Informacije

Spojiti nekoliko datoteka .ab1 sekvence u jednu FASTA datoteku?

Spojiti nekoliko datoteka .ab1 sekvence u jednu FASTA datoteku?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Imam nekoliko .ab1 datoteka generiranih iz Chromasa. Želim ih sve spojiti u jednu FASTA sekvencu. Kako to mogu učiniti na automatiziran način?

Imajte na umu da nemam instaliran Chromas (fajlove je generirao neko drugi). Koristim linux, tako da se preferiraju alati otvorenog koda i komandne linije.


Općenito, trebali biste koristiti osnovni algoritam za pozivanje da biste generirali sekvence iz hromatograma, a ne direktno ih pretvarali u brzu (Ljubaznošću: Sven [SEQ odgovori] ). Kao što je spomenuto na linku, phred i TraceTuner su popularni softver za pozivanje baze koji može generirati brzi izlaz.

Softver koji spominje The Nightman može se koristiti za konverziju.ab1to fasta. Također možete isprobati ovaj BioPython modul pod nazivom abifpy. Možete lako pročitati svaki.ab1datoteku, koristeći python skriptu, i napišite sekvence u fasta formatu kao jednu datoteku.

Kombinacija više fasta je prilično trivijalna. Možeš koristitimačkakao što su spomenuli drugi.


DNA Baser ovdje ima batch abi to fasta konvertor. Nakon što se datoteke konvertuju u .fa datoteke, mogu se spojiti zajedno u UNIX/MAC koristećimačka *fa > output.fa


Tipične mogućnosti koje vam padaju na pamet su programi dostupni u EMBOSS i Staden. Međutim, pitanje kako pristupiti podacima o sekvenci pohranjenim u .ab1 datotekama postavljeno je na Biostarsu nekoliko puta, pa predlažem da pogledate različite odgovore tamo za opcije koje su prikladne za vaše okruženje i slučaj upotrebe, pogledajte Biostars pretraži "ab1".


Kako spojiti više fajlova u jedan fajl?

Imam više datoteka (n=86000) sa po jednom kolonom i želim ih sve spojiti u jedan fajl sa 86000 kolona.

Probao sam sljedeću naredbu

Činilo se da ovo nije funkcioniralo jer postoji 86000 za kombiniranje, zatim sam podijelio svoje datoteke u više foldera pri čemu svaki folder ne sadrži više od 15000 datoteka, ali ovo nije funkcioniralo

Format mog pojedinačnog fajla je sledeći (ima 16000 redova)

Šta je greška u kodu?


Spojiti nekoliko datoteka .ab1 sekvence u jednu FASTA datoteku? - Biologija

Multi-Multi-FASTA/Q format datoteke

DNK i proteinske sekvence se često pohranjuju u FASTA formatu [1-4]. Ovih dana stavljamo više sekvenci u FASTA fajl, ali prvobitno je FASTA fajl trebalo da sadrži samo jednu sekvencu. Fajl sa više sekvenci zvao se "Multi-FASTA".

Sada, šta ako želite da kombinujete ne samo više sekvenci, već i više FASTA fajlova u jednu datoteku? Možete koristiti tar, ali rezultirajući .tar fajl je binarni i nije kompatibilan sa alatima za obradu FASTA. Jednostavno spajanje pojedinačnih datoteka zajedno bi izgubilo nazive datoteka.

Dakle, ovaj prijedlog Multi-Multi-FASTA formata datoteke. To je FASTA datoteka, gdje zaglavlja sekvence mogu imati opcioni sufiks ">filename". Dakle, kompletno zaglavlje sekvence izgleda kao ">sequence name>filename". Takvo zaglavlje ukazuje da ovaj i sve naredne sekvence pripadaju datoteci "ime datoteke". Ovo omogućava dekonstrukciju Multi-Multi-FASTA datoteke natrag u pojedinačne FASTA datoteke.

Važno je da se datoteka Multi-Multi-FASTA može obraditi pomoću FASTA kompatibilnih alata. Može se komprimirati sa kompresorima specifičnim za FASTA, pretraživati ​​pomoću alata za pretraživanje homologije, itd. Kada je potrebno, može se dekonstruirati natrag u originalne FASTA datoteke.

Isti princip se može koristiti za kombinovanje više FASTQ datoteka u jednu Multi-Multi-FASTQ datoteku. Za FASTQ podatke, "@" je zadani separator, tako da označeno ime izgleda ovako: "@[email protected]".

Skripta mumu.pl u ovom repo-u je referentna implementacija. Omogućava i pakovanje i raspakivanje Multi-Multi-FASTA/Q datoteke.

Preduvjeti: git (za preuzimanje), perl. Na primjer, za instalaciju na Ubuntu: sudo apt install git perl . Na Mac OS-u ćete možda morati instalirati Xcode alate komandne linije.

Preuzimanje i instaliranje:

Ili samo postavite mumu.pl skriptu tamo gdje vam je potrebna.

Pakovanje više datoteka u Multi-Multi-FASTA/Q datoteku

mumu.pl 'data/*.fa' >all.mfa - Kombinirajte sve .fa datoteke u direktoriju "data", pohranite rezultat u datoteku "all.mfa".

mumu.pl --dir data '*.fa' >all.mfa - Isto, ali prvo ulazi u direktorij "data". Imena datoteka pohranjena u izlazu neće imati dio direktorija.

mumu.pl --dir data --sep '<' '*.fa' >all.mfa - Koristite '<' kao separator između naziva sekvence i naziva datoteke u izlazu.

mumu.pl --dir data --all '*.fa' >all.mfa - Dodajte ime datoteke svim imenima sekvence. Podrazumevano je samo prva sekvenca svake datoteke označena imenom datoteke.

mumu.pl --stdin <list.txt >all.mfa - Pakujte datoteke navedene u "list.txt" u "all.mfa".

mumu.pl --fastq --dir čita '*.fq' >all.mfq - Kombinirajte FASTQ datoteke u jednu Multi-Multi-FASTQ datoteku.

mumu.pl '*.fa' >all.fa - Ne radi to! "all.fa" će se računati kao jedan od ulaznih fajlova, koji potencijalno prepuni vaš prostor za skladištenje.

mumu.pl --dir data --no-ext --cmd "unnaf ''" '*.naf' >all.mfa - Dekomprimirajte datoteke formatirane u NAF-u i upakujte njihove podatke u "all.mfa".

Raspakivanje Multi-Multi-FASTA/Q datoteke

mumu.pl --unpack all.mfa - Raspakuje "all.mfa" u pojedinačne datoteke.

mumu.pl --unpack --dir 'new' all.mfa - Kreira direktorij "new", ulazi u njega, a zatim raspakuje "all.mfa".

mumu.pl --unpack --sep '<' all.mfa - Raspakuje datoteku u kojoj je "<" korišten kao separator između naziva sekvence i naziva datoteke.

mumu.pl --unpack --dir 'new' all.mfa --cmd "ennaf -22 -o '.naf'" - Raspakujte "all.mfa", komprimirajte svaki raspakovani fajl sa ennaf u letu.

Zašto ne stavite prvo ime datoteke, kao ">filename>sequence name"?
Razlog je taj što u mnogim slučajevima imena sekvenci počinju pristupnim brojem. Stavljanje naziva datoteke na kraj zadržava kompatibilnost sa softverskim alatima koji čitaju samo pristupni broj i zanemaruju ostatak imena.

