proteina. Priroda 455, 64–71 (2008).

Bartel, D. P. MikroRNA: genomika, biogeneza, mehanizam i funkcija. Cell 116, 281–297 (2004).

Mitchell, P. S. et al. Cirkulirajuće mikroRNA kao stabilni markeri na bazi krvi za otkrivanje raka. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 105, 10513–10518 (2008).

Janas, T., Janas, T. & Yarus, M. Specifično vezivanje RNA za uređene fosfolipidne dvoslojeve. Nukleinske kiseline Res. 34, 2128–2136 (2006).

Manavbasi, Y. & Suleymanoglu, E. Prepoznavanje nukleinske kiseline i fosfolipida: Fourierova transformacija infracrvene spektrometrijske karakterizacije ternarnog kompleksa fosfolipida-neorganskog kationa-DNK i njegova relevantnost za kemijsko-farmaceutski dizajn formulacija za isporuku gena na bazi liposoma. Arch. Pharm. Res. 30, 1027–1040 (2007).

Suleymanoglu, E. Prepoznavanje fosfolipida i nukleinske kiseline: razvoj imobilizirane liposomske hromatografije za odvajanje i analizu DNK. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 60, 232–239 (2006).

Gromelski, S. & Brezesinski, G. Kondenzacija DNK i interakcija sa cviterionskim fosfolipidima posredovana dvovalentnim kationima. Langmuir 22, 6293–6301 (2006).

Kim, S. I. et al. Sistemska i specifična isporuka malih interferirajućih RNK ​​u jetru posredovana apolipoproteinom A-I. Mol. Ther. 15, 1145–1152 (2007).

McManus, J. J., Radler, J. O. & Dawson, K. A. Da li kalcij pretvara cviterionski lipid u kationski? J. Phys. Chem. B 107, 9869–9875 (2003).

Mengistu, D. H., Bohinc, K. & May, S. Vezivanje DNK za cwitterionske lipidne slojeve posredovano dvovalentnim kationima. J. Phys. Chem. B 113, 12277–12282 (2009).

Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G. & Clayton, A. Curr. Protoc. Cell Biol. Poglavlje 3, 22 (John Wiley & Sons, 2006) Jedinica 3.

Lima, E.S. & Maranhao, R.C. Brza, jednostavna metoda laserskog raspršivanja svjetlosti za određivanje veličine HDL čestica u cijeloj plazmi. Clin. Chem. 50, 1086–1088 (2004).

Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L. & Mathivanan, S. Egzozomi: proteomski uvidi i dijagnostički potencijal. Expert Rev. Proteomics 6, 267–283 (2009).

Mathivanan, S. & Simpson, R. J. ExoCarta: zbornik egzosomalnih proteina i RNK. Proteomika 9, 4997–5000 (2009).

Conde-Vancells, J. et al. Karakterizacija i sveobuhvatno profiliranje proteoma egzosoma koje luče hepatociti. J. Proteome Res. 7, 5157–5166 (2008).

Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B. & Bartel, D.P. MikroRNA geni kralježnjaka. Nauka 299, 1540 (2003).

Chen, C. Z., Li, L., Lodish, H. F. & Bartel, D. P. MikroRNA moduliraju diferencijaciju hematopoetskih linija. Nauka 303, 83–86 (2004).

Rader, D. J., Cohen, J. & Hobbs, H. H. Monogena hiperholesterolemija: Novi uvidi u patogenezi i liječenju. J. Clin. Invest. 111, 1795–1803 (2003).

Lund-Katz, S. & Phillips, M.C. Struktura-funkcija lipoproteina visoke gustine i uloga u obrnutom transportu holesterola. Podćelija. Biochem. 51, 183–227 (2010).

Kosaka, N. et al. Sekretorni mehanizmi i međućelijski prijenos mikroRNA u živim stanicama. J. Biol. Chem. 285, 17442–17452 (2010).

Sun, G., Li, H. & Rossi, J. J. Kontekst sekvence izvan ciljnog regiona utiče na efikasnost miR-223 ciljnih mesta u RhoB 3′ UTR. Nukleinske kiseline Res. 38, 239–252 (2010).

Cui, X. D. et al. EFNA1 ligand i njegov receptor EphA2: potencijalni biomarkeri za hepatocelularni karcinom. Int. J. Cancer 126, 940–949 (2010).

Feinberg, E. H. & amp Hunter, C. P. Transport dsRNA u ćelije pomoću transmembranskog proteina SID-1. Nauka 301, 1545–1547 (2003).

Wolfrum, C. et al. Mehanizmi i optimizacija in vivo isporuka lipofilnih siRNA. Nat. Biotechnol. 25, 1149–1157 (2007).

Lewis, B. P., Burge, C. B. & Bartel, D. P. Očuvano uparivanje sjemena, često praćeno adenozinima, ukazuje da su hiljade ljudskih gena meta mikroRNA. Cell 120, 15–20 (2005).

Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B. & Bartel, D. P. Većina mRNA sisara su konzervirane mete mikroRNA. Genome Res. 19, 92–105 (2009).

Podrez, E. A. Antioksidativna svojstva lipoproteina visoke gustoće i ateroskleroze. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 37, 719–725 (2010).

Heinecke, J. W. HDL proteom: marker – a možda i posrednik – koronarne arterijske bolesti. J. Lipid Res. 50 (Dodatak), S167–171 (2009).

Rothblat, G. H. & amp Phillips, M. C. Heterogenost lipoproteina visoke gustine i funkcija u obrnutom transportu holesterola. Curr. Opin. Lipidol. 21, 229–238 (2010).

Lu, D. & Rhodes, D.G. Vezivanje fosforotioatnih oligonukleotida za zwitterionske liposome. Biochim. Biophys. Acta 1563, 45–52 (2002).