Da li je u redu ponoviti ">" u nazivu sekvence?
Podrazumevano, naziv sekvence i ime datoteke su odvojeni znakom ">", iz razloga što se ovaj znak obično ne nalazi u imenima sekvence. Međutim, neki alati mogu imati problema sa drugim ">" u jednom redu. U takvim slučajevima, moguće je koristiti drugi znak, koristeći --sep '?' opcija. Naravno, kada se koristi prilagođeni separator, on mora biti specificiran u koracima pakovanja i raspakivanja.

Imajte na umu da separator ne mora biti jedan znak. Možete koristiti bilo koji string, sve dok ga strana za raspakivanje zna i može ga dostaviti komandi za raspakivanje.

Da li sve sekvence treba označiti imenima datoteka ili samo prvu sekvencu svake datoteke?
Ovo zavisi od scenarija upotrebe. Ako tok posla uključuje preuređivanje ili filtriranje sekvenci, tada će možda biti potrebno označavanje svake sekvence. S druge strane, ako će sve sekvence biti zadržane, tada je označavanje samo prve sekvence po datoteci kompaktnije. Format i implementacija podržavaju oba slučaja.

Što ako se FASTA datoteke koje treba kombinirati nalaze u više direktorija?
Nema problema, dio naziva datoteke Multi-Multi-FASTA datoteke može uključivati ​​putanju do datoteke, poput ovog: ">sequence name>full/path/to/file". Sve putanje fajla koje se daju naredbi za pakovanje biće zabeležene u upakovanoj datoteci. Tokom raspakivanja, direktorijumi će se kreirati automatski.

Koju ekstenziju naziva datoteke treba koristiti za Multi-Multi-FASTA/Q datoteke?
Ekstenzije ".mfa" i ".mfq" mogu se koristiti za Multi-Multi-FASTA i Multi-Multi-FASTQ datoteke, respektivno. Alternativno, može se koristiti bilo koja od uobičajenih ekstenzija FASTA i FASTQ (".fa", ".fasta", ".fna", ".fq", ".fastq" itd.).

Da li trebam komprimirati *.fa ili '*.fa'?
Preporučeni i robusniji način je korištenje citata: '*.fa'. Pokušaj spajanja *.fa rezultira time da ljuska proširuje masku i daje sva imena datoteka kao argumente za mumu.pl script. Obično to može dobro funkcionirati, ali jednog dana ćete pokušati komprimirati direktorij s hiljadama datoteka, što može premašiti maksimalnu veličinu argv vašeg sistema. Prilikom citiranja maske ('*.fa'), proširenje maske se dešava unutar mumu.pl skripta, gdje je ograničenje određeno dostupnom RAM memorijom, pa se stoga može bezbedno obraditi mnogo veći broj fajlova.

Šta je sa očuvanjem dozvola, vlasnika i vremenske oznake upakovanih datoteka?
Trenutno nisu podržani, ali se u principu format može proširiti kako bi se prihvatile ove informacije, ako postoji dovoljan interes za to.

Može li rekurzivno spakovati direktorij FASTA datoteka?
Format nema problema sa pohranjivanjem cijelog stabla direktorija. Trenutni alat nema rekurzivni način rada, ali može čitati listu datoteka koje treba komprimirati sa stdin-a, čineći rekurzivno pakovanje mogućim. Na primjer, evo kako možete spakovati cijeli direktorij koristeći naći komanda:
pronađi DATASET -tip f -name '*.fna' | mumu.pl --stdin | ennaf -22 -o DATASET.mfa.naf

Da li prepisuje postojeće fajlove tokom raspakivanja?
Podrazumevano, ne. Dodajte opciju --overwrite da prepišete postojeće fajlove.

Može li zlonamjerna arhiva staviti datoteke izvan ciljnog direktorija tokom raspakivanja?
Ne. Sve apsolutne putanje se konvertuju u relativne, a sve '..' u putanjama se zanemaruju tokom raspakivanja. Može ići samo niz stablo direktorija, ne i gore.

Da li se gzipirane datoteke mogu dekomprimirati u hodu i ekstrahovani podaci spakovati zajedno?
Da. --cmd . opcija omogućava specificiranje naredbe koja će se izvoditi na svakoj obrađenoj pojedinačnoj datoteci (i za vrijeme pakiranja i prilikom raspakivanja). Ovo omogućava dekompresiju datoteka u hodu prije pakiranja njihovih podataka. Također omogućava komprimiranje (ili na drugi način obradu) svake ekstrahirane datoteke tokom raspakivanja.

Kompresija srodnih genoma

Pretpostavimo da imamo skup srodnih genoma, na primjer, 1697 genoma Helicobacter pylori. Nekomprimovani zauzimaju 2,8 GB u FASTA formatu. Komprimirani jedan po jedan koristeći gzip rezultira skupom datoteka od 804 MB. Bolji kompresor, kao što je naf, smanjuje veličinu na 675 MB. Međutim, genomi i dalje ostaju u 1.697 odvojenih fajlova.

Pokušajmo sa dva najčešća načina povezivanja datoteka zajedno - zip i tar.gz: dobijamo arhive od 767 i 803 MB, respektivno. Iako sada imamo jednu datoteku, pogodnu za dijeljenje ili kretanje, veličina je i dalje velika. Također, pristup podacima sekvence sada zahtijeva dekonstruiranje arhive natrag u pojedinačne datoteke.

Jači kompresor bi mogao komprimirati tar datoteku u manju arhivu. Ali potreba za vraćanjem originalnih datoteka prije rada na njima će ostati.

Sada, šta ako kombinujemo genome u Multi-Multi-FASTA fajl, a zatim komprimujemo sa nafom? Dobijamo datoteku koja je samo 80 MB - 10 puta manji i laki za slanje preko mreže.

Važno je da se sekvencama formatiranim u FASTA koji se nalaze u ovoj arhivi može pristupiti jednostavnim dekompresijom i slanjem podataka u FASTA kompatibilan alat. To znači da se mnoge analize mogu izvesti bez raspakivanja arhive i bez pohranjivanja 1.697 datoteka u sistem datoteka. Samo kada je potrebno, dekonstruisaćemo arhivu u pojedinačne FASTA fajlove.

Kompresija:
mumu.pl --dir 'Helicobacter' 'Helicobacter pylori*' | ennaf -22 --text -o 'Hp.mfa.naf'

Dekompresija i raspakivanje:
unnaf 'Hp.mfa.naf' | mumu.pl --otpakiraj --dir 'Helicobacter'

Komprimiranje već komprimiranih datoteka

Pretpostavimo da imate skup genoma koji su već komprimirani jedan po jedan (npr. korištenjem NAF formata). Sada biste ih htjeli spakovati zajedno i komprimirati u jednu datoteku. Najjednostavniji način je da prvo dekomprimirate genome, ali onda ćete morati pohraniti sve ogromne dekomprimirane podatke. Idealno bi bilo da biste radije da se dekompresija dogodi u hodu kada pakujete sekvence zajedno. Koristeći --cmd opciju ovo se može postići u jednom koraku:

mumu.pl --dir 'Helicobacter' --no-ext --cmd "unnaf ''" 'Helicobacter pylori*.naf' | ennaf -22 --text -o 'Hp.mfa.naf'

Također je moguće raspakirati rezultujuću arhivu natrag direktno u pojedinačno komprimirane genome:

unnaf 'Hp.mfa.naf' | mumu.pl --otpakiraj --dir 'Helicobacter' --cmd "ennaf -22 -o '.naf'"

David J. Lipman, William R. Pearson (1985) "Brze i osjetljive pretrage sličnosti proteina" Nauka, 22. mart 1985., 227(4693), 1435-1441.

William R. Pearson, David J. Lipman (1988) "Poboljšani alati za poređenje bioloških sekvenci" Proc. Natl. Akad. Sci. SAD, april 1988, 85(8), 2444-2448.

Hongen Zhang (2016) "Pregled formata podataka sekvence" Metode u molekularnoj biologiji, 1. januar 2016, 1418, 3-17.

Peter J.A. Cock, Christopher J. Fields, Naohisa Goto, Michael L. Heuer, Peter M. Rice (2010) "Format datoteke sanger FASTQ za sekvence sa ocjenama kvalitete i varijante Solexa/Illumina FASTQ" Nukleinske kiseline Res., april 2010, 38, 1767-1771.

Kiril Kryukov, Mahoko Takahashi Ueda, So Nakagawa, Tadashi Imanishi (2019.) "Nukleotidni arhivski format (NAF) omogućava efikasnu kompresiju DNK sekvenci bez referenci" Bioinformatika, 35(19), 3826-3828.

Kiril Kryukov, Mahoko Takahashi Ueda, So Nakagawa, Tadashi Imanishi (2020.) "Sequence Compression Benchmark (SCB) baza podataka - sveobuhvatna procjena kompresora bez referenci za sekvence formatirane FASTA" GigaScience, 9(7), giaa072.

Tim Hulsen, Saumya S. Jamuar, Alan R. Moody, Jason H. Karnes, Orsolya Varga, Stine Hedensted, Roberto Spreafico, David A. Hafler, Eoin F. McKinney (2019.) "Od velikih podataka do precizne medicine" Granice u medicini, 1. mart 2019, 6, 34.

Wei Shen, Shuai Le, Yan Li, Fuquan Hu (2016) "SeqKit: Višeplatformski i ultrabrzi komplet alata za FASTA/Q manipulaciju datotekama" PLoS One, 5. oktobar 2016., 11(10), e0163962.

Ola Spjuth, Erik Bongcam-Rudloff, Johan Dahlberg, Martin Dahlo, Aleksi Kallio, Luca Pireddu, Francesco Vezzi, Eija Korpelainen (2016.) "Preporuke o e-infrastrukturama za sekvenciranje sljedeće generacije" GigaScience, 2016, 5, 26.

Morteza Hosseini, Diogo Pratas, Armando J. Pinho (2016) "Anketa o metodama kompresije podataka za biološke sekvence" Informacije, 14. oktobar 2016, 7, 56.

Mikel Hernaez, Dmitri Pavličin, Tsachy Weissman, Idoia Ochoa (2019) "Kompresija genomskih podataka" Annu. Rev. Biomed. Data Sci. 2019, 2, 19-37.


Abstract

Masivno paralelno sekvenciranje (MPS) postalo je standardna tehnika u molekularnoj biologiji čija se primjena proširila sa analize ljudskog genoma na onu gotovo svih drugih organizama. MPS zahtijeva da se izvedu referentni genomi i, u nekim slučajevima, višestruki genomi se moraju rukovati kao jedna jedinica da bi se izvršila genetska analiza. Sekvence nukleinskih kiselina se obično pohranjuju u "fasta" datoteke, koje mogu sadržavati više genoma ("multi-fasta"). Iako je moguće konvertovati multi-fasta fajl u jednu sekvencu korišćenjem specifičnih kompjuterskih komandi, rezultujuća datoteka neće pratiti granice originalnih sekvenci, što otežava utvrđivanje kome pripada čitanje genoma dobijeno od MPS-a. U ovoj studiji predstavljamo miješati, shell skripta koja se može koristiti za kreiranje prilagođenog referentnog genoma spajanjem multi-fasta fajlova uz pružanje liste granica pojedinačnih genoma koje se mogu koristiti za nizvodnu analizu.


Svi primjeri programa koje smo do sada vidjeli dali su izlaz direktno na ekran. To je sjajno za istraživanje novih funkcija i kada radite na programima, jer vam omogućava da odmah vidite učinak promjena koda. Međutim, ima nekoliko nedostataka kada pišemo kod koji bismo možda željeli koristiti u stvarnom životu.

Štampanje izlaza na ekran dobro funkcioniše samo kada ga nema mnogo. Odličan je za kratke programe i statusne poruke, ali brzo postaje glomazan za velike količine izlaza. Neki terminali se bore s velikim količinama teksta, ili još gore, imaju ograničenu mogućnost pomicanja unatrag što može uzrokovati da prvi dio vašeg izlaza nestane. Nije lako pretraživati ​​izlaz koji se prikazuje na terminalu, a dugi redovi imaju tendenciju da se premotaju. Takođe, za mnoge programe želimo da pošaljemo različite bitove izlaza u različite datoteke, umesto da ih sve izbacujemo na isto mesto.

Što je najvažnije, izlaz terminala nestaje kada zatvorite svoj terminalski program. Za male programe kao što su primeri na ovim stranicama, to nije problem – ako želite ponovo da vidite izlaz, samo ponovo pokrenite program. Ako imate program za koji je potrebno nekoliko sati da se pokrene, to i nije tako sjajna opcija.

Otvaranje fajlova za pisanje

U prethodnom odeljku videli smo kako otvoriti datoteku i pročitati njen sadržaj. Također možemo otvoriti datoteku i upisati neke podatke u nju, ali funkciju open() moramo koristiti na malo drugačiji način. Da bismo otvorili datoteku za pisanje, koristimo verziju funkcije open() s dva argumenta, gdje je drugi argument kratak niz koji opisuje šta želimo da uradimo sa datotekom. Ovaj drugi argument može biti "r" za čitanje, "w" za pisanje ili "a" za dodavanje. Ako izostavimo drugi argument (kao što smo uradili za sve gore navedene primjere), Python koristi zadani, a to je "r" za čitanje.

Razlika između "w" i "a" je suptilna, ali važna. Ako otvorimo datoteku koja već postoji koristeći način rada "w", tada ćemo prepisati trenutni sadržaj bilo kojim podacima koje u njega upišemo. Ako otvorimo postojeću datoteku u načinu "a", ona će dodati nove podatke na kraj datoteke, ali neće ukloniti postojeći sadržaj. Ako već ne postoji datoteka sa navedenim imenom, onda se "w" i "a" ponašaju identično – oboje će kreirati novu datoteku koja će zadržati izlaz.

Dosta Python funkcija i metoda ima ove opcione argumente. Za potrebe ovih stranica, spomenut ćemo ih samo kada su direktno relevantne za ono što radimo. Ako želite da vidite sve opcione argumente za određenu metodu ili funkciju, najbolje mesto za traženje je zvanična Python dokumentacija – pogledajte prethodnu stranicu za detalje.

Nakon što otvorimo datoteku za pisanje, možemo koristiti metodu file write() da u nju upišemo tekst. write() radi slično kao print() – uzima jedan argument stringa – ali umjesto da ispisuje string na ekranu, on ga upisuje u datoteku.

Evo kako koristimo open() sa drugim argumentom da otvorimo datoteku i upišemo jedan red teksta u nju:

Budući da se u ovom primjeru izlaz upisuje u datoteku, nećete vidjeti nikakav izlaz na ekranu ako ga pokrenete. Da biste provjerili da li kod radi, morat ćete ga pokrenuti, zatim otvoriti datoteku out.txt u uređivaču teksta i provjeriti je li njen sadržaj ono što očekujete.