Qiu, X. et al. Kristalna struktura proteina za prijenos holesteril estera otkriva dugačak tunel i četiri vezana molekula lipida. Nat. Struktura. Mol. Biol. 14, 106–113 (2007).

Trajković, K. i dr. Ceramid pokreće pupanje eksozomskih vezikula u multivezikularne endosome. Nauka 319, 1244–1247 (2008).

Ferracin, M., Veronese, A. & Negrini, M. Mikromarkeri: miRNA u dijagnozi i prognozi raka. Vještak vl. mol. Dijagn. 10, 297–308 (2010).

Wang, G.K. et al. Cirkulirajuća mikroRNA: novi potencijalni biomarker za ranu dijagnozu akutnog infarkta miokarda kod ljudi. EUR. Srce J. 31, 659–666 (2010).

Wang, J. F. et al. Serum miR-146a i miR-223 kao potencijalni novi biomarkeri za sepsu. Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 184–188 (2010).

Heneghan, H. M., Miller, N., Lowery, A. J., Sweeney, K. J. i Kerin, M. J. MikroRNA kao novi biomarkeri za rak dojke. J. Oncol. 2009, 950201 (2009).

Gilad, S. et al. Serumske mikroRNA su obećavajući novi biomarkeri. PLoS One 3, e3148 (2008).

MacArthur, J. M. et al. Heparan sulfat proteoglikani jetre posreduju u klirensu lipoproteina bogatih trigliceridima nezavisno od članova porodice LDL receptora. J. Clin. Invest. 117, 153–164 (2007).

Ramakrishnan, S. N., Lau, P., Burke, L. J. & Muscat, G. E. Rev-erbbeta reguliše ekspresiju gena uključenih u apsorpciju lipida u ćelijama skeletnih mišića: dokaz unakrsnog razgovora između nuklearnih receptora siročadi i miokina. J. Biol. Chem. 280, 8651–8659 (2005).

Yao, Y. et al. Lipoproteini visoke gustine utiču na endotelni BMP signal modulacijom ekspresije receptora kinaze slične aktivinu 1 i 2. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2266–2274 (2008).

Moreno, P. R., Purushothaman, K. R., Sirol, M., Levy, A. P. & Fuster, V. Neovaskularizacija u humanoj aterosklerozi. Cirkulacija 113, 2245–2252 (2006).

Lee, H. et al. Hepatička siRNA isporuka pomoću rekombinantnog humanog apolipoproteina A-I kod miševa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 378, 192–196 (2009).

Fukao, T. et al. Evolucijski očuvan mehanizam za ekspresiju mikroRNA-223 otkriven profilisanjem gena mikroRNA. Cell 129, 617–631 (2007).

Gentner, B. et al. Stabilno rušenje mikroRNA in vivo lentivirusnim vektorima. Nat. Metode 6, 63–66 (2009).

Eyholzer, M. et al. Složenost regulacije miR-223 od strane CEBPA u humanoj AML. Leuk. Res. 34, 672–676 (2010).

Fazi, F. et al. Mini krug koji se sastoji od mikroRNA-223 i transkripcionih faktora NFI-A i C/EBPα reguliše ljudsku granulopoezu. Cell 123, 819–831 (2005).

Pulikkan, J. A. et al. Regulator ćelijskog ciklusa E2F1 i mikroRNA-223 sadrže autoregulatornu negativnu povratnu petlju kod akutne mijeloične leukemije. Krv 115, 1768–1778 (2010).

Lu, H., Buchan, R. J. & Cook, S. A. MikroRNA-223 reguliše ekspresiju Glut4 i metabolizam glukoze u kardiomiocitu. Cardiovasc. Res. 86, 410–420 (2010).

Yu, C. H., Xu, C. F. & Li, Y. M. Povezanost ekspresije mikroRNA-223 s ishemijom/reperfuzijom jetre kod miševa. Dig. Dis. Sci. 54, 2362–2366 (2009).

Sugatani, T. & Hruska, K. A. MikroRNA-223 je ključni faktor u diferencijaciji osteoklasta. J. Cell Biochem. 101, 996–999 (2007).

Iida, H. et al. Ekspresija efrin-A1 doprinosi malignim karakteristikama <α>- hepatocelularni karcinom koji proizvodi fetoprotein. Gut 54, 843–851 (2005).

Huang, L. et al. Imunoafinitetno odvajanje proteina plazme IgY mikrozrncima: zadovoljavanje potreba pripreme i analize proteomskih uzoraka. Proteomika 5, 3314–3328 (2005).

Nieuwland, R. et al. Ćelijsko porijeklo i prokoagulantna svojstva mikročestica u meningokoknoj sepsi. Krv 95, 930–935 (2000).

Matz, C. E. & amp Jonas, A. Micelarni kompleksi humanog apolipoproteina A-I sa fosfatidilkolinima i holesterolom pripremljeni iz holat-lipidnih disperzija. J. Biol. Chem. 257, 4535–4540 (1982).

Griffiths-Jones, S., Saini, H.K., van Dongen, S. & Enright, A.J. miRBase: alati za mikroRNA genomiku. Nukleinske kiseline Res. 36, D154–158 (2008).

Cline, M. S. et al. Integracija bioloških mreža i podataka o ekspresiji gena koristeći Cytoscape. Nat. Protoc. 2, 2366–2382 (2007).

Li, C. & amp Wong, W. H. Analiza oligonukleotidnih nizova zasnovana na modelu: izračunavanje indeksa ekspresije i detekcija odstupanja. Proc. Natl Acad. Sci. SAD 98, 31–36 (2001).


Pogledajte video: M18 alati bez četkica (Decembar 2022).