Zapamtite da sa write() , baš kao i sa print() , možemo koristiti bilo koji string kao argument. To također znači da možemo koristiti bilo koju metodu ili funkciju koja vraća string. Sljedeće je sve sasvim u redu:


Fluorescentni završetak lanca i kapilarna elektroforeza

Radioaktivnost je opasna i nepoželjna za rad, pa su razvijeni terminatori lanca sa fluorescentnim oznakama. Ova metoda sintetiše niz DNK lanaca koji su specifično fluorescentni na kraju koji se propušta kroz sistem kapilarne elektroforeze. Dok fragmenti DNK prolaze kroz laser i detektor, identifikuje se različit fluorescentni signal koji se pripisuje svakom ddNTP i generiše hromatogram koji predstavlja sekvencu. Terminatori fluorescentnog lanca sada se koriste u reakcijama i prolaze kroz malu kapilaru. Najmanji fragmenti prvi prolaze kroz njih i otkrivaju se kako bi se otkrio kromatogram.

Fluorescentni hromatogrami se koriste za bodovanje završetka nukleotidnog lanca. Amplituda svakog vrha odgovara snazi ​​ili sigurnosti poziva nukleotida. Datoteke hromatograma se obično daju uz datoteku sekvence sa ekstenzijom *.ab1 dok se datoteke sekvence pružaju kao tekstualni fajl u fasta formatu. Više o ovim datotekama možete pronaći ovdje. Ab1 datoteke su izuzetno važne za analizu kada postoje nejasnoće ili greške u sekvenciranju. Ove ab1 datoteke se također mogu koristiti za pripisivanje ocjene kvaliteta osnovnom pozivu.

Kada postoji previše nejasnoća u signalu zbog višestrukih pikova, često ćete pronaći N umjesto jednog od 4 nukleotida (A, T, C i G).

Ovaj video (izvor: www.yourgenome.org CC-BY) ilustruje mehanizam prekida fluorescentnog lanca i kapilarne elektroforeze.


Spojiti nekoliko datoteka .ab1 sekvence u jednu FASTA datoteku? - Biologija

Pretraga baze podataka: BLAST, NetBLAST, PsiBLAST, HMMER, itd.

Pronalaženje uzoraka: MEME, Motifs, FindPattern

Korisni alati: FrameSearch, FrameAlign, itd.

Wisconsin Package GCG je softverski paket koji sadrži preko 130 alata za analizu sekvenci. Razvila ga je Genetics Computer Group u Madisonu, a sada ga održava i distribuira Accelrys. Može se pristupiti daljinski sa bilo kojeg umreženog računara. Postoje tri različita interfejsa za pristup GCG-u:

SeqLab: grafički X-windows interfejs

SeqWeb: sučelje web preglednika (http://gcg.ucr.edu)

Sve tri aplikacije su instalirane na UNIX serveru cache.ucr.edu gdje dijele istu bazu podataka sekvenci. Upute za postavljanje naloga možete pronaći na našoj GCG stranici. Ova radionica će se fokusirati na SeqLab, jer je to najmoćniji i najsvestraniji GCG interfejs.

Da biste pokrenuli SeqLab sa računara, potrebno je da konfigurišete X-win32 (za Mac OS X: X11, konfiguracija) i PuTTY prema stranici sa konfiguracijom. Za prijenos datoteka između vašeg lokalnog stroja i GCG servera, preporučujem korištenje WinSCP (za Mac OS X: Fugu). Više pomoći o problemima konfiguracije možete pronaći na našoj GCG stranici.

B. Pokretanje SeqLaba i GCG iz komandne linije

Prijavite se na cache.ucr.edu (chug.ucr.edu) koristeći PuTTY (X11 u Mac OS X)

$ seqlab & ("&" počinje u pozadini)

Pokrenite GCG komandnu liniju (može biti dodatak SeqLab-u):

Pomoć: U SeqLab-u možete pronaći dokumente pomoći klikom na meni Pomoć u prozoru različitih aplikacija. Na komandnoj liniji možete otvoriti ove datoteke pomoći naredbom "genhelp" ili "genmanual". Da biste dobili pomoć za određene programe, samo upišite njegovo ime nakon ovih naredbi. Dodatne informacije možete pronaći u (Online GCG priručnik, usr: genhelp, pwd: verzija102). Opšta pomoć za UNIX može se naći na istoj stranici pod Korisničkom vodiču.

C. Korištenje radnog imenika

Prozor radnog imenika je jedna od najvažnijih komponenti SeqLaba. U ovom prozoru određujete direktorij u koji SeqLab upisuje izlazne datoteke. Zapamtite, u GCG-u općenito kreirate u svakoj sesiji mnogo izlaznih datoteka. Nekorištenje ove funkcije može stvoriti veliki nered na vašem računu.

Za pristup ovoj funkciji idite na:

Opcije -> Preference -> Radni imenik

Dođite do direktorija koji želite koristiti tako što ćete upisati njegovu putanju u prozor Filter, a zatim pritisnite enter. Dvostruki klik na dvije tačke ".." u polju Imenici dovodi vas do sljedećeg višeg direktorija.

Novi direktoriji se mogu kreirati tako što ćete ukucati njihovo ime u okvir za tekst Selection, a zatim kliknuti na OK. Zgodan alat za kreiranje i upravljanje novim direktorijumima je WinSCP.

SeqWeb korisnici mogu kopirati svoje datoteke na komandnoj liniji sa /usr/local/seqweb/2.0.2/seqweb/html/user/your_account_name/rad/ u njihov početni direktorij.

D. Rad sa glavnim prozorom SeqLab-a

Prozor glavne liste je SeqLab-ov alat za upravljanje projektima koji vam omogućava da organizujete podatke od projekta do projekta. Ovdje iu Editoru (s. ispod) birate sekvence koje želite analizirati pomoću različitih alata koji su dostupni u GCG-u. Možete se prebacivati ​​između uređivača i glavne liste u meniju Mode (3).

Datoteka: učitavanje i spremanje projekata

Uredi : uredi stavke u glavnoj listi i uređivaču

Funkcije : odaberite softverske alate GCG

Opcije: radni direktorij i grafički uređaji

Windows : pristup upravljanju poslovima, pregled datoteke praćenja i funkcije sekvence

Lista: trenutno učitana datoteka liste. To nema nikakve veze sa radnim direktorijumom.

Mode : prebacuje između uređivača i glavne liste

Atributi: nukleinska kiselina (N), protein (P), nepoznato (*), naprijed (+), obrnuto (-), dužina, itd.

Stavka liste: Imena datoteka (putanja)

Zaslon : birajte između različitih načina boja

Traka sa ikonama: Izreži (akcize i kopira odabrano područje), Kopiraj, Zalijepi, Zaštiti (postavlja zaštite), Info (prikazuje informacije o redoslijedu)

Opcije: Overstrike (zamjenjuje & i briše na kursoru), Insert (umeće i briše na kursoru) i Check (ponovo ukucajte provjeru sa zvučnim upozorenjem)

Wrap : prebacivanje između omotanog i neumotanog prikaza

Invert : promijenite boju pozadine i karaktera

Traka za navigaciju: označava poziciju, kolonu, orijentaciju itd.

E. Uređivanje i označavanje sekvenci

Uobičajene funkcije uređivanja niza i pretraživanja mogu se naći u izborniku Uredi:

izaberite sekvence ili oblasti sekvence koje želite

idite u meni Uredi i odaberite Obrnuto, Pronađi, Prevedi, itd.

Lepa karakteristika SeqLab-a je to što vam omogućava da izvodite ove operacije na više sekvenci odjednom umesto da to radite jedan po jedan kao što je slučaj u većini drugih uređivača sekvenci.

Da biste dodali napomene nizu ili poravnanju, to možete učiniti unutar sekvenci (pogledajte Značajke sekvence) ili u zasebnom redu za komentare. Da biste dodali red za komentare, u prozoru uređivača odaberite Datoteka -> Nova sekvenca -> Tekst. Pojavljuje se novi red koji se može premjestiti ispod niza po vašem izboru pomoću dugmadi za kopiranje i lijepljenje. Prebacite se na način umetanja i dodajte svoje komentare. Sve promjene se mogu sačuvati u RSF formatu.

Napomena: Za kreiranje i uređivanje sekvenci iz komandne linije, možete koristiti SeqEd koji je dodatni interaktivni uređivač sekvenci u GCG-u.

F. Uvoz i izvoz sekvenci

Postoje tri glavna načina za uvoz sekvenci u GCG:

Prebacite se u glavnom prozoru na mod za uređivanje

Datoteka -> Uvoz -> Odaberite sekvencu i kliknite OK -> Navedite vrstu sekvence.

Da sačuvate sekvencu u GCG formatu, izaberite sekvencu u režimu za uređivanje -> Datoteka -> Sačuvaj kao -> <name.seq>

Uvoz MSF poravnanja (FASTA formatirana poravnanja se mogu uvesti preko paketnog uvoza):

Prebacite se u glavnom prozoru na režim glavne liste

File -> Dodaj sekvence iz ->Sequence Files -> Odaberite poravnanje i kliknite OK.

Paketni uvoz (uvozi i pojedinačne sekvence):

Da biste uvezli mnogo sekvenci u jednoj operaciji, one moraju biti u jednoj spojenoj datoteci. Ako ih imate u zasebnim datotekama, možete ih kombinirati s "cat" funkcijom na komandnoj liniji: $ cat *.seq > batch.seq

Funkcije -> Uvoz/izvoz -> <select format> -> pretražite svoj fajl i dajte novoj datoteci liste ime kao što je *.list


GCG formatirane sekvence se spremaju kao zasebne datoteke u vaš radni direktorij. Svaka datoteka prima naziv svog ID-a sekvence, koji je u FastA datoteci tekst iza ">".

Ako su vaše sekvence u drugom formatu, možete ih preformatirati na komandnoj liniji:

Postoje dvije mogućnosti za izvoz sekvenci iz GCG-a:

Sekvence i poravnanja koja su izmijenjena u uređivaču mogu se izvesti u MSF ili GenBank format tako što ćete ih odabrati u uređivaču i odabrati Datoteka -> Izvoz -> <select format>.

Da biste izvezli sekvence u FastA i Staden format, odaberite sekvence na glavnoj listi i odaberite Funkcije -> Uvoz/izvoz -> <select format>. Kada odaberete FastA kao izlazni format, imate izbor (pod Opcijama) da izvezete svaku sekvencu u zasebnu datoteku ili u jednu FastA batch datoteku. Potonji se često preferira ako kasnije želite da uvezete svoje datoteke u druge baze podataka.

G. Datoteke praćenja, sklapanje i mapiranje

Uvezite datoteke praćenja (ABI i SCF format)

Odaberite datoteke sekvence u Editor -> iz Windows izbornika odaberite Tragovi . Sekvence se mogu uređivati ​​u Editoru, a promjene će se pojaviti u Trace Vieweru.

Promjene se mogu sačuvati u rsf formatu (fajlovi bogate sekvence), koji sadrži uređene sekvence i informacije o praćenju u jednoj datoteci.

Zbog vremenskih ograničenja, radionica će pružiti samo kratak pregled različitih alata za sklapanje sekvenci koji su dostupni u GCG.

Assemble : spaja datoteke sekvence po redoslijedu unosa

The "Gel. " alati su međusobno povezani i moraju se koristiti u navedenom redoslijedu:

GelStart : kreira novi projekat sklapanja fragmenta

GelEnter : dodaje određene sekvence projektu montaže

GelMerge : sastavlja sekvence u projektu montaže u kontige

GelAssemble : omogućava vam da pregledate i uredite kontige koje je sastavio GelMerge:

izaberite FAS u prozoru GelAssemble

tipke gore i dolje za odabir kontiga, CTRL&K za učitavanje kontiga

pomjerite kursor pomoću tipki sa strelicama i unesite promjene

da sačuvate promene, prebacite se sa CTRL&D u komandni režim, ukucajte WRite ili Exit i pritisnite enter.

Za detalje pročitajte GelAssemble Help/Command Mode

GelView : prikazuje strukturu kontiga u montažnom projektu

GelDisassemble : razbija sve kontigove na njihove originalne fragmente

Prim e odabire oligonukleotidne prajmere za šablonsku DNK sekvencu. Možete mu dopustiti da za dizajn koristi cijeli predložak ili da koristi listu vaših temeljnih premaza.

Mapa prikazuje restrikcijska mjesta enzima iznad oba lanca DNK zajedno sa translacijama proteina ispod DNK (vidi sliku ispod).

MapPlot grafički prikazuje mjesta ograničenja.

MapSort navodi, po veličini, fragmente jednog ili više restrikcijskih enzima digestije.

PlasmidMap čita datoteku iz MapSort-a (pokreće se sa parametrom komandne linije -PLAsmid) da bi nacrtao plazmidne mape.

Karakteristike napomena kao što su introni, domeni i strukturne informacije iz javnih i ličnih baza podataka mogu se grafički prikazati u prozoru za uređivanje odabirom opcija u meniju Prikaz opcija Karakteristike Boje ili Grafičke karakteristike.

Da biste prikazali karakteristike iz neusklađenih sekvenci u poravnanju Pileup, uradite sljedeće iz uređivača:

Učitajte označene sekvence u Editor

Napravite višestruko poravnanje sa Pileup-om

Dodajte novokreiranu MSF datoteku iz Output Managera u Editor. Kada se to od vas zatraži, odaberite " zamjena postojećih sekvenci". Vaše poravnanje će biti učitano u uređivač, a bilješke iz neusklađenih sekvenci će biti pravilno prenijete.

Označite datoteku sekvence ili oblast sekvence u prozoru za uređivanje, a zatim u Windows izborniku odaberite opciju Funkcije i u rezultirajućem prozoru unesite informacije o napomenama. Grafički simboli se mogu odabrati u podprozorima Uredi i Dodaj.

Karakteristike se mogu prilagoditi u datoteci feature.cols, koja mora biti lokalizirana u direktoriju odakle pokrećete SeqLab (/home/user/). Da biste premjestili ovu datoteku tamo, upišite u komandnu liniju $ fetch feature.cols. Koristite svoj omiljeni uređivač da modificirate ovu datoteku prema vašim željama.

I. Ispis i izvoz grafike

Najlakši način da odštampate grafiku ili da je integrišete u druge grafičke aplikacije je da ih sačuvate u PostScript formatu i da dobijenu datoteku prenesete na svoj lokalni računar, gde možete da je modifikujete i odštampate u Ghostviewu, besplatnom softveru koji se može preuzeti sa ova stranica: http://www.cs.wisc.edu/

ghost/index.htm. Kada ovo radite prvi put morate omogućiti PostScript format u SeqLab-u pod Options -> Graphics Devices -> Jezik: PostScript

a) Za ispis sekvenci i poravnanja u fajlu:

pogledajte ih u uređivaču -> File -> Print

u prozoru Print izaberite PostScript u polju Output Format i File u polju Destination .

b) Za štampanje grafike iz drugih GCG aplikacija kao što je PepPlot:

kliknite na Print u lijevom uglu ovog prozora

upišite naziv datoteke u polje Port ili File.

J. Pregled GCG programa

Većini GCG programa se može pristupiti preko opcije Funkcije u traci menija glavnog prozora, koja omogućava pristup trenutno 111 različitih alata za analizu sekvenci. Ova radionica može pružiti samo kratak uvod u mali izbor ove ogromne kolekcije GCG programa.

For an efficient job and database management, please make yourself familiar with the following functions in the Windows menu: Job Manager , Output Manager and Database Browser .

- Lookup identifies sequence database entries by name, accession number, author, organism, keyword, title, reference, feature, definition, length, or date. The output is a list file of sequences, which can be used to load all specified sequences into the Main List or Editor .

- BLAST searches local nucleic acid or protein databases. This important function will be introduced in the next paragraph (K).

- NetBLAST searches NCBI's database online.

- FastA does a Pearson and Lipman search for similarity between a query sequence and a group of sequences of the same type. For nucleotide searches, FastA may be more sensitive than BLAST.

- SSearch does a rigorous Smith-Waterman search for similarity between a query sequence and a group of sequences of the same type (nucleic acid or protein). This may be the most sensitive method available for similarity searches. Compared to BLAST and FastA, it can be very slow.

- PSI-BLAST: Position specific iterative BLAST (PSI-BLAST) refers to a feature of BLAST in which a profile (or position specific scoring matrix, PSSM) is constructed (automatically) from a multiple alignment of the highest scoring hits in an initial BLAST search. The PSSM is generated by calculating position-specific scores for each position in the alignment. Highly conserved positions receive high scores and weakly conserved positions receive scores near zero. The profile is used to perform a second (etc.) BLAST search and the results of each "iteration" used to refine the profile. This iterative searching strategy results in increased sensitivity.

- HMMER can be used to perform sensitive database searching using statistical descriptions of a sequence family's consensus. Related software packages are PSI-BLAST and SAM. A very nice user guide on HMMER can be found on Sean Eddy's home page (http://hmmer.wustl.edu/).

HmmerAlign aligns multiple sequences to a profile HMM. It can be used to create alignments of large numbers of sequences. HmmerBuild builds a profile HMM from a given multiple sequence alignment. HmmerCalibrate determines appropriate statistical significance parameters for a profile HMM prior to doing database searches. HmmerConvert converts HMMER profile HMMs to other formats. HmmerEmit generates sequences probabilistically from a profile HMM. HmmerPfam searches a profile HMM database with a sequence. HmmerSearch searches a sequence database with a profile HMM.

- Pileup creates a multiple alignment of unaligned sequences. The alignment is written to a MSF file which can be imported into many alignment editing tools, such as GeneDoc.

- MEME finds conserved motifs in a group of unaligned sequences .

- Motifs looks for sequence motifs by searching through proteins for patterns defined by PROSITE.

- FindPatterns looks for patterns defined by the user .

Protein Analysis: Browse through the different protein analysis tools to identify which ones may be useful for your work.

- PeptideStructure makes secondary structure predictions including alpha, beta, coil, turn, antigenicity, flexibility, hydrophobicity and surface probability. A very useful exercise on predicting structure and antigenicity of peptides can be found on this page: http://mcf.ahc.umn.edu/Tutorials.htmls/minitutor6.html

- FrameSearch searches a group of protein sequences for similarity to one or more nucleotide query sequences, or searches a group of nucleotide sequences for similarity to one or more protein query sequences. For each sequence comparison, the program finds an optimal alignment between the protein sequence and all possible codons on each strand of the nucleotide sequence. Optimal alignments may include reading frame shifts.

- FrameAlign creates an optimal alignment of the best segment of similarity (local alignment) between a protein sequence and the codons in all possible reading frames on a single strand of a nucleotide sequence. Optimal alignments may include reading frame shifts.

- BackTranslate backtranslates an amino acid sequence into a nucleotide sequence. The output helps you identify areas with fewer ambiguities that might be candidates for synthetic probes.

K. Large-scale Sequence Analysis: BLAST Example

Many sequence analyses in GCG can be performed in a batch pipeline. The sequence search tools FASTA and BLAST are just two of many of those "batch" applications, which query sequences databases that are installed locally on cache.ucr.edu. The application NetBLAST allows you to perform online searches against sequence databases on the NCBI server, but it is limited to one sequence submission at a time.

To run many BLAST and FASTA searches at once on cache.ucr.edu, you must first select the sequences of your choice in the Main List or Editor. For selecting sequences you have several options:

Select individual sequences in Main List or Editor

Select a database or DataSet (see below) in Main List or Editor

Select a list file of "sequence pointers" the Main List or Editor

To start the BLAST search with the selected sequences, you choose Functions -> Database Sequence Searching -> BLAST. In the open BLAST window you need to select whether you want to search a nucleotide/protein database (defines use of BLASTN, BLASTX, TBLASTN, TBLASTX) and the Search Set (specifies database). Under Options you set the search parameters:

here you normally want to reduce the number of sequence hits from the default of 500 (which is a waste of storage space) to a much smaller number

under Format for Alignments you have the choice between many options: standard, XML, tab delimited, etc. Some of these options can often simplify the downstream data parsing.

usage of filters and masks

scoring matrix: default is BLOSUM62, you have the option to change to BLOSUM45, 80, and PAM30, 70 by clicking on Specify Scoring Matrix

Note: When you perform batch operations in GCG, the software names the output after the sequence/query ID#s and their file extensions correspond to the name of the search tool. Example: gi343848.tblastx.

For parsing of BLAST result, you can try to use on the command line our Perl script "blastParse" or this simple Perl one-liner:

perl -ne 'print if (/Query=/ ? ($c=1) : (--$c > 0)) print if (/End of List/ ? ($d = 9) : (--$d > 0))' input.blast > output.parse

List files are a very efficient way to perform analyses of specific sets of sequences. Since they contain only pointers to the sequences, they can save you a lot of storage space (no duplication of large sequence data) and allow very quick selections of defined sequence groups to perform various analyses simultaneously. For instance, one can quickly create a list file for thousands of sequences in a spread sheet program and submit it to the sequence search tools of your choice. The format of a list file looks like this:

One way of creating a list file is to select the sequences of your choice in the Man List window and then save it as *.list under File -> Save List As.

An alternative and often more flexible way of creating list files is to use a spread sheet program or WordPad on your local machine (use file extension *.list). To import a list file into the Main List, there are two options:

File -> Open List -> select *.list file

File -> Add Sequences From -> Sequence Files -> select *.list file

Note: List files with more than 2000 sequences cannot be expanded (viewed) in the Main List .

In addition to specifying query sequences, certain SeqLab application allow you to specify database records that will be used for a search or analysis. Programs that accept user-defined search sets are FastA , FindPatterns, FrameSearch, Overlap, ProfileSearch, SSearch and StringSearch . In all these programs you specify the search set by clicking on the Search Set button of the individual application, which opens a search set builder window. Note: Each application uses its own search set.

N. Creating Personal Sequence Databases with DataSet

To add your personal sequences to the Database Browser , you need to use the application DataSet . For this you first switch to the appropriate working directory (see C.), then you sel ect your sequences or their list file in the Main List window, and choose: Functions -> Utilities -> Databases Utilities -> DataSet . You will be prompted with a dialog window where you assign a name and then press Run . This will add the following three files to your current working directory: *.header, *.ref and *.seq. When finished you should see your personal database in the Database Browser.

Note: A DataSet is different from a BLASTable database, which is explained in the next paragraph.

O. Creating BLASTable Sequence Databases

Create a new directory where you want to store your BLASTable databases and make it your working directory (see C.). Then you select the sequences that you wish to create a BLASTable set from, and choose: Functions -> Utilities -> Databases Utilities -> GCGtoBLAST.

You will be presented with a dialog window that allows you to assign a name to the set. Enter a name and press Run . This operation creates five new files in your current working directory: *.phr, *.pin, *.psd, *.psi and *.psq. All sequence data are contained in this file structure. To save storage space, you can now delete the initial sequence files. Searching the database that you created requires that you first access the Wisconsin Package from the command line so that you can properly modify a configuration file, which is necessary to add a reference to your new BLASTable database to the BLAST database Search Set menu. To do this you would do the following from the UNIX command line after starting the Wisconsin Package there:

$ pico blast.sdbs (if you don't know how to use the pico editor you can update this text file in WordPad)

At the end of the file, add a line like: /path/db-base-name p my own blast database

Here are some notes for editing this line:

Substitute the actual full path to your newly created database for /path/

Substitute the base filename (the name you entered for the BLAST database when you created it) for db-base-name

The second column should be "p" for a protein database and "n" for a nucleotide database

To BLAST against your personal databases, your working directory needs to be the highest level in your home directory (this is a bug in our installation).

Within WinSCP: Create the following directories within the master directory Exercises: Seq, Pep, Database and Analysis. Use these directories to organize the work of the following exercises.

Within SeqLab: Create the same directory structure with the working director manager in SeqLab (see C.).

Import trace files: Download the trace files 09.ab1 & 13.ab1, import them into SeqLab, view trace plus text sequences, export the latter into FASTA or GenBank format and view them with WordPad on your local machine.

Import single sequences: Run in your web browser query "P450 & hydroxylase & acid & human [orgn]" against the NCBI Protein Database. Save the first ten proteins in FASTA and GenBank formats and import them one-by-one into SeqLab. Create alignment with Pileup .

Batch import: Import entire proteome of Halobacterium spec. from ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/genomes/Bacteria/Halobacterium_sp/AE004437.faa.

Import alignments: Create multiple alignment of sequences from 2.2. using MultAlin. Import alignment in MSF and FASTA formats.

Export: Export in single and batch sequence modes. Export alignment in MSF format.

In sequence: view imported sequence from 2.2. in Editor, display and add features.

In alignment: run Pileup with Lookup list file from 4.1. and transfer alignment annotations into Editor and find heme binding cystein residue, export alignment and view it in GeneDoc (only on PC).

Database searches: Lookup, FASTA, SSearch, BLAST, HMMER

Lookup : run query "CYPIII (All text) & P450 (Def)" in Lookup against SwissProt database.

SSearch, FASTA, BLAST and PSI-BLAST : query with one of these sequences the SwissProt database using SSearch, BLAST and FASTA.

HMMER : Align sequences from 4.1. Retrieve and align remote homologs from SwissProt database with HMMER: HmmerBuild, HmmerCalibrate, HmmerSearch and HmmerAlign.

Create BLASTable database

Create BLASTable database for proteome from Halobacterium spec. (imported under 2.3.).

Motifs : Use Motifs to find PROSITE patterns in protein alignment from 2.2., find pattern with Edit/Find and highlight it in all sequences at once using the Feature function.

FindPattern : find out how many sequences in the SwissProt database share this pattern using FindPattern .

Consensus and FitConsensus : retrieve the corresponding nucleotide sequences, align them, calculate consensus sequence with Consensus and query with it a small nucleotide database using FitConsensus .

MEME and MotifSearch : use MEME to find conserved motifs in your set of unaligned nucleotide sequences. Use the resulting MEME profiles to query a small nucleotide database with MotifSearch .

PAUP : use PaupSearch to generate a bootstrapped tree from alignment under 2.2. Edit tree with PaupDisplay , Treeview (local) and PowerPoint.

Distance Matrix : calculate distance matrix for alignment using Distances and plot its tree with Display .

Molecular tools: Primer design, backtranslate

Primer design : Design primers that amplify the longest ORFs of the two sequences from 2.1.

Restriction map : generate restriction map for one of the sequences from 1.1. koristeći Map .


Reading FASTA files in python3: Tut2

This is the second video tutorial about Python 3 for Biologists, the absolute beginner course. In this lecture, I talk about a method to read fasta files and extract valuable information from the file. One valuable piece of information is the CDS (coding sequence). For that I use several methods to clean the DNA sequence and then find the index values of the CDS. Finally extract the CDS.

Video taken from the channel: Shad Arf


Run AmpliMERGE

Your use of any of these tools is at your own risk. We do not give any representation or warranty nor assume any liability or responsibility for the data nor the results posted (whether as to their accuracy, completeness, quality or otherwise). Access to these data is available free of charge for ordinary use in the course of research. By visiting the site, you accept our use of cookies and you accept that your data and results will be stored in our server.


Guide to editing sequences with Chromas and BioEdit

Chromas has the advantage the you can save all of your chromatograms which can subsequently be used in any other programs unlike Sequencher which saves everything in a project file which cannot be opened by anything else. If I loose my sequence alignment, at least all my chromatograms with the correct edits are still there to rebuild it from. BioEdit can also edit chromatograms, but I find Chromas to be nicer. MEGA also has an alignment editor, but I ve not really used it very much.

Double click on the chromatogram file (usually has the extension ab1). This opens the file in Chromas (see below under installation notes if some other program opens it instead of Chromas). The chromatograms come off the machine with all bases in upper case. I usually make all of my edits as lower case bases as it makes it easier to identify where I have made edits. When I am done I save the chromatogram and export the data to a line file (which is saved with a .seq extension). Alternatively, you can go edit, copy sequence, FASTA format and paste that into BioEdit. One trick I find useful later is to always edit your sequences from the same starting base (unless the starts are all messy), as it makes sequence alignment much easier later.

I ve always used the free Chromas version, Chromas Lite, but there are two other versions with more features that are fairly cheap. http://www.technelysium.com.au/chromas.html Each of the commercial versions have a free 60 day trial should you wish to try them.

Aligning sequences with BioEdit

I use BioEdit to align sequences as it is free and has some handy features. The most annoying aspect is that you have to manually align up each sequence and manually create a consensus sequence (which commercial programs like Sequencher and Geneious are very good at). Aside from that limitation (which isn t as bad as it might sound once you learn a few tricks), I really like its features. It is the only program I know of that allows you to edit, search and replace, and paste over the sequence title names independent of your sequences. I use this feature on nearly every dataset I create. As far as I can tell there is no difference between saving your file as a BioEdit formatted file versus as a fasta file. I would recommend saving everything in fasta format since that is the format I use in order to convert the data to another format or to another person (who probably doesn t have a copy of BioEdit).

One quirk of BioEdit is that if you double click a data file it will open in a new copy of BioEdit, not in an existing one. The regular copy and paste features work between copies of the program, but copying and pasting sequences does not. If you need to copy and paste between copies of the program select the sequences, go Edit, Copy Sequences to clipboard (FASTA Format). In the other copy of BioEdit I usually go File, New from Clipboard. I then select those sequences (control-shift-a), cut (control-shift-c) or copy them (control-a) and paste them (control-s) to the desired BioEdit file. The reason why I paste them to a new file first is that importing from the clipboard (File, Import from Clipboard) will place them at the bottom of your file, which is usually not where I want them be.

Once I have edited all of my chromatograms I copy the .seq files into an empty directory. Open BioEdit from the start menu. Note that I have changed or set many menu short cuts (see BioEdit stuff to change after installation below) to make things quicker, thus these instructions are based on these changes. Create a new BioEdit file. To import .seq files exported from Chromas go File, Import, Sequence alignment file, browse to the correct directory, change file type to all, and select the files (.seq) exported from Chromas (in the open file box it often helps to change the view type to details, then click on type to group them all together). If you wish to keep them in the same order as they are in your directory then click on the bottom sequence file first, then click on the top one while holding the shift key. Make sure your mode is set to edit and insert. It helps if you edit the sequences to start from the same base prior to importing them, that way if you do multiple sequences they are already mostly aligned. And save frequently! There is no auto save function.

I usually import all the forwards and reverses into a new BioEdit file. I first group all the forwards together, then all the reverses. I manually align them and check for obvious missing bases and either correct them or add a gap to preserve the alignment. Before trying to merge the forwards and reverses together, reverse the first reverse sequence (Sequence, Nucleic Acid, Reverse Compliment or control-shift-r) and align it to your forward sequence (usually I have to delete a few bases). Once that is aligned, reverse it back to its original orientation and trim / add to all of the reverse sequence ends so that they are the same length as the first sequence (you can draw a box to select the bases at the end, then hit delete). Then reverse compliment all of them and they should be perfectly aligned relative to the forwards. (otherwise when you reverse compliment them they will all need to be realigned). Note that this works best with coding sequences without indels as every sequence is an identical length, it is all a bit trickier with different length sequences. In that case I try and get them close, but each individual one many require adjustment. Once I am happy with that I ready to create what will become the consensus sequences. I copy all the forwards to a new BioEdit file, select the sequence titles (Edit, Select All Sequences, control-shift-a) and copy them to clipboard (Edit, Copy Sequences, control-a), make the new BioEdit file active and paste them in (Edit, Paste Sequences, control-s). I copy the sequence titles to the clipboard (Edit, Copy sequence titles). I paste these into Microsoft Word and use search and replace to get rid of extra details. My sequence names look like this, PU26226.NVCann.1.Glu31. I trim off the sequence number (search for PU^#^#^#^#^#. and replace with nothing), change the primer name (search for .Glu31 and replace with .cons), that gives me NVCann.1.cons as the sequence name. Select them all (control-a), copy to clipboard (control-c), go back to BioEdit, to paste these names over the existing ones. Go Edit, Paste Over Titles. Now your BioEdit file has all the forwards and reverses, with the .cons sequences in another file. Now comes the painful part as you have to drag and/or cut and paste them all together such that you have the forward, then reverse, then consensus for each individual next to one another. It helps to also have additional individuals from the same population all next to one another too. To correct the consensus sequence I copy and paste the sequences from a population (or individual, group, etc.) to a new BioEdit file. Change the view type (on the lower toolbar (3rd) of the alignment window), select the third colored button from the left (says Shade identities and similarities when you hold the mouse over it). This highlights any columns that have different bases. Depending on how well your reverse sequences overlap with your forwards, scroll right until they overlap with good sequences. Select all the reverse sequences and cut them. This will allow you to see any base pairs that are different in the clean forwards. I check any unique differences by opening the chromatogram. Undo the cut of the reverses (Edit, Undo or control-z) (note that this only works if you haven t made any other edits, otherwise you have to paste them at the bottom and drag them back up to the correct place). Now scroll right again and look for any bases that need checking. Eventually the forwards will start to be a poor match to the reverses. At that point I finish my consensus sequence. I select a point in the reverse, then select sequence to the end (Edit, Select to End, control-e). Copy it (control-c). Now place the cursor in the same place in the consensus sequence. Hit control-e to select to the end, hit delete, move right one base then paste (control-c). Repeat for each consensus. Just be sure to select to end from a different location each time to reduce the chances of pasting the wrong reverse into your consensus. Now I select all the forward sequences and cut them and scroll right to check for any bases changes that need to be checked. Then I undo the cut, select all the sequences (Edit, Select All Sequences, control-shift-a), copy them (control-a--note that copy and pasting sequences is different to any other copy and paste action). Go back to your BioEdit file with all your sequences (which should still have the original sequences highlighted), paste the sequences (control-s), then delete the selected sequences (control-d), thus replacing the newly edited ones and removing the originals. Hit save (control-shift-s) and repeat for each group of sequences. At the end of this phase you have done two data checks, one when you edited your original chromatogram, second when you checked any unique base pair changes.

For each gene within a dataset I usually have this file with the forward, reverse and consensus. I then create a second file which has only the .cons sequences. The .cons sequences can then be trimmed to the target length and then they are ready to convert to the appropriate data file format for analysis. I always keep the BioEdit file with all forwards, reverses and consensus sequences so that if I double check stuff later it is easier to find the relevant chromatograms (I can tell what sequence is from where by the sequence name). I usually add more forwards and reverses to my existing BioEdit files since they are already setup and aligned correctly, otherwise you ll end up with many different, but similar versions of your files and it will be difficult to know which is the correct, most complete version.

All of that probably sounds very confusing, once you have carefully worked through it a couple of times it becomes very easy.

Importing data for phylogenetic analysis

In BioEdit, clean up all the ends and get things to the base pairs you want to analyze. It can be helpful to make sure any missing bases are labeled with an n, only use a - for indels so that you can easily distinguish which is which.

If I wished to create a MEGA files I would select all sequences (control-a), go Edit, copy sequences to clipboard (Fasta format). Open an existing MEGA file in Word. Remove the existing sequences (from the first sequence hit control-shift-end, then hit delete), then paste in the ones you just copied. Do a search for > and replace them with # (MEGA files require each sequence start with #). Note how many replacements it does, this is the number of samples. Enter that information in the header of the MEGA file. Figure out how many base pairs are present (in BioEdit, go to the last base and select it and look at the number). Enter that information in the header of the MEGA file. Save the file as text only and make sure it has the correct file extension (.meg). If the program sticks the .txt on the end manually change it in File Explorer.

Double click the MEGA file and MEGA will open the file and check and report any errors in the data file that are usually easily fixed either in MEGA s editor or in Word/BioEdit (make sure you correct it in the original dataset too, otherwise you ll get the same error next time you export your data). Then I run a NJ analysis to see what is going on with the dataset. I usually set Gaps / Missing data to pairwise deletion, otherwise it excludes all positions that have any ambiguous bases.

Chromas and BioEdit installation notes

When you first install BioEdit and Chromas, the default will be that BioEdit opens the chromatogram files. To fix this, right click on a chromatogram, select properties, it should say opens with BioEdit, hit change, browse to the Chromas executable, select it, choose always open with this program, hit ok. Now when you double click on a chromatogram it will open in Chromas.

BioEdit stuff to change after installation

BioEdit lets you modify just about anything that it does relative to menus and keyboard short cuts as well as the default settings for displaying data. Once you set your preferences on one machine you can copy the bioedit.ini file to any other machine to transfer them. You can download my bioedit.ini file here and save it to your BioEdit directory (rename your existing copy to something else in case you run into any problems). These are my preferences, you can use these or change them whatever you prefer. I hate menus, so anything that I can use the keyboard for I tend to change it. Much editing in BioEdit requires extensive repetitive actions, so using the menus will rather slow. To change settings first create a new alignment (File, New Alignment) or open an existing file. Next go View, Customize Menu Shortcuts. Select the value you wish to change, hit the value on the keyboard and that will reset it.

These are the changes I make.

Save, change to Control+Shift+s

Cut sequences, change to Control+Shift+c

Copy sequences, change to Control+a

Paste sequences, change to Control+s

Delete sequences, change to Control+d

Select all sequences, change to Control+Shift+a

Select to end sequences, change to Control+e

Select to beginning sequences, change to Control+b

Go to Options, Preferences

Under include (far left), select N, move it to don t include.

Go to Options, Color Table

I change all the ambiguous bases to yellow as that makes it much easier to see them.

On the lower toolbar (3rd) of the alignment window, select the first solidly colored button. This changes the way the sequences are displayed.

On the middle toolbar (2nd) in the alignment window change mode to edit, change box next to it to insert.

Go View, save options as default. If you don t hit this option then all of the changes are lost. Close BioEdit, reopen your files and the settings should all be saved.


Pogledajte video: 042 - Programski jezik C - Datoteke i rad sa datotekama (Februar 2023